INTRODUCCIN

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.

RECOMENDACIONES GENERALES DE EMPLEO PARA LOS MEDIOS DE CULTIVO

Preparacin de los Medios de Cultivo Deshidratados Por regla general los ingredientes de los medios de cultivo se disuelven por agitacin y calentando ligeramente en agua destilada. Los medios que contienen agente gelificante se suelen hervir durante 1 minuto para conseguir su disolucin. Aunque en la mayor parte de los medios hay que calentar, hay que evitar sobrecalentamientos innecesarios. Algunos medios presentan turbidez inevitable o precipitados, por ejemplo la Base de Caldo Tetrationato. Al distribuir el medio debe hacerse de forma uniforme, para que el precipitado quede bien repartido. Posteriormente a la disolucin se procede a la esterilizacin del medio. En algunos casos existen componentes lbiles que no pueden aadirse en el medio de cultivo deshidratado y que ser necesario su esterilizacin por separado y una posterior incorporacin de forma asptica para obtener el medio completo. El pH de los medios de cultivo se ajusta durante su fabricacin a los valores descritos en cada uno de ellos. Sin embargo, la calidad del agua que se utiliza en su hidratacin, la utilizacin de medios no recientes etc. Pueden modificar este parmetro por lo que es aconsejable verificarlo y reajustarlo si fuera necesario. En algunos casos se puede ajustar el pH despus de la esterilizacin de forma asptica y utilizando soluciones cidas (Acido Clorhdrico) o bsicas (Sodio Hidrxido) estriles. En los medios slidos la medida se hace a 45-50C (el agar todava no ha gelificado) mientras que en los lquidos se hace a temperatura ambiente. Los medios cidos (pH<5) pueden presentar malas gelificaciones debido a la posible hidrlisis del Agar con la temperatura. Son medios que no es aconsejable refundirlos, y si es imprescindible, es aconsejable aadirles agar. El mtodo ms comnmente utilizado para la esterilizacin es el Autoclavado. Sin embargo, hay ingredientes en algunos medios que no mantienen sus propiedades si se someten a altas temperaturas. Esterilizacin En la etiqueta del producto se indican las condiciones de esterilizacin. De todas formas se describen unas pautas de carcter general. Autoclavado: Exposicin durante 15 minutos a 121C. Con este tratamiento mueren las clulas vegetativas y las endosporas bacterianas. Sin embargo, los medios que contienen hidratos de carbono, deben esterilizarse a

temperaturas no superiores a los 116-118C, para prevenir su descomposicin y la posible formacin de compuestos txicos que inhiban el crecimiento bacteriano. Filtracin: Es el medio ms habitual cuando existen productos lbiles. Habitualmente el producto a esterilizar se filtra a travs de una membrana de acetato de celulosa o nitrocelulosa de un poro de 0,22 m. Las soluciones de antibiticos, las de carbohidratos, las vitaminas, etc., se suelen esterilizar por este mtodo y aadir al medio de cultivo ya esterilizado, cuando ste est a temperatura no superior a los 45-50C. Tindalizacin: Exposicin a 100C durante 30 minutos. Con este tratamiento mueren las clulas vegetativas, pero no las endosporas. Cuando el medio esta fro, se incuba bajo condiciones de germinacin de las endosporas, y si ello ocurre, se repite el tratamiento trmico. Precauciones con algunos Ingredientes Algunos medios contienen productos txicos. Se deben tomar las medidas de seguridad necesarias al manipular estos productos. Algunos de estos compuestos son la Fucsina bsica y cida, la Pararrosanilina, la Azida Sdica, el Sodio Selenito, etc. Conservacin de los medios preparados Lo ms recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en muchos casos por razones obvias una parte del medio preparado se consume y el resto se guarda como medio preparado. El tiempo de vida del medio preparado depender de la propia naturaleza del medio, de la hermeticidad de los recipientes que lo contienen, de la temperatura de conservacin y de las condiciones medioambientales. Si la hermeticidad es buena y la temperatura baja, 2-8C, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6 semanas. De todas formas la refrigeracin favorece la deshidratacin y en algunos casos, como por ejemplo, los medios para anaerobios, la conservacin es mejor a temperatura ambiente que en frigorfico. Se deben evitar las condensaciones ya que el depsito de gotas de agua podr ser causa de una alteracin casi inmediata del medio. Tampoco deben emplearse medios preparados en los que se observe un efecto de deshidratacin. Conservacin de los medios deshidratados Como regla general y si no se establecen condiciones particulares los medios deshidratados deben almacenarse en lugar fresco, seco y al abrigo de luz directa del sol.

Existen unos medios en concreto, que requieren un almacenamiento entre 2-8C, que son: 414703 Selenito Verde Brillante, Caldo 414680 Marino, Agar 413824 Selenito, Base de Caldo 414698 Marino, Caldo 413809 Selenito y Cistina, Caldo 414722 Emulsin Yema de Huevo 414723 Emulsin Yema de Huevo-Telurito 414724 Potasio Telurito solucin 3,5% En la manipulacin de los frascos se debe procurar que las aperturas y cierres sean los menos posibles y que el tiempo durante el cual el frasco permanece abierto sea el mnimo. De lo contrario el medio se ir rehidratando, con lo que comenzar a compactarse y endurecerse, ya que son generalmente higroscpicos. Incluso podra llegar a tener lugar un crecimiento bacteriano en superficie. En estas condiciones debe desecharse el producto. Conservacin de los medios preparados listos para su uso. Los medios preparados listos para usar tienen un tiempo limitado de conservacin, que es de varios meses si las condiciones de almacenamiento y transporte son las adecuadas. Se recomienda su almacenamiento por regla general por debajo de los 20C y protegidos de la luz. Algunos medios deben conservarse entre 2-8C, siendo este requisito especificado en la etiqueta del producto. Los medios de cultivo con Agar no deben guardarse por debajo de 0C, ya que se alterara la estructura del gel. La prdida de agua puede provocar precipitados o hacer que cristalicen ciertas sustancias del medio de cultivo, as como originar grietas en las placas preparadas. En los medios de cultivo que deben mejorarse y que deben contener aditivos lbiles, se suministra el medio basal preparado y segn la necesidad se deben aadir los aditivos de forma estril. Destruccin y desinfeccin Una vez realizados los cultivos, el medio debe ser autoclavado a 121C durante 30 minutos antes de su desecho definitivo. De igual manera se debe proceder con el material de laboratorio empleado en los cultivos antes de su lavado y nuevo uso.

MEDIOS DE CULTIVOS

LOS MEDIOS DE CULTIVO SE CLASIFICAN BASNDOSE SEGN SU COMPOSICIN QUMICA Medios sintticos o qumicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas. Medios complejos o de composicin indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. Que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente hetertrofos exigentes). Ejemplo: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas. Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); Utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo crecern los que usen maltosa. Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-). F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas. Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

AGAR NUTRITIVO

Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso est descrito en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Frmula (en gramos por litro)

Pluripeptona Extracto de carne Cloruro de sodio Agar

Instrucciones
Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos.

5.0 3.0 8.0

15.0 pH final: 7.3-0.2

FUNDAMENTO
Es un medio usado para el cultivo de microorganismo poco exigente en los requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores de crecimiento microbiano. La Pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno para el crecimiento microbiano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes. CARACTERISTICAS DEL MEDIO: mbar claro a medio ligeramente opalescente.

AGAR EMB (Eosina Azul de Metileno).

Se emplea como medio diferencial para el aislamiento y diferenciacin de bacterias entricas Gram-negativas, de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Esterilizar en autoclave a no ms de 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45C y distribuir agitando suavemente.

Peptona Lactosa Sacarosa Fosfato dipotasico Agar Eosina Azul de metileno

10.0 5.0 5.0 2.0 13.5 0.4 0.065

pH final: 7.2 -0.2

Fundamento
Por la combinacin de estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se pueden distinguir algunos gneros. Las bacterias lactosa-negativas y sacarosa negativas (Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosapositivas dan colonias prpura-violetanegruzco con o sin un centro oscuro y quedan rodeadas de una zona incolora. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y sacarosa, ya aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno;

stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Tambin es posible la identificacin de Candida albicans. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un caracterstico brillo metlico.

Modo de empleo
Sembrar en la superficie del medio, Incubar entre 35 y 37C de 18 a 24 horas.

Resultados
Microorganismos Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Enterococcus faecalis Shigella flexneri Salmonella typhimurium Tipo de Colonia Verdosas con brillo metlico y centro negro azulado Mucosas, rosa prpura, confluentes Incoloras Incoloras, pequeas, puntiformes Incoloras Incoloras

Control de Calidad
Control fsico-qumico Aspecto: polvo fino. Solubilidad: opalescente con precipitado. Color: prpura rosado. pH: 7,2 0,2

Caractersticas del medio

Standard Plate Count (SPC)

Se utiliza para el examen microbiolgico de alimentos, agua y productos lcteos. Composicin Triptona Dextrosa Extracto de levadura Agar Concentracin del medio gr/litro 5.0 1.0 2.5 12.0 pH final: 7.2- 0.2