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    Preparación de Muestras

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    M.Eduviges Burrola
    El tema trata sobre la preparación de las muestras para poderlas observar en el microscopio óptico

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    Preparación de Muestras

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    M.Eduviges Burrola
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    El tema trata sobre la preparación de las muestras para poderlas observar en el microscopio óptico

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    4. Preparación de Muestras

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    OBSERVACIÓN

    DE LA
    MUESTRA
    Las células y los tejidos vivos carecen de
    componentes que absorben la luz y, por
    ende, son casi invisibles con un
    microscopio óptico.
    En todos los microscopios, la calidad de
    imagen depende de tres factores:
    El aumento es la amplificación de un objeto.

    El contraste es diferencia de la intensidad luminosa.

    Una buena resolución significa ser capaz de percibir dos puntos


    adyacentes de una imagen como separados uno del otro.
    Preparación de la muestra

    Aumentar la resolución

    Acentuar características morfológicas

    Conservar la muestra
    Preparación en Fresco
    Forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico.
    Preparación directa
    • Se utilizan para observar microorganismos
    vivos.

    • La forma más simple de preparar un


    microorganismo para un examen
    microscópico es hacer una preparación en
    fresco o “in vivo”.

    • Una preparación en fresco simple (entre


    porta y cubre) consiste en colocar una gota
    de líquido con los microorganismos,
    después colocar el portaobjetos y el
    cubreobjetos.

    • El inconveniente de la observación en fresco


    es que no permite aumentar el contraste de
    la preparación.
    Preparación directa
    • Se utilizan para observar microorganismos
    vivos.

    • La forma más simple de preparar un


    microorganismo para un examen
    microscópico es hacer una preparación en
    fresco o “in vivo”.

    • Una preparación en fresco simple (entre


    porta y cubre) consiste en colocar una gota
    de líquido con los microorganismos,
    después colocar el portaobjetos y el
    cubreobjetos.

    • El inconveniente de la observación en fresco


    es que no permite aumentar el contraste de
    la preparación.
    Frotis

    • En ocasiones, la concentración de células en una


    muestra puede ser muy elevada, o por su
    naturaleza encontrarse muy aglutinadas.

    • Para extenderlas sobre un portaobjetos y poderlas


    observar bien se preparan los frotis.

    • Para realizar un frotis, ya sea de sangre,


    suspensión celular, suspensión de cultivo
    bacteriano, etc.
    Frotis

    • En ocasiones, la concentración de células en una


    muestra puede ser muy elevada, o por su
    naturaleza encontrarse muy aglutinadas.

    • Para extenderlas sobre un portaobjetos y poderlas


    observar bien se preparan los frotis.

    • Para realizar un frotis, ya sea de sangre,


    suspensión celular, suspensión de cultivo
    bacteriano, etc.
    Debido a esto las muestras
    deben der ser fijadas y teñidas.
    Fijación
    Fijación
    • Método mediante el cual se procesan y fijan en su posición la estructuras internas y externas de la
    célula.
    • Provoca enlaces cruzados entre la mayoría de las proteínas y los ácidos nucleicos.
    • Produce el cese de la actividad biológica.
    • Promueve al tejido la consistencia óptima para su manipulación.
    • Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles
    a las que poseía en su estado vivo.
    • La fijación disminuye los cambios en los tejidos desde que se obtienen hasta que se observan,
    tanto en organización estructural como en composición química.
    • Es como hacer una fotografía de la muestra viva y poder observarla con el microscopio.
    Características del fijador ideal:
    • Capacidad para bloquear de inmediato la autolisis.
    • Efecto microbicida.
    • No provocar distorsiones en la arquitectura.
    • Inducción de cambios en la composición tisular que favorezca
    la inclusión, corte y coloración.
    Tipos de Fijación

    Por Calor Química

    • Preserva la morfología • Protege la


    general pero no las subestructura y la
    estructuras internas de morfología de la
    la muestra. muestra.
    Fijación por calor

    • Preserva la morfología general pero no las


    estructuras internas de la muestra.
    • No es frecuente en histología, puesto que
    produce deterioros de los tejidos.
    • Tiene un efecto en la coagulación de
    proteínas y disolución de lípidos.
    • Se emplea para la observación de
    microorganismos, sobre todo en
    bacteriología.
    Fijación química
    • Utilizan soluciones acuosas compuestas por
    moléculas fijadoras que establecen puentes entre
    las moléculas del tejido, manteniéndolas en sus
    lugares originales e impidiendo su degradación.
    • Método por inmersión.
    • La muestra (tejido 0.5 cm) se sumergen en la sustancia
    fijadora.
    • El volumen recomendado del fijador es de 10 a 20 veces
    superior al volumen de la muestra.
    Fijadores químicos

    •Fijan por deshidratación.

    Etanol, metanol, •Extraen los lípidos de los tejidos, pero no afectan a los
    carbohídratos.

    acetona •El metanol es mejor fijador que el etanol.


    •Son buenos fijadores de muestras de pequeño tamaño, y para
    preservar proteínas.

    •Es ampliamente usado por la buena perservación del tejido.


    •Actúa como conservante.
    •Se une a grupos funcionales de las proteínas formando grupo
    Formaldehído hemiacetales. Esta unión hace que muchas enzimas queden
    inactivas, lo que ayuda a evitar la degradación de los tejidos.
    •Preserva bien los lípidos.
    •No reacciona con los carbohídratos.

    •Es de los más usados.


    •Reacciona con los grupos amino de los aminoácidos de las
    Glutaraldehído proteínas, formando puentes entre las moléculas de los tejidos.
    •Tiene una alta capacidad de preservar la estructura celular.
    •Muy utilizado en microscopía electrónica.
    Inclusión
    Inclusión
    • Una vez fijado el tejido se tiene que procesar para su
    observación con el microscopio.
    • Esto implica hacer secciones o laminas para teñirlas
    primero y luego posteriormente observarlas.
    • Si bien con la fijación el tejido se endurece, este
    endurecimiento no es suficiente para generar
    laminas delgadas. Por lo que se necesita endurecer
    mas el tejido para obtener lamina más finas.
    • La inclusión es el método más común de endurecer
    el tejido y consiste en infiltrar la muestra con
    sustancias líquidas que tras un proceso de
    polimerización o enfriamiento se solidifican, sin
    afectar las características del tejido.
    • Para hacer laminas para su observación con el
    microscopio óptico el medio de inclusión más
    frecuente es la parafina.
    Proceso de inclusión
    • La Parafina:
    • Es una sustancia de aspecto ceroso que está formada de hidrocarburos
    saturados.
    • A temperatura ambiente es sólida y su punto de fusión va de 40 – 70 ºC.
    • No es miscible en agua

    • Ya que todos los tejidos están formados principalmente por agua y además, la
    mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica que para que la
    parafina líquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el
    agua por un solvente orgánico.

    • Esto se consigue mediante la deshidratación del tejido en alcoholes,


    normalmente es etanol, de gradación creciente hasta alcohol de 100º.

    • Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que es miscible tanto con el


    alcohol de 100 º como con la parafina, denominada sustancia aclarante o
    intermedia, como es el benceno, xileno o tolueno.

    • Subsecuentemente se pasa el tejido a recipiente que contiene la parafina líquida


    dentro de una estufa a 60 ºC.

    • Tras el embebimiento completo de la muestra se vierte parafina líquida en un


    molde, se introduce la muestra y se deja solidificar a temperatura ambiente.

    • ▶
    Corte
    Microtomo
    • Las características tisulares y celulares finas se
    observan con el microscopio.
    • Sin embargo, con el microscopio sólo se puede
    observar muestras de tejido que tenga un grosor
    muy pequeño, ya que de no ser así hay problemas de
    difusión de la luz.
    • Por tanto se tienen que hacer secciones o laminas de
    los tejidos que se quieren estudiar, las cuales pueden
    ir desde un grosor de unos cuantos nanómetros
    hasta micrómetros.
    • Los aparatos mecánicos para hacer las secciones o
    laminas de un grosor de micrómetros se denomina
    micrótomo.
    • El micrótomo de parafina se obtienen laminas de 5 a
    20 μm de grosor.
    Microtomo
    • Posee una cuchilla, un porta muestras y un sistema mecánico que permite
    acercar el bloque de parafina, con la muestra dentro, a la cuchilla, a una
    distancia que corresponde con el grosor de la sección que pretendemos
    obtener, y realizar el corte.
    • Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de parafina
    antes de hacer el primer corte útil, a esto se le conoce como retallado. ▶
    • Luego se realizan ya los cortes. ▶
    • Por ultimo se realiza el montado de las láminas. ▶
    Tinción
    Colorantes
    • Hacen más visible las estructuras internas y externas aumentando el contraste con el fondo.
    • Son sustancia coloreadas que son capaces de unirse de manera más o menos específica a
    estructuras del tejido o muestra.
    • La molécula de un colorante tiene dos componentes:
    • Cromogéno: que aporta el color, es quien absorbe la longitud de onda del espectro visible.
    • Auxocromo: que se une al tejido, puede ser grupo ionizable, un grupo que reacciona con iones metálicos
    (mordiente) o puede reaccionar covalentemente con la muestra.
    • Básicos: son catiónicos, tienen preferencia por sustancias ácidas como el DNA y/o RNA. Ej: safranina, azul de metileno,
    hematoxilina
    • Ácidos: Son aniones, y tiene apetencia por sustancias básicas, sobre todo por las proteínas. Ej: eosina, naranja G, fucsina
    ácida.
    Tinción
    hematoxilina-
    eosina

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