LAPORAN PRAKTIKUM PCR

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Di Indonesia, terutama pada mahasiswa biologi/bioteknologi kajian microbiology merupakan kajian wajib dalam bentuk mata kuliah bagi mahasiswa prodi biologi, kimia, biotechnology, farmasi, kedokteran, lingkungan, dan teknologi pangan. Kajian mikrobiologi di perguruan tinggi selalu disertai dengan pelaksanaan praktikum untuk membekali mahasiswa untuk menguasai softskill keterampilan kerja ilmiah. Mahasiswa dibekali dengan keterampilan menentukan masalah, mengembangkan hipotesis atau pertanyaan-pertanyaan, merancang percobaan, melakukan pengamatan untuk menjawab pertanyaan dan menarik kesimpulan. Selain softskill, keterampilan hands-on yang meliputi cara menggunakan alat, mengoperasikan peralatan atau instrument seperti di laboratorium genetika dan biologi molekuler wajib dibutuhkan untuk mahasiswa dalam melakukan sebuah praktikum maupun penelitian. Kemampuan atau keterampilan hands-on ini disebut juga dengan teknik laboratorium. Teknik labarotorium merupakan kiat-kiat mengenai seluk beluk laboratorium. Sebelum melakukan praktikum di dalam laboratorium diperlukan pengenalan mengenai beberapa pengetahuan pokok dan teknik-teknik laboratorium ini untuk mencegah timbulnya bahaya yang ditimbulkan oleh alat dan bahan 1 dalam laboratorium maupun kesalahan dalam penggunaan peralatan (Tim Kimia Dasar, 2012: 1). Agar seorang mahasiswa analisis mempunyai kemampuan cukup mengenai teknik analisis dengan menggunakan alat laboratorium atau dengan kata lain dapat melakukan teknik laboratorium dengan baik maka seorang analis harus mampu menguasai teknik penggunaan peralatan dasar laboratorium pengujian. Seorang analis harus dapat menguasai pengoperasian peralatan gelas, peralatan dasar pendukung, peralatan pemanas dan neraca untuk menimbang. Hampir semua pengujian mutu di laboratorium menggunakan peralatan dasar pengujian tersebut. Seorang analis yang telah menguasai teknik pengoperasian peralatan dasar akan dapat bekerja lebih professional. Teknik pengoperasian dan penanganan peralatan dasar laboratorium merupakan dasar kemampuan untuk dapat mengoperasikan peralatan canggih . Salah satunya seperti Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintetis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut. Prosesnya dilakukan dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu termosikler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukelotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada pada daerah sebelum daerah target disebut sebagai primer forward, dan yang berada setelah daerah target disebut 2 reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal dengan enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasa adenine), dCTP (sitosin), guanine, dGTP (guanin), dan dTTP (timin) 1.2 Tujuan Praktikum Berdasarkan latar belakang, tujuan yang ingin dicapai pada praktikum ini adalah :  Mahasiswa dapat mengetahui prinsip kerja PCR  Mahasiswa dapat memahami teknik dasar PCR  Mahasiswa dapat mengoperasionalkan alat thermocycler sesuai dengan SOP 1.3 Manfaat Praktikum Berdasarkan tujuan praktikum, manfaat yang ingin dicapai pada praktikum ini adalah :  Mengetahui prinsip kerja PCR  Mengetahui teknik dasar PCR  Mengetahui cara mengoperasionalkan alat thermocycler sesuai dengan SOP 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Polymerase Chain Reacton (PCR) Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan diketemukannya. Teknik PCR di samping juga teknikteknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular. Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templa DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat ; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus 4 terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahapan proses PCR dapat dilihat pada gambar 1. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier seperti tampak pada bagan di atas (Newton and Graham, 1994). Gambar 1. Reaksi PCR 5 PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu (Sambrook et al.,1989). Secara ringkas, prinsip PCR dapat dijelaskan sebagai berikut : pada suhu 94-950C, DNA mengalami denaturasi yang menyebabkan pemisahan untai ganda menjadi untai tunggal. Waktu yang diperlukan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 950C atau 15 detik pada suhu 970C. Apabila DNA target mengandung banyak nukleotida Guanin/Citosin (G/C), suhu denaturasi dapat ditingkatkan. Denaturasi yang tidak lengkap akan menyebabkan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mempengaruhi kerja enzim Taq polymerase. Hal ini sangat berpengaruh terhadap keberhasilan proses PCR. Umumnya sebelum proses siklus PCR dimulai sering sekali dilakukan pre denaturasi selama 3-5 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi (Promega, 2001). Suhu annealing dalam suatu tahapan PCR merupakan hal yang sangat penting untuk menghindari kesalahan penempelan primer. Primer yang baik berukuran 18-25 basa, mengandung 50-60% G + C dan memiliki suhu leleh (Tm) yang sama. Suhu annealing yang digunakan umumnya 50C di bawah Tm, dimana formula untuk menghitung Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T). PCR dapat digunakan sebagai alternatif metode konvensional untuk mendeteksi mikroba dalam pangan, air dan sampel lingkungan 6 karena waktu pengujian yang cepat dengan hasil yang lebih sensitif dan spesifik (Moganedi et al., 2007). Tahap pengujian dengan PCR umumnya terdiri dari isolasi DNA, denaturasi DNA menjadi untai tunggal, annealing primer sekuens spesifik dan penyambungan siklus polymerase 25 – 40. Hasil PCR adalah produk berupa 50-10000 bp bagian spesifik genome yang dapat dianalisis dengan elektroforesis gel atau sekuensing DNA (Mufty, 2008). 2.2 Thermocycler Gambar 2. Thermocycler Alat pengatur suhu reaksi yang biasanya digunakan pada teknik reaksi berantai polymerase. Prinsip umum kerja PCR adalah mengadakan potongan DNA tertentu dengan bantuan enzim. Nama lainya adalah ( Thermal Cycler ) 7 BAB III METODE PRAKTIKUM 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian Praktikum ini dilaksanakan di laboratorium FIKES Terpadu di Universitas Esa Unggul tepatnya di laboratorium biologi molekuler pada tanggal 9 Mei2019. 3.2 Alat dan Bahan Alat: 1. Thermocycler 2. Mikrotub (200 μL dan 1.5 μL) 3. Labu erlemeyer (250 ml) 4. mini spin 5. vortek mixer 3.3 Bahan: PCR master Mix Primer F PrimerR Sampel DNA Aquades (ddH2O) Prosedur Praktikum Pembuatan Reaksi PCR Komposisi mix PCR untuk volume total 20 μL PCR Master mix : 10 μL (setengah dari volume total) Primer F : 0.5μL Primer R : 0.5 μL DNA template : 1 μL ddH2O : 8 μL Siklus PCR yang digunakan 30x siklus : 95 0C Predenaturasi : 95 0C Denaturasi Annealing : 56 0C Axtension : 72 0C And Axtension : 72 0C Cooling : 4 0C 4 menit 1 menit 1,5 menit 1 menit 7 menit pause 8 Teknik Penggunaan Thermocycler (mesin PCR) Cara Kerja: 1. Sambungkan colokkan Master Cycler Personal dengan listrik (220 volt) melalui stravolt 2. Tekan tombol ON / OFF disisi belakang alat Akan tampil: Main – Menu I Start AAL I FILES --/25,10 I OPT 10 : 11 : 23 I Lid Incu 3. Gunakan tanda panah yang ada display alat 4. Untuk menulis program baru:  Arahkan kursor pada FILES, kemudian ENTER  Arahkan kursor pada NEW, kemudian ENTER  Arahkan kursor pada BLOK, kemudian SEL Catatan: jika memilih tube saja,maka kita set ukuran tube PCR-nya dan juga volumenya  Arahkan kursor pada Lid, ketik 105 0C  Arahkan kursor ke tepi kiri, kemudian tekan sel  Masukkan programnya dengan pilihan:  Jika temperatur : tekan SEL 1X, kemudian masukkan temperatur & waktunya 9  Jika menunggu : tekan SEL 2X, kemudian masukkan pada temperatur untuk menunggunya  Jika berhenti pada tahap : tekan SEL 3X, kemudian masukkan mulai pengulangannya dan berapa banyak pengulangannya  Example: Pengulangan dimulai no:2 sebanyak 30 pengulangan (Cycle). Maka kita masukkan GO TO 2 REP 29 Jika ingin berhubungan dengan program lain tekan SEL 6X, kemudian masukkan nama program yang sudah di save dialat  Kemudian tekan EXIT  Jika ingin menyimpan tekan ENTER  Tulis nama program, dengan cara memilih hurufnya dengan menekan SEL, kemudian pindah kursornya untuk setiap huruf yang diinginkan  Tekan ENTER 5. Untuk melihat program yang sudah ada: 10 a. Pindah kursor pada FILES, kemudian ENTER b. Pilih LOAD, kemudian ENTER 6. Pilih program yang diinginkan, kemudian ENTER 7. Untuk ’RUN’ Alat: a. Buka alat dengan memutar tombol kunci kearah kiri b. Masukkan Tube PCR yang telah berisi sampel kedalam alat dan tutup dengan cara memutar tombol kearah ukuran tube pcr yang digunakan c. Pilih START, kemudian ENTER d. Pilih program yang diinginkan kemudian ENTER e. Masukkan ukuran Tube PCR yang digunakan (Ex. 0,2 ml kemudian Enter) f. Masukkan volume yang digunakan (Ex. 25μl kemudian Enter) 8. Untuk mengetahui kapan selesainya RUN PCR, tekan Opt. 9. Untuk mengakhiri program tekan EXIT, kemudian buka penutup alat dan ambil tube PCR dari alat 10. Tutup kembali alat dengan memutar kearah kanan sampai tanda 11. Matikan Alat 11 BAB IV HASIL PRAKTIKUM DAN PEMBAHASAN Pada praktikum PCR, hal yang pertama dilakukan ialah pembuatan reaksi PCR atau tahap preparasi reagen PCR. Tahap Preparasi Reagen PCR Campuran reaksi dibuat dengan komposisi yang tertera pada prosedur kerja. PCR mix dicampurkan sesuai dengan jumlah reaksi yang dibutuhkan (6 perlakuan). Yaitu pada tube 1 template B, tube 2 template C, tube 3 template E, tube 4 template i, tube 5 template B, dan tube 6 sebagai kontrol positif (ddH2O) . Pada pembuatan PCR mix dimixing dengan tidak boleh adanya buih. Pada pembuatan PCR mix dibuat sebanyak 114 μL, langkah selanjutnya didistribusikan ke masing-masing tube sebanyak 19 μL ( 1 μL ada dna template) sehingga PCR mix pada masing tube sebanyak 20 μL. Pada pembuatan PCR mix tersebut, masing masing tube terdiri dari PCR master mix sebanyak 10 μL, Primer F sebanyak 0,5 μL, Primer R 0,5 μL, 1 μL DNA template dan 8 μL ddh2o. Pembuatannya pcr master mix dipipet sebanyak 114 μL, lalu ditambahkan dengan Primer F 3 μL lalu kemudian di vortex, kemudian Primer R 3 μL lalu kemudian di minispin, lalu kemudian ddh20 kemudian di Vortex dan minispin. Setelah itu distribusikan kedalam 6 tube lalu 12 ditambahkan DNA template yang diinginkan lalu di Vortex dan di minispin kembali. Komposisi mix PCR untuk volume total 20 μL PCR Master mix : 10 μL (setengah dari volume total) x 6 = 60 μL Primer F : 0.5μL x6 = 3 μL Primer R : 0.5 μL x 6= 3 μL DNA template : 1 μL ddH2O : 8 μL x 6= 48 μL Sehingga totalnya 114 μL yang kemudian didistribusikan ke 6 tube Setelah semua hal itu dilakukan akan dilakukan running pada PCR. Pada penggunaan PCR konvensional dapat dilihat pita - pita untuk mendeteksi apakah ada DNA yang kita inginkan untuk terdeteksi atau terekspresi. Primer Forward yang digunakan adalah 27F dan Primer Reverse adalah 1942R. Maksudnya ialah DNA akan terdeteksi jika primer menempel mulai dari panjang basa mulai 27 (forward) dan mulai dari panjang basa (reverse). Setelah proses amplifikasi DNA seharusnya dilakukan elektroforesis, tetapi pada saat praktikum kami tidak melakukannya. 13 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Pada praktikum kali ini yang dapat disimpulkan ialah : Pada dasarnya, prinsip PCR ada memperbanyak DNA/gen dengan bantuan sebuah enzim. Pada tahapan PCR, suhu sangat bermain pada metode ini, karena pada suhu tinggi dilakukan pada proses denaturasi, lalu diturunkan kembali untuk penempelan primer pada suhu 50-60 derajat Celcius, lalu pada saat pemanjangan DNA dinaikkan kembali sekitar 72 derajat Celcius. Alat yang digunakan pada metode PCR inilah yang dinamakan Thermocycler. 5.2 Saran Diharapkan dapat melihat hasil setelah melakukan running dan penggunaan alat thermocycler lebih spesifik lagi, karena pada saat praktikum tidak semua mahasiswa dapat melihat dengan jelas karena terlalu penuh yang melihat. 14 DAFTAR PUSTAKA Seprianto, Naroeni A. 2017. Penuntun Praktikum Instrumentasi Bioteknologi Tim Kimia Dasar Jurusan PMIPA-FKIP. 2012. Penuntun Praktikum Kimia Dasar Jurusan Pendidikan MIPA. Jember : Jember University Press. Moganedi KLM, Goyvaerts EMA, Venter SN, Sibara MM. 2007. Optimisation of the PCR-invAprimers for the detection of Salmonella in drinking and surface waters following pre-cultivation step. Water SA33, 196-202. Mufty MM. 2008. Application of a real time PCR methode for detection of Salmonella spp. in shrimp and scallop and its partial validation. Fisheries Training Programme. The United Nation University. Iceland. Newton, C.R. and A. Graham. 1994. PCR. UK: Bios Scientific Publisher. Promega. 2001. PCR Core System-Technical Buletin. Instruction for use of Products M7660 and M7665. Promega Corporation, Printed in USA. 15 LAMPIRAN Tahap Preparasi Reagen PCR 16 Proses pada saat ingin set-up untuk melakukan PCR 17