Bebida fermentada lactea

  OBTENCIÓN DE UNA BEBIDA FERMENTADA A PARTIR DE SUERO DE QUESO UTILIZANDO CÉLULAS INMOVILIZADAS DE KLUYVEROMYCES MARXIANUS Rocío Cóndor G.1, Víctor Meza C.2 y Fanny Ludeña U.3   RESUMEN El presente estudio tuvo como objetivo principal optimizar la tecnología de producción de una bebida fermentada de suero de queso, utilizando Kluyveromyces marxianus e inmovilización de células. En el biorreactor de lecho empacado, se obtuvo el mayor rendimiento (11,46±0,81 oGL) con un flujo de 140-150 mL. h-1, una biomasa inmovilizada de 10% (v/v), una relación de columna de 1:12 (diámetro: longitud), tamaño de perlas de 3 mm de diámetro, adición de metabisulfito de sodio (100 pg. mL-1) y células inmovilizadas con 2% (p/v) de alginato. Luego de optimizado todos los parámetros de fermentación en el biorreactor, la bebida alcohólica fue sometida a inactivación a 70 oC por 5 minutos (tratamiento térmico) y clarificación con tierra de diatomeas (11 kg. M-2). Finalmente, la bebida alcohólica fue evaluada en almacenamiento por 6 meses, durante este período se le hicieron evaluaciones fisicoquímicas, microbiológicas y sensoriales. Se determinó por Escala Hedónica y Ranking que la bebida alcohólica de suero tiene aceptabilidad. Palabras clave: Suero de queso, biorreactor, inmovilización, Kluyveromyces marxianus ABSTRACT This study has as its main objective the optimization of a technology for the production of a fermented beverage from cheese whey, using Kluyveromyces matxianus and cell immobilization. In a bed packed reactor, the best yield was obtained (11,46±0,81 'GQ with a flux of 140-150 mL.h-1, an immobilized biomass of 10% (v), a column rate of 1/12, a size of pearl of 3 mm of diameter, an addition of sodium metabisulphide (100 pg.mL-1) and immobilized cells with 2% (w/v) of alginate. After the fermentation parameters were optimized in the bioreactor, the alcoholic beverage was inactivated at 70 oC for 5 minutes (thermal treatment) and clarified with "tierra de diatomeas" (1 kg. M-2) . Finally, the alcoholic beverage was evaluated in storage for 6 months, during this period physicochemical, microbiological and sensorial tests were made. Hedonic Scale and Ranking tests showed that the alcoholic beverage had acceptability Key words: Cheese whey, bioreactor, immobilization, Kluyveromyces marxianus     INTRODUCCIÓN En el Perú, actualmente, en el campo de las industrias productoras de queso, se tiene un problema latente sin resolver, el cual se genera debido a la gran producción de suero compuesto que se desecha a través del alcantarillado municipal generando problemas de contaminación ambiental. Para tener una idea de la cantidad de suero que se produce sólo en la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM), se sabe que la Planta Piloto de Leche destina entre 270 a 750 litros de leche para la producción de quesos, por lo que se obtienen entre 235,17 a 653,25 litros de suero, diariamente. Alrededor de 45 kilos de leche cruda darán 4,5 kilos de Demanda Bioquímica de Oxígeno-DBO (Braile, 1993). Con el fin de controlar y reducir las descargas de desechos líquidos de las industrias productoras de queso, se podría mejorar el proceso de producción de la planta, tratar los desechos líquidos o aprovecharlos. En el presente trabajo, se buscó aprovechar el suero de que sería de la Planta Piloto de Leche de la UNALM, utilizando la tecnología de inmovilización de células para la producción de una bebida fermentada. Se establecen también los parámetros necesarios para que se pueda optimizar su producción. Resaltando la importancia de la Biotecnología en la optimización de procesos para el mejoramiento del aprovechamiento del suero. En la actualidad, el consumo de bebidas lácteas a partir de suero, está muy difundida por su valor nutritivo y menor costo (Kriel, 1980; Sabaa-Srur et al., 1995). Industrialmente el suero sirve como ingrediente en la elaboración del kefir (Garibay et al., 1993), kourniss (Garibay et al., 1993) y bebidas lácteas con frutas (Fresnel y Moore, 1978). Otra línea de producción creciente son las bebidas lácteas fermentadas con bacterias o mezclas de éstas con levaduras, las cuales generalmente se mezclan con jugos u hortalizas u otros saborizantes (Garibay et al., 1993). MATERIAL Y MÉTODOS El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología "Marino Tabusso" de la Facultad de Ciencias y en la Planta Piloto de Leche de la UNALM. Se trabajó con suero de queso fresco, Kluyveromyces marxianus (Kluyveromyces fragilis NRRL Y-2415) y alginato de sodio (SIGMA). INMOVILIZACIÓN DE KLUYVEROMYCES MARXIANUS La levadura fue repicada de un tubo que contenía la cepa madre a un medio de cultivo en placa; se incubó a 30oC durante 5 días. Después se tomaron 20 asadas y se llevó a 200 mL de suero acondicionado (pH 4,5 y desproteinizado), contenidos en un erlenmeyer de un litro. Se incubó a 30oC durante 10 horas. Para la recuperación de las levaduras, el cultivo se centrifugó a 5 000 rpm durante 10 minutos; las células sedimentadas fueron suspendidas y lavadas dos veces con una solución de peptona al 0,85% y se almacenaron a 4oC hasta su utilización. Para el proceso de inmovilización, se autoclavó 2,0 g de alginato de sodio con 30 mL de agua destilada; a esta mezcla se le agregó una suspensión de levaduras (se evaluaron diferentes concentraciones: 10, 20, 30% v/v) y finalmente, se completó con la cantidad de agua destilada necesaria para llegar a 100 mL (concentraciones final: 10, 20 ó 30% de blomasa). La mezcla se dejo caer sobre una solución de cloruro de calcio 0,lM y se dejó polimerizar durante 1 hora. Posteriormente se trasladó las perlas formadas a una solución de cloruro de calcio 0,05M y se refrigeró 24 horas. Finalmente se trasladó a una solución de cloruro, de calcio 0,025M donde se mantuvieron basta su uso en refrigeración (Marwaha et al., 1988). Antes de ser utilizadas, fueron lavadas con una solución salina para remover los iones de calcio que estuvieran en exceso (Chibata et al., 1987; Marwaha et al., 1988; Mc Ghee et al., 1982). Para conocer el número de células en cada perla, se dejó gotear 1 mL de la mezcla sobre agua. Luego se hizo el conteo de las células con la cámara de Neubauer, expresando resultados en número de células.mL-1 de gel. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE METABISULFITO DE SODIO SOBRE LA CINÉTICA DE FERMENTACIÓN CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE LEVADURA Se evaluaron tres concentraciones de levadura: 10, 20 y 30% (v/v); en sistemas sin metabisulfito y con 100 mg.mL-1 de metabisulfito. Se trabajó con 50 µL de sustrato (21o Brix) y 100 perlas con las diferentes concentraciones de células. Se incubó a 30oC por 7 días (Fresnel y Moore, 1978; Gawel y Kosikowski,1978; Yang et al., 1979), evaluándose la cinética de fermentación con la lectura de grados Brix y pH (Núñez y Lema, 1987). DETERMINACIÓN DEL FLUJO ÓPTIMO EN EL BIORREACTOR DE LECHO EMPACADO En una relación de columna diámetro: longitud de 1:12 (2,2:26,4 cm), se empacó 70% de su capacidad (3000 perlas); el contenido de biomasa de las perlas fue de 10% (v/v), lo que representó un rango de 5,3 x 10 8 a 1,2 x 10 9 células. mL-1 de gel. El suero acondicionado (pH 4,5 y 21oBrix) se colocó en el depósito superior del lecho. Se evaluaron 4 rangos de flujo: 50-60; 90-100; 140-150 y 240-250 mL. h-1 (Marwaha et al., 1988). Se trabajó todo el proceso de fermentación a 30 oC, evaluándose diariamente los grados Brix y el pH (Ough, 1996). Se determinó el flujo óptimo, mediante el rendimiento medido en grados alcohólicos al final de la fermentación. DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA ÓPTIMA PARA EL PROCESO FERMENTATIVO Determinado el flujo óptimo, se probó tres concentraciones de biomasa: 10, 20 y 30% (v/v), conteniendo un rango de 5,3 x 10 8 a 1,2 x 10 9 1,1 x 10 9 a 1,3 x 10 9 y 2,0 x 10 9 a 3,0 x l0 9 células. ML-1 de gel, respectivamente. Se empacó perlas hasta un 70% de la capacidad de la columna (1:12). Se evaluó diariamente la concentración de azúcares (oBrix) y el pH. El grado alcohólico se evaluó después de 7 días de fermentación. DETERMINACIÓN DE LA DIMENSIÓN ÓPTIMA DE LA COLUMNA Después de determinar el flujo y concentración de biomasa óptimos, se evaluó tres relaciones de columna 1:12; 1:15 y 1:17 (diámetro: longitud) que correspondían con las dimensiones de 2,2:26,4 cm; 2,2:33,0 cm y 2,2:37,4 cm, respectivamente. Se empacó perlas hasta un 70% de la capacidad de la dimensión de la columna. Se evaluó diariamente la fermentación con el control del grado Brix, pH y -después de 7 días- el grado alcohólico. INACTIVACIÓN Y CLARIFICACIÓN DE LA BEBIDA FERMENTADA La inactivación de la bebida fermentada se hizo a 70 oC durante 5 minutos (Cóndor et al., 2000). Para realizar la clarificación, se empleó tierra de diatomeas en una cantidad de 1 kg.m-2 (Molina, 1992). Se realizó la desinfección y clarificación por procedimientos descritos anteriormente (Cóndor et al., 2000). Finalmente, se agregó 50 µg.mL-1 de metabisulfito de sodio a la bebida, para su conservación. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Y MICROBIOLÓGICA DE LA BEBIDA FERMENTADA DE SUERO DE QUESO Evaluaciones fisicoquímicas: humedad (Pearson, 1976); cenizas (Amerine y Ough, 1976); pH (Amerine y Ough, 1976); acidez total, volátil y fija (Amerine y Ough, 1976); sólidos solubles totales (Amerine y Ough, 1976); azúcares totales y reductores (AOAC, 1995); sulfuroso total y libre (Amerine y Ough, 1976); grado alcohólico (Amerine y Ough, 1976); proteínas (AOAC, 1990). Se realizaron las siguientes evaluaciones microbiológicas: recuento de mesófilos aerobios viables; numeración de coliformes totales y recuento de mohos y levaduras. Se tomó como referencia la Norma Técnica Peruana 202.083 (1988). EVALUACIÓN SENSORIAL DE LA BEBIDA FERMENTADA La caracterización organoléptica se efectuó tomando en consideración la Norma ISO 4121-1987. La evaluación sensorial se llevó a cabo con 24 panelistas semientrenados (Laboratorio de Análisis Sensorial-Programa de Nutrición Humana, UNALM). Se determinó la aceptación del producto con dos métodos: Escala Hedónica no estructurada (Amerine, 1965; Pedrero y Pangborn, 1989) y el método de Ranking (Pedrero y Pangborn, 1989). Como referencia se utilizó tres vinos de características similares. Los resultados fueron evaluados estadísticamente (Pedrero y Pangbom, 1989). EVALUACIÓN ORGANOLÉPTICA DURANTE EL ALMACENAMIENTO La bebida alcohólica envasada en botellas de 400 mL de capacidad fue almacenada durante cinco meses bajo dos condiciones: temperatura ambiente (botella transparente y oscura) y en refrigeración (botella transparente). Durante este período se evaluaron la acidez total y el pH. RESULTADOS Y DISCUSIÓN EFECTO DEL METABISULFITO DE SODIO SOBRE LA CINÉTICA DE FERMENTACIÓN CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE LEVADURA Se determinó que la cinética de fermentación con células inmovilizadas (diferentes concentraciones de biomasa: 10, 20 y 30%), en sistemas sin y con adición de metabisulfito de sodio (100 µg.mL-1) es diferente. Se puede observar en la Fig. 1 que en sistemas sin adición de metabisulfito, existe una relación directa entre la biomasa inmovilizada y la cantidad de azúcares totales (oBrix) que se consume. La mayor disminución de azúcares, se obtiene con 30% (v/v) de levaduras inmovilizadas. Sin embargo, en sistemas con metabisulfito se produce una relación inversa; se obtuvo una mayor disminución de azúcares con 10% (v/v) de levaduras. Fig 1 Variación de la concentración de azúcar (°Brix) durante la fermentación con diferentes concentraciones de levadura, en sistemas sin y con adición de metabisulfito de sodio.   Los resultados demuestran que K. marxiauns se ve afectada por la adición del metabisulfito, y si a esto se suma la inmovilización de células, el efecto es mayor, debido a que la inmovilización limita la difusión de nutrientes. Además, las perlas están en un cultivo en lote sin ningún tipo de agitación, por eso tienen una menor transferencia de masa, lo cual se acentúa con el aumento de la concentración de biomasa inmovilizada. Por otro lado, se sabe que existe una relación física entre las perlas, las cuales se ven modificadas en superficie e interfase por la acumulación de CO2 (Mc Ghee et al., 1988). FLUJO ÓPTIMO PARA OBTENCIÓN DE LA BEBIDA FERMENTADA Se determinó que el mayor rendimiento (11,46 ± 0,81 oGL) para la producción de la bebida fermentada de suero se obtiene con un flujo de 140?150 mL.h-1 (ver Fig. 2). De manera similar, se ha reportado un flujo de 142 mL.h-1 como óptimo para la producción de alcohol a partir de suero en un biorreactor de lecho empacado (Marwaha et al., 1988). El valor obtenido puede deberse a que en estas condiciones la levadura K. marxianus logra una mejor transferencia de masa, transformando los azúcares presentes en el medio. Además, debe generarse la suficiente turbulencia como para permitir la remoción de catabolitos que pueden inhibir la actividad de las levaduras, en biorreactores con células inmovilizadas (Dale et al., 1994; Núñez y Lema, 1987; Parascandola et al., 1997). Al ser comparados los rendimientos entre células inmovilizadas y libres de K. marxianus, se observa un mayor rendimiento para las primeras, con valores de grado alcohólico de 11,46 ±0,81 y 9,83 ± 0,55 oGL, respectivamente. Se ha reportado que la mayor concentración de etanol se obtiene con células inmovilizadas que con células libres en fermentaciones con K marxianus IMB3 y sacarosa (Ferguson et al., 1998). Fig. 2 Valoración de la concentración de azúcar (°Brix) durante la fermentación con diferentes flujos de inmovilización   BIOMASA ÓPTIMA PARA LA OBTENCIÓN DE LA BEBIDA ALCOHÓLICA Se determinó que el mayor rendimiento 0 1,46 ± 0,81oGL) para ]a producción de ]a bebida fermentada de suero se obtiene con una biomasa de 10% (v/v) (ver Fig. 3), con respecto a las concentraciones de 20 y 30% respectivamente. Esto se debe a que las altas concentraciones de levaduras ocasionan una tasa de consumo de sustrato superior a la tasa de transferencia de producto al exterior de la perla, lo cual puede inhibir a las levaduras inmovilizadas. Se señala que una mayor concentración de levaduras inmovilizadas por unidad de gel en las perlas de alginato disminuye el coeficiente de difusión del sustrato y productos (Divies et al., 1994). Además, el sustrato, para ser utilizado por las células inmovilizadas y empacadas en una columna, tiene que pasar por varias barreras; primero atraviesa la interfase perla y medio líquido, luego habrá limitaciones disfusionales dentro de la perla y finalmente el sustrato atravesará la pared celular (Wiseman, 1991). Fig. 3 Variación de la concentración de azúcar (°Brix) durante la fermentación con diferentes concentraciones de levadura (%v/v)   Tabla 1. Evaluación fisoquímica de la bebida fermentada Análisis Bebida Alcohólica Humedad (%) 92,87 ± 0,84 Cenizas (g.l-1) 4,46 0,58 pH 3,8 0,90 Acidez total, expresada en g.l-1 ácido sulfúrico 3,25 0,05 Acidez volátil, expresada en g.l-1 ácido ascético 0,48 0,33 Acidez fijada (g.l-1 H2SO4) 2,62 0,35 Sólidos solubles (°Brix) 10,77 0,87 Azúcar total 5,50 0,10 Azúcar reductor 5,14 1,17 Sulfurosos total (mg.mL-1) 64,00 1,20 Sulfuroso libre (mg.mL-1) 16,00 2,40 Sulfuroso combinado (mg.mL-1) 48,00 1,40 Grado alcohólico (°GL) 11,47 0,81 Proteína (%) 0,10   El empleo de altas concentraciones de células entrampadas en alginato acorta el tiempo requerido para la producción del máximo rendimiento de alcohol; sin embargo, el porcentaje de células que sobreviven decrece con el aumento de la concentración inicial de células (Yousef et at., 1989). Las levaduras inmovilizadas se pueden ver afectadas en su rendimiento por efectos de la gran producción de CO2 por unidad de perla. La producción de CO2 es 2,5 veces mayor en células inmovilizadas en alginato que en células libres a 5 y 10% de etanol (Ciesarova et al., 1998). Con respecto a la adición de metabisulfito y diferentes concentraciones de levadura inmovilizada, se obtiene un perfil muy parecido de disminución de azúcares al obtenido en cultivos en lote. Una mayor disminución de azúcares totales con la menor concentración de biomasa, 10% (v/v). RELACIÓN ÓPTIMA DE LA COLUMNA PARA LA OBTENCIÓN DE LA BEBIDA ALCOHÓLICA Se determinó que el mayor rendimiento de grados alcohólicos (11,46 ± 0,81 oGL) en la producción de la bebida fermentada se obtiene con una relaci6n de columna de 1: 12 (ver Fig. 4). Esto podría deberse a que se generan dimensiones Intermedias que permiten una buena transferencia de masa y una eficiente liberación de CO2 Experimentos realizados con células inmovilizadas en alginato y en lecho empacado determinaron que las dimensiones del biorreactor afectan la productividad y eficiencia de la fermentación debido al CO2 y efectos de la transferencia de masa (Buzas et al., 1990; Yadav et al., 1996). Fig 4 Variación de la concentración de azúcar (°Brix) durante la fermentación con diferentes dimensiones de la columna. Por otro lado, la relación de columna 1:12 permite dimensiones que hacen que se mantengan condiciones equivalentes en cada parte de la columna, de tal manera que las perlas que están ubicadas en la base de la columna presentan igual conversión de azúcares que las perlas ubicadas en la parte superior. Probablemente, las otras relaciones de columna (1:15 y 1:17) no presentan condiciones similares a lo largo de la columna, pudiéndose afectar las perlas que están en la base de la columna, porque soportan una mayor presión física. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LA BEBIDA ALCOHÓLICA DE SUERO Los resultados se presentan en el Tabla 1. Los valores determinados están dentro de los rangos permitidos para bebidas alcohólicas similares (NTP, 1995; Ough, 1996; Peynaud, 1989; Asaba-Srur et al., 1995). CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA Después del almacenamiento de la bebida, se ha obtenido un recuento menor a 10 de mesófilos aerobios viables (UFC.mL-1); un recuento menor a 10 de mohos y levaduras (UFC.mL-1) y una numeración menor a 3,0 de coliformes totales (NMPmL-1). Esto indica que la bebida es microbiológicamente aceptable y que los métodos de inactivación y estabilización efectuados son los adecuados. COMPORTAMIENTO EN ALMACENAMIENTO Después de terminada la fermentación, se eliminaron las levaduras mediante clarificación con tierra de diatomeas (1 kg.m-1). Luego se evaluó el comportamiento en almacenamiento a temperatura ambiente y refrigeración, con pH iniciales de 3,4 y acidez total de 3,6 g/l H2SO4. Se tuvo en el primer mes un descenso en acidez total y un aumento del pH. Esta pérdida de acidez total inicial se puede deber a la precipitación de sales, proteínas y ciertos compuestos que son insolubles a bajas temperaturas, y pueden modificar las características microbiológicas y organolépticas de la bebida. Además, a bajas temperaturas se facilita la solubilidad de los gases disueltos (Peynaud, 1989). A partir del segundo mes, hasta los cinco meses que duró la evaluación, se observó un perfil variable del pH y acidez total. En general a temperatura ambiente (22 oC) y en refrigeración (4 oC) las características evaluadas de la bebida fermentada presentaron un comportamiento similar. Se obtuvieron valores finales a temperatura ambiente y refrigeración, pH 3,7 y 3,9 y acidez total de 3,2 y 3,3 g/l H2SO4, respectivamente. Luego, se evaluó la bebida fermentada en botellas transparentes y oscuras, y se determinó que éstas últimas mantienen sus características organolépticas. EVALUACIÓN SENSORIAL DE LA BEBIDA FERMENTADA La caracterización organoléptica realizada en un Laboratorio Certificado indica que la bebida alcohólica de suero tiene un olor y sabor característicos de un vino semiseco. La evaluación de aceptación realizada con la prueba de Ranking, concluyó que las tres muestras evaluadas comparadas con el control (bebida alcohólica de suero) son inferiores. Con Escala Hedónica, se evaluó el atributo olor, color y sabor, y se obtuvo 77 ±2,83; 59 ± 14,85 y 68,5 ±12,02% de aceptación, respectivamente, lo que indica solo discrepancia con el atributo color y sabor. CONCLUSIONES 1. En un sistema sin metabisulfito de sodio, la concentración óptima de células inmovilizadas es de 30% (v/v), y para un sistema con metabisulfito de sodio la concentración óptima es de 10% (v/v). 2. El mayor rendimiento (11,46 ± 0,81 oGL) en un biorreactor de lecho empacado se obtiene con las siguientes condiciones; un flujo de 140-150 mL.h-1, una biomasa inmovilizada de 10% (v/v), una relación de columna (diámetro: longitud) de 1:12, tamaño de perlas de 3 min, adición de metabisulfito de sodio (100 mg.mL-1) y células inmovilizadas con 2% (p/v) de alginato. 3. Optimizados los parámetros de producción de la bebida fermentada en un biorreactor de lecho empacado, se obtuvo una bebida con: 11,47 ± 0,81 oGL; 0,48 ± 0,33 g.1-1 de acidez, expresado en ácido acético; 64 ± 1,2 mg.mL-1 de sulfuroso total; 0,46 % de cenizas y 0,1% de proteínas en 7 días de fermentación. 4. La calidad microbiológica de la bebida fermentada es aceptable. 5. Las botellas oscuras permitieron mantener las características organolépticas de la bebida fermentada. 6. La evaluación sensorial de la bebida alcohólica, tanto por Escala Hedónica como por Ranking, demuestra que la bebida tiene aceptación. Ver referencias ____________________________________________ 1. Investigadora del Laboratorio de Microbiología "Marino Tabusso", Departamento de Biología, UNALM. 2. Profesor Auxiliar. Departamento de Biología, UNALM. 3. Profesora Asociada, Departamentos de Tecnología de Alimentos y planta piloto de Leche, UNALM