POP - identificação bioquímica

IDENTIFICAÇÃO
BIOQUÍMICA
Procedimento Operacional Padrão
Urocultura
O que é?
São métodos utilizados para
identificar espécies e grupos
bacterianos.
Técnicas de coloração;
Testes bioquímicos;
Prova bioquímica.
Condições de biossegurança
Usar jaleco limpo de uso

exclusivo neste
ambiente;
Luvas;
Óculos de proteção.
Técnicas de coloração
Coloração de Gram
Coloração de Gram - Procedimentos
Materiais: Reagentes: Equipamentos:

Alça de níquel cromo; Água; Microscópio óptico.
Cabo de Koller; Cristal violeta;
Lâminas para; Fucsina ou safranina;
microscópio óptico; Lugol;
Bico de Bunsen; Álcool - acetona.
Lápis marcador.
Coloração de Gram - descrição da técnica
Higiene Preparação do esfregaço da cultura
Desinfecção da bancada bacteriana em meio líquido:
com álcool 70%. Realizar a técnica em condições assépticas;
Transferir de duas a três alíquotas de
cultura bacteriana do meio líquido;
Espalhar as alíquotas sobre a lâmina com
movimentos circulares;
Secar o esfregaço em temperatura
ambiente;
Fixar o esfregaço na chama do bico de
bunsen.
Preparação do esfregaço da cultura
bacteriana em meio sólido
Realizar a técnica em condições assépticas
Coletar de duas a três colônias do meio de
cultura sólido;
Dissolver o inoculo numa gota de água na
lâmina de microscopia;
Secar o inoculo em temperatura ambiente;
Fixar o esfregaço na chama do bico de
bunsen.
Coloração de Gram
Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 60
segundos;
Lavar em água corrente;
Cobrir com lugol por 60 segundos;
Cobrir com álcool –cetona por 10
segundos;
Cobrir com fucsina ou safranina por 30 a 40
segundos;
Secar a lâmina em temperatura ambiente;
Observar em microscópio óptico;
Resultado coloração roxa ou violeta –
Bactérias Gram-positivas
Resultado coloração vermelha – Bactérias
Gram-negativas
Coloração de Gram - controle de qualidade
Duas cepas bacterianas: a Gram-positiva
deverá ser um Streptococcus pyogenes
ATCC - American Type Culture Collection -
nº 19.615;
Gram-negativa deverá ser a Escherichia coli
ATCC nº 25.922;
O controle da pureza das cepas bacterianas
deverá ser realizado a cada 2 meses.
Coloração de Gram - controle de qualidade
Etapas:
Repicar a cepa bacteriana a cada 15 dias,
em ágar nutriente (tubo com ágar
inclinado);
As cepas deverão ser repicadas em placas
(método do esgotamento por estrias) e
identificadas;
Após confirmação da pureza das cepas,
estas deverão voltar a ser estocadas em
tubos com ágar nutriente.
Teste bioquímico
Antibiograma
Antibiograma - Procedimentos
Materiais:
Placas de ágar Mueller Capela de fluxo laminar;
Hinton; Estufa bacteriológica, a temperatura de 35
Placas de ágar Mueller ± 2°C;
Hinton com 5% de Colorímetro com escala de turbidez de 0,5
sangue de carneiro; de McFarland;
Salina estéril a 0,45%; Swab estéril com ponta de algodão ou
Caldo de soja tríptica rayon;
(TSB);
Antibiograma - Procedimentos
Materiais:
Disco de papel filtro Jarra de microaerofilia
impregnado com para bactérias de
antimicrobiano na crescimento lento;
concentração Pinça anatômica estéril;
padronizada e fita Etest® Régua com graduação
com gradiente de em milímetros;
antibiótico; Tubos de ensaio (Khan)
12x75 mm estéreis.
Antibiograma - descrição da técnica
1 - Preparo do inoculo e seleção dos meios de cultura para o
teste de sensibilidade
Método de suspensão direta de colônias:
Usar apenas crescimento em ágar com 18 a 24h de
incubação, em um meio não seletivo, como ágar sangue;
Com auxílio de um swab coletar 3 a 5 colônias isoladas,
com as mesmas características morfológicas, e transferi-las
para uma solução salina a 0,45%;
1 - Preparo do inoculo e seleção dos meios de cultura para o teste de
sensibilidade
Método de suspensão direta de colônias:
Agitar até a homogeneização;
Ajustar a turbidez da solução p ara 0,5 de McFarland utilizando o
colorímetro do Vite k 2. Se necessário, adicionar salina quando
estiver muito turva ou acrescentando mais colônias quando a
turbidez estiver inferior à ideal;
O ajuste correto da turbidez do inoculo é essencial para assegurar
que o crescimento resultante seja uniforme.
1- Preparo do inoculo e seleção dos meios de cultura para o teste de
sensibilidade
Método do crescimento:
Com auxílio de um swab coletar 3 a 5 colônias isoladas, com as
mesmas características morfológicas, e transferi-las para um tubo de
ensaio contendo 4-5 ml de meio TSB;
Incubar a cultura a temperatura de 35 ± 2°C , ar ambiente, até
atingir ou ultrapassar a turbidez do padrão 0,5 da escala de
McFarland à leitura no colorímetro do Vitek 2 (normalmente, de 2 a 6
horas);
2 - Inoculação em placas:
Mergulhar um swab estéril no inoculo;
Remover o excesso de inoculo apertando e rodando firmemente o
swab contra a parede do tubo, acima do nível do líquido;
Esfregar o swab sobre toda a superfície do ágar por três vezes,
girando a placa num ângulo de 60º após cada aplicação,
finalizando com o contorno das bordas externas da superfície do ágar;
Deixar o inoculo secar por alguns minutos (máximo de 15 min) em
temperatura ambiente, com a tampa fechada ou com a tampa
semiaberta em cabine de fluxo laminar.
Indicação de uso do Método de suspensão direta de colônias:

Recomendado para testar organismos fastidiosos (Haemophilus spp.
e Neisseria spp .), estafilococos (detecção de resistência a meticilina
ou oxacilina) e estreptococos
Indicação de uso do Método do crescimento:

Pode ser utilizado como alternativa para realização do antibiograma
de Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter
ssp. isolados em placas de ágar com mais de 24 horas de
incubação.
Prova bioquímica
Coagulase
Coagulase - Procedimentos
Materiais:
Solução salina 0,9% NaCl; Alça calibrada ou agulha microbiológica;
Plasma de coelho Caneta marcadora ou giz de cera;
reconstituído e re- Bico de Bunsen;
hidratado; Descarte apropriado.
Micropipeta e ponteira;
Pipeta Pasteur;
Lâminas de vidro;
Cultura em ágar da
amostra biológica;
Equipamento:
O equipamento principal
a ser utilizado no teste é a
estufa bacteriológica de
35±2ºC, para o teste da
coagulase em tubo.
Tipo da amostra:
Cepas isoladas; Características
2-3 colônias isoladas em morfológicas de cocos
placa; Gram positivos, bem
Cultura de 18-24 horas como resultado de prova
de incubação; de catalase positivo.
Armazenamento da Armazenamento de
amostra: Reagentes e/ou Insumos:
Devem ser armazenadas O plasma deverá ser
no próprio meio de mantido congelado à
cultura que foram -20ºC e retirado uma
inoculadas, em geladeira; semana antes do uso,
Entre 2-10ºC até o sendo mantido em
término da realização dos temperatura próxima a
testes. 4ºC.
Coagulase - descrição da técnica
1 - Em lâmina:
Inicialmente deve-se separar duas lâminas limpas e desengorduradas;
Uma das lâminas deverá ser identificada como controle e a outra como
teste;
Na do controle será pipetada, com uma pipeta Pasteur, uma gota de
solução salina;
Na do teste será pipetada, também com uma pipeta Pasteur, uma gota
de plasma reconstituído e re-hidratado de coelho;
.
1 - Em lâmina:
Utilizando a alça calibrada, agulha ou palito de madeira, deverá coletar
células de uma colônia e misturá-las na solução salina e em seguida no
plasma;
Importante manter esta ordem para não carregar partículas de plasma
para a outra solução, prejudicando o controle;
Observar por 10 segundos a possível aglomeração.
1 - Em tubo:
Inicialmente deve-se identificar o tubo teste e pipetar, utilizando
uma micropipeta e ponteira, 0,5mL do plasma reconstituído re-
hidratado de coelho;
Deve-se então selecionar duas ou três colônias, coletá-las com o auxílio
de alça calibrada, agulha ou palito de madeira, e então
homogeneizá-las nos 0,5mL de plasma.
.
1 - Em tubo:
O tubo deverá então ser incubado em estufa de 35-37ºC por 4 horas.
Após esse tempo, observar a formação de coágulo;
Caso não haja a aparição de coágulo, pode-se voltar à incubação até o
período de 24 horas desde a preparação do teste;
Poderá então observar novamente a formação de coágulo.
.
Coagulase - controle de qualidade
Testar frequentemente os controles positivo
(S. aureus) e negativo (estafilococo não
produtor de coagulase), para verificar o
desempenho do plasma;
Além da observação do tubo de plasma não
diluído, verificando a não aglutinação
espontânea.
FIM
Anna Flávia de Almeida Canteruccio - 26239795

Bruna Scafuro Silva - 26283344
Janaina Rodrigues Souza - 26529271

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