Apostila de Microbiologia

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS
MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA (CBA106)
PROFas GLÓRIA BOTELHO/ SONIA PURIN DA CRUZ
Aluno (a): _____________________________________________
Curitibanos
2019/2
2 UFSC Curitibanos – Disciplina de Microbiologia Agrícola
SUMÁRIO
AULA 01 - Introdução ao laboratório de microbiologia: BOAS PRÁTICAS

DE LABORATÓRIO (BPL) em microbiologia ................................................ 3
AULA 02 - Métodos químicos de controle de crescimento microbiano e
meios de cultivo..................................................................................................... 12
AULA 03 - Isolamento, inoculação e repicagem de culturas microbianas ....... 17
AULA 04 - Estocagem e manutenção de microrganismos................................ 21
AULA 05 – Coloração diferencial (Teste de Gram).......................................... 24
AULA 06 – Morfologia de fungos........................................................................ 31
AULA 07 – Quantificação de microrganismos: Diluição seriada.................... 38
AULA 08 - Provas bioquímicas ........................................................................... 43
AULA 09 – Microbiologia do solo: Isolamento de rizóbios.............................. 52
AULA 10 - Microbiologia do solo: Caracterização de rizóbios........................ 55
AULA 11 – Microbiologia do solo: Inoculação de sementes............................ 58
AULA 12 – Microbiologia do solo: ciclo do carbono: respiração basal do
solo........................................................................................................................... 62
AULA 13 – Microbiologia do solo: Ectomicorrizas e fungos micorrízicos
arbusculares............................................................................................................ 66
AULA 14 – Microbiologia da água: Teste presuntivo ........................................ 73
AULA 15 – Microbiologia da água: Teste confirmativo e coliformes fecais .... 77
AULA 16 - Microbiologia de alimentos: Qualidade do leite ............................. 83
AULA 01
INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO (BPL) EM MICROBIOLOGIA
1. Regras de trabalho no Laboratório de Microbiologia.
Em um laboratório de microbiologia é imprescindível que algumas regras

básicas de comportamento sejam adotadas de modo a garantir o sucesso dos trabalhos
executados e a segurança das pessoas envolvidas:
a. Utilizar sempre o jaleco (guarda-pó).
b. Lavar as mãos antes e depois de cada trabalho executado.
c. Colocar blusas e materiais em locais apropriados para este fim e nunca sobre as mesas
do laboratório.
d. O laboratório deve ser um ambiente calmo.
e. Nunca executar qualquer tarefa com pressa.
f. No caso de acidentes comunicar imediatamente a pessoa responsável.
g. Limpar e desinfetar as bancadas no início e no final das aulas.
h. Ter cuidado com materiais que possam causar ferimentos na pele, como seringas,
pipetas de Pasteur, lâminas de aço e vidros em geral.
i. Preservar os materiais e equipamentos do laboratório.
j. Descartar os materiais utilizados nos locais apropriados.
k. Todo material utilizado deve ser devidamente identificado.
l. A alça de platina e estilete (agulha) utilizados na manipulação de microrganismos
devem ser esterilizados na chama (Bico de Bunsen ou lamparina) antes e depois de
utilizados. Colocá-los sempre na posição vertical no suporte e não sobre a bancada.
m. Antes de deixar o laboratório, ordenar todo o material usado colocando-os em seus
respectivos lugares, apagar as lamparinas, desligar o interruptor e a tomada dos
microscópios.
n. Não ingerir alimentos ou fumar no laboratório.
o. NUNCA pipetar com a boca qualquer que seja a natureza da solução.
1. Materiais e equipamentos básicos:

 Materiais: Tubos de cultura, placas de Petri, alça de Drigalski, alça de platina, tubos
de Durham, balões volumétricos, pipetas graduadas, pipetas de Pasteur, frascos de
Erlenmeyer, béquer, provetas, lâminas, lamínulas, estilete.
Tubos de cultura Placa de Petri Tubos de Durham
Figura 1. Vidrarias utilizadas no Laboratório de Microbiologia

Alça de platina Alça de Drigalski
Figura 2. Materiais usados para inoculação e repicagem de culturas microbianas.
 Equipamentos: Autoclave, microscópio, microscópio estereoscópio (lupa),

incubadora (estufa de cultura), câmara de fluxo laminar, balança semi-analítica,
balança analítica, estufa esterilizadora, contadores de colônia.
Autoclave Câmara de fluxo laminar Contador de colônias
Figura 3. Equipamentos utilizados para trabalhos no Laboratório de Microbiologia.
MÉTODOS DE CONTROLE DE CRESCIMENTO MICROBIANO
A grande capacidade dos microrganismos de multiplicação e utilização de nutrientes

exige seu controle, com o objetivo de prevenir a transmissão de doenças, evitar a
decomposição de alimentos e evitar a contaminação da água e do ambiente.
Alguns termos são utilizados para o controle do crescimento microbiano:

• Esterilização – destruição de todas as formas de vida microbiana (formas
vegetativas e esporuladas)
• Desinfecção – destruição de formas vegetativas dos microrganismos, em
especial de patógenos.
• Antissepsia - destruição de formas vegetativas dos microrganismos, em tecido
vivo.
• Assepsia – ausência de contaminação significativa.
Ainda quanto à terminologia, lembramos que:

O sufixo – cida significa tratamento que causa a morte direta de microrganismos.

Ex: bactericidas.
O sufixo – stático ou stase significa parar ou diminuir o crescimento de
microrganismos. Ex: bacteriostático.
Qual a ação dos agentes microbianos sobre as estruturas celulares?

• alteração na permeabilidade da membrana plasmática – quebra dos lipídios ou
proteínas.
• degradação de proteínas e ácidos nucléicos.
O controle de crescimento de microrganismos é possível pela ação de agentes

físicos e químicos com propriedades de destruir a célula microbiana ou de impedir sua
reprodução.
Métodos físicos
• Temperatura (calor e baixa temperatura)

• Filtração
• Radiação
Métodos químicos
• Agentes químicos
1. MÉTODOS FÍSICOS
1.1. Temperatura - Calor
A resistência varia com o microrganismo e suas formas.
Microrganismos/formas Temperatura
Formas vegetativas – procariotos 60-70C
Esporos bacterianos >100C

Formas vegetativas de fungos 50-60C
Esporos de fungos 60-70C
1.1.1. Calor úmido

Sua ação é desnaturação de proteínas e enzimas.
Características:
• Maior penetração
• Menor tempo de exposição
Tipos de esterilização:
• Fervura – elimina formas vegetativas de bactérias, vírus e fungos.
• Autoclavação – temperatura elevadas obtidas por vapor sob pressão.
Autoclave
Procedimento para o uso correto da autoclave:

a) Verificar a presença de água no interior do aparelho e, se necessário, adicionar. A
água deve ser adicionada até que seu nível esteja em torno de 5-10 cm acima da
resistência.
b) Dispor os objetos condicionados a esterilizar dentro do cesto metálico.
c) Fechar a tampa.
d) Deixar aberta a válvula de escape de gases, senão a autoclave pode explodir.
e) Ligar o aquecimento.
f) Quando a água está quente, o vapor expulsa progressivamente o ar, que sai pela
válvula de escape.
g) Após 4 a 5 minutos todo o ar foi expulso, fecha-se então a válvula de escape de gases
para permitir o aumento da pressão.
h) A temperatura e a pressão sobem, observar o manômetro (pressão).
i) Quando a temperatura atingir 120oC controlar para que esta permaneça estável
durante 20 minutos, mudando o controle de temperatura para “médio”.
j) Desligar o aparelho, deixar esfriar.
k) Abrir a autoclave apenas quando não houver mais pressão interna residual.
ATENÇÃO: Abrir a autoclave sob pressão (acima de 100oC) o vapor pode queimar o
operador. Mesmo estando a temperatura acima de 100oC o líquido não evapora, quando
sob pressão. Se a tampa for aberta prematuramente ocorre uma violenta descompressão
que pode projetar tampões de algodão e líquido para cima. Cuidado!
Objetos que podem ser esterilizados:

a) Todos os líquidos que não são frágeis.
b) Água destilada.
c) Meios de cultura pouco sensíveis.
d) Soluções nutritivas.
e) Objetos de borracha.
OBS: Na indústria a autoclave é utilizada para esterilizar certas conservas alimentares

(ervilhas, sardinha em óleos, etc...).
 Pasteurização
A pasteurização não pode ser considerada como um método de esterilização. É aplicada
em certos produtos naturais que desejamos conservar momentaneamente: o leite, a
cerveja, o vinho. O leite, por exemplo, é levado a 63oC por 30 min (método de baixa
temperatura) ou a 72oC por 15 segundos (método de alta temperatura). O leite passa
entre placas quentes em finas camadas, sendo em seguida, bruscamente resfriado até
10oC. A pasteurização deve garantir a inativação dos patógenos mais resistentes, tais
como Mycobacterium tuberculosis e Coxiella burnetii.
Tipos:
Ultra High Temperature (UHT)  141C/2seg.
High Temperature, Short Time (HTST)  72C/15seg
Low Temperature (LTH)  63C/30min
1.1.2. Calor seco

Ação: Processo de oxidação
Esterilização por ar quente – Temperatura de 170C por 2h (ex: estufas)

Uso para materiais que não podem ser autoclavados (ex: Óleos, pós), vidraria como
Placas de Petri, tubos de ensaio, pipetas em geral, Erlenmeyer, objetos metálicos.
Características: Menor penetração, uso de temperatura e tempos maiores
Ex: Forno de Pasteur

Procedimento simples e prático utilizado para esterilizar todo material sólido e
muito resistente ao calor. A esterilização ocorre por queima da matéria orgânica dos
microorganismos pelo calor seco e deve ser conduzida por 1 hora a 180oC.
Funcionamento do forno de Pasteur:

a) Dispor no forno os objetos a esterilizar, acondicionados em papel pardo ou
jornal.
b) Colocar o termômetro.
c) Ligar o aquecimento.
d) Deixar subir a temperatura até 140oC.
e) Reduzir a intensidade do aquecimento de forma a estabilizar em 170-180oC.
f) Desligar.
g) Deixar esfriar antes de retirar o material.
Outros métodos:
a. Flambagem – esterilização à chama direta - alça de níquel-cromo.
b. Incineração – queima de materiais.
Curiosidade: Uso de controle do crescimento microbiano no solo.
Solarização - é a colocação de filme plástico transparente sobre o solo umedecido para

aumentar a temperatura e controlar patógenos do solo, pragas e plantas daninhas. A
técnica é indicada para a recuperação de áreas cultivadas intensamente e, também, em
casas de vegetação para a desinfestação de substratos para produção de mudas.
As temperaturas alcançadas são letais a muitos fitopatógenos, sendo maiores nas
camadas mais superficiais (49-54C a 10 cm de profundidade); nas camadas mais
profundas prevalecem temperaturas sub-letais (35-42C) que alteram as populações
microbianas do solo, podendo favorecer o crescimento de populações de antagonistas,
mais tolerantes ao calor que os fitopatógenos.
Figura 4. Uso de plástico para a prática de solarização.

Fonte: http://www.infobibos.com/Artigos/2008_1/Solarizacao/Index.htm
Filtração
Faz-se passar o liquido através de filtros cujos poros têm uma dimensão tal que os
microorganismos não passam. Portanto, basta recolher o líquido filtrado assepticamente
para obter um líquido estéril, sem aquecimento. É o melhor procedimento para
esterilização de substâncias termolábeis tais como proteínas (enzimas), vitaminas. Os
filtros podem ser de vidro poroso, de amianto, de diatomatáceas ou de acetato de
celulose. O diâmetro de poro comumente utilizado no laboratório de Microbiologia é de
0,2μm. Observação: os vírus passam por estes filtros.
Figura 5. Procedimento de esterilização por filtração.
• HEPA – (High Efficiency Particulate Air) – filtro de partículas de ar de alta

eficiência (Membranas de acetato de celulose).
Figura 6. Processo de esterilização do ar com filtro de partículas de ar de alta eficiência em câmara de

fluxo laminar.
2. Radiação
Radiações que controlam microrganismos podem ser:
c. Ionizantes (raios X e gama)
Comprimento de onda mais curto (menor que 1m) e mais energia.
d. Não-ionizantes (UV)
Comprimento de onda maior que 1m.
Espectro de energia radiante
m
E
m
Figura 7. Espectro de radiações.
4. QUESTÕES A SEREM RESPONDIDAS
1. Completar o quadro abaixo com as vidrarias e instrumentos apresentados e seus

respectivos usos.
Vidraria/instrumento Finalidade de uso
7
10
11
12
13
14
15
2. Descreva dois exemplos de técnicas de esterilização e sua aplicação na

Agronomia.
3. Descreva dois exemplos de técnicas de desinfecção e sua aplicação na

Agronomia.
4. Cite e explique o princípio de funcionamento de dois equipamentos utilizados

no laboratório de microbiologia.
5. Como Agrônomo(a), imagine que você precisa preparar 1000mL de solução de

álcool 70% para conservar insetos. Cite duas vidrarias que você pode usar para medir e
preparar este volume com precisão e cite duas que não podem ser usadas para este fim.
6. Cite três finalidades de uso da autoclave em um Laboratório de Microbiologia.

AULA 02
MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE DE CRESCIMENTO
MICROBIANO E MEIOS DE CULTIVO
1. INTRODUÇÃO
1.1. Meios de Cultivo.
Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de
substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de
microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em vista a ampla diversidade
metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura para
satisfazerem as variadas exigências nutricionais. Além dos nutrientes é preciso fornecer
condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como
pH, pressão osmótica, umidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, micro-aerofílica ou
anaeróbia), dentre outras.
Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em:

a) Sólidos, quando contém agentes solidificantes em cerca de 1 a 2,0 %.
b) Semi-sólidos, quando a quantidade de ágar e ou gelatina é de 0,075 a 0,5 %,
dando uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de
microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e
também para conservação de culturas.
c) Líquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo,
utilizados para ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas,
dentre outros.
Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos

constituintes em:
a) Complexos, quando usam ingredientes com composição química não
definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona
de soja, etc.) de animais (carne, cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos
(levedura)
b) Quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados
para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências
nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, nitrogênio, vitaminas, energia,
sais minerais, dentre outros, quando então são conhecidas as necessidades nutricionais
específicas.
Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos) ou complexos.
Outras classificações dividem os meios de cultura em:

a) Básicos: são aqueles que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer
nenhuma exigência em especial (Ex. BDA, caldo e ágar simples).
b) Seletivos: os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de
determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo:
meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae), ágar
Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante
para isolamento seletivo de Salmonella, meios com 7,5% de cloreto de sódio, meio
Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibióticos para
isolamento de diversos microrganismos (meio Luria-Bertani).
c) Diferenciais: quando contém substâncias que permitem estabelecer diferenças
entre microrganismos muito parecidos, tais como meio o Ágar MacConkey para a
diferenciação de enterobactérias e o Ágar sangue para verificar hemólise por espécies de

Streptococcus e Staphylococcus.
1.2. Métodos de Controle Químicos

Complementando a aula anterior, será abordada a ação dos métodos químicos no
controle do crescimento microbiano. Os agentes químicos são denominados
desinfetantes e antissépticos.
Desinfecção é o processo que elimina todos os microrganismos com exceção dos
endósporos bacterianos. Os agentes desinfetantes podem ser:
• Biocidas - eliminam microrganismos presentes.
• Biostáticos - inibem as atividades metabólicas dos microrganismos.
Desinfetantes são agentes químicos capazes de destruir os microrganismos em

meios como a água, o ar, o solo e os objetos e materiais. Este termo é utilizado
principalmente para tratamentos realizados em objetos inanimados que podem ser
tratados com formulações altamente concentradas com elevado tempo de contato. Os
materiais ou locais submetidos à ação destas formulações são ditos desinfetados. A
desinfecção é uma operação cujos resultados são momentâneos, permitindo a
eliminação e inativação de microrganismos indesejáveis.
Métodos de desinfecção:
O desinfetante ideal deve possuir uma série de qualidades:
a) Não ser tóxico para o hospedeiro.
b) Ter poder de penetração.
c) Ser solúvel.
d) Ser estável.
e) Não ser corrosivo nem gerar cores, odores ou aspecto indesejado.
O mais importante é que o desinfetante tenha um largo espectro antimicrobiano
(ou seja, afete bactérias Gram positivas, Gram negativas e micobactérias) assim como
ação fungicida, viricida e esporicida.Porém, este produto "ideal" ainda não existe.
Utilização de agentes químicos:
 Detergente: É indicado para desinfecção de baixo nível. Indicado para

superfícies e equipamentos, limpeza de materiais em geral e antissepsia das mãos. Ao
ser aplicado, precisa de fricção sobre a superfície, conforme indicação do fabricante.
 Água sanitária: É indicada para desinfecção de médio nível de artigos ou

superfícies, não usar em metais e mármores, devido à ação corrosiva.
 Álcool: É indicado para desinfecção de alto nível. É usado na antissepsia

complementar das mãos, após o uso do detergente. Utilizar em vidros, equipamentos
metálicos, mesas e bancadas. Não usar em acrílicos, borrachas e tubos plásticos.
Exemplo na Agronomia: Desinfecção das salas de granjas de suínos após a saída
dos animais, especialmente nas salas de maternidade, para eliminação de patógenos.
2. OBJETIVO
2.1. Apresentar os principais tipos de meio de cultivo utilizados em
Microbiologia.
2.2. Avaliar o efeito de agentes desinfetantes sobre o crescimento microbiano.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Preparação de placas com meio de cultivo

Distribuir o meio de cultura em placas de Petri (90x 15mm) estéreis (cerca de
15 a 20 ml por cada placa). O procedimento de distribuição do meio de cultura deve ser
realizado em condições assépticas e em placas de Petri previamente esterilizadas.
3.2. Esterilização de placas de Petri

 Organizar três conjuntos de placas de Petri com a tampa colocada sobre o fundo
(não abaixo dele).
 Sobrepor as placas de forma a construir uma pequena pilha.
 Embrulhar as placas com uma folha de jornal, utilizando fita adesiva para fechar.
 Colocar um pequeno pedaço de fita indicadora de esterilização.
 Esterilizar em autoclave a 121°C por 20 minutos.
 Retirar da autoclave e deixar secar em uma estufa 50-60ºC. Após secas, as
placas poderão ser levadas à câmara de fluxo e utilizadas. O jornal deverá ser removido
apenas dentro da câmara de fluxo.
3.3. Avaliação do efeito da desinfecção

 Selecionar duas placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata Dextrose
Agar) por grupo.
 Dividir a placa de Petri em três partes iguais, delimitando cada parte com caneta.
Na primeira, escrever “Sem tratamento”. Na segunda, escrever “Álcool”. Na terceira,
escrever “Sabonete”.
 Selecionar dois alunos de cada grupo para tocarem em alguma superfície do
laboratório ou dependências externas. Cada aluno repetirá os procedimentos 4-8
utilizando uma placa.
 Após a superfície ser escolhida, tocá-la com três dedos (médio indicador, e
polegar), esfregando bem.
 Tocar levemente o meio de cultura da parte da placa marcada como “Sem
tratamento” com o dedo médio.
 Lavar o dedo indicador com álcool. Tocar levemente o meio de cultura da parte
da placa marcada como “Álcool”.
 Lavar o dedo polegar com sabonete. Tocar levemente o meio de cultura da parte
da placa marcada como “Sabonete ”.
 Incubar a placa de Petri a 28ºC por 48 horas, na posição invertida. Na próxima
aula, observaremos o efeito de cada agente desinfetante sobre o crescimento bacteriano
quando comparados à ausência de desinfecção nos dedos. Estes dados serão observados
e utilizados para elaborar a seção de “resultados e discussão”. Nela, discorrer sobre o
possível uso de outros agentes desinfetantes além dos dois testados.
4. RESULTADOS E QUESTÕES A SEREM RESPONDIDAS.
4.1. Em um meio de cultivo como BDA, qual a função de cada um de seus

componentes – batata, dextrose e ágar?
4.2. Classifique o meio de cultivo preparado em relação a estado físico e

procedência dos constituintes.
4.3. Por que existe a necessidade de se autoclavar o meio de cultura, após ser
preparado? O que aconteceria caso isso não fosse feito?
4.4. Faça uma pesquisa bibliográfica a respeito de tipos de meio de cultura

utilizados para cultivar microrganismos de interesse para a Agronomia. Cite dois deles,
incluindo as espécies de microrganismos cujo cultivo ao qual eles são indicados.
Classifique-os em relação ao estado físico e à procedência dos constituintes.
4.5. Em relação ao efeito de desinfetantes, apresente a quantidade de colônias

observadas em cada um dos tratamentos.
Placa 1 Placa 2
Fungos Bactérias Fungos Bactérias
Sem tratamento
Água sanitária
Álcool
4.6. Calcule a eficiência de desinfecção para cada agente testado sobre o número
de fungos e bactérias em cada placa (os cálculos devem ser apresentados).
4.7. Contraste as características das colônias de bactérias e fungos.
REFERÊNCIAS
MADIGAN, Michael. T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de
Brock. 10. ed. São Paulo, SP: Prentice Hall, 2004.
NOGUEIRA, Alexandre Verzani; SILVA FILHO, Germano Nunes. Microbiologia.
Florianópolis: Biologia/EaD/UFSC, 2010.
SILVA FILHO, Germano Nunes; OLIVEIRA, Veturia Lopes de. Microbiologia:
manual de aulas práticas. 2. ed. rev. Florianópolis: Editora da UFSC, 2007.
AULA 03
ISOLAMENTO, INOCULAÇÃO E REPICAGEM DE CULTURAS
MICROBIANAS.
1. INTRODUÇÃO
Para estudar as propriedades de um microrganismo e proceder a sua identificação,
é necessário isolá-lo em cultura pura (axênica), ou seja, uma cultura isenta de todos os
demais tipos de organismos, onde todas as células na população sejam idênticas
(originárias de uma mesma célula parental).
Para o isolamento de microrganismo é necessária uma sequência de
transferências de meios de cultivo até obter cultura pura. Essa transferência é
denominada repicagem e poderá ser feita para tubos, ou outros recipientes contendo
meio líquido ou sólido em função dos objetivos do trabalho.
A porção da colônia que será transferida chama-se inóculo e a operação deverá
ser feita com todos os cuidados de assepsia, a fim de evitar contaminações, garantindo,
assim, a qualidade do trabalho.
O isolamento consiste na obtenção de culturas puras que envolvem somente o
organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleção de uma colônia através
da observação da produção de determinado produto ou da morfologia da colônia. Nas
placas que utilizamos, entretanto, não temos certeza de que apenas uma espécie de
microrganismo existe em cada UFC (Unidade Formadora de Colônia). Portanto,
precisamos utilizar a técnica de semeadura por estrias para isolar completamente apenas
um microrganismo. Essa técnica também é chamada de esgotamento de alça.
Além dessa técnica, é necessária a transferência sucessiva desses microrganismos
para meios de cultura até a completa purificação. Essas transferências sucessivas são
chamadas repicagem. Mesmo após a obtenção de cultura pura (axênica), esta precisa
ser mantida em meio adequado ou, dependendo da finalidade, multiplicada para a
obtenção de maior quantidade de células ou de biomassa. Em qualquer dos casos, o
microrganismo precisa ser transferido periodicamente para meio de cultura novo, de
mesma composição ou de composição diferente, dependendo do trabalho a ser
executado.
2. OBJETIVO
Estabelecer cultura pura de uma colônia de bactérias e de fungos isoladas das
placas obtidas na última aula.
Placas de Petri contendo meio BDA e Sabouraud
Alça de níquel-cromo
Lamparina
Álcool 70%
Procedimento:
 Isolamento bacteriano
Flambar uma alça de níquel-cromo em chama de lamparina.
Tocar a superfície de uma colônia.
Espalhar a alça sobre uma segunda placa de Petri contendo meio LB, fazendo
movimentos em zigue-zague e formando um caminho na forma de estrias. Existem
várias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontínua ou contínua.
Na forma contínua com estrias simples, haveria primeiramente a coleta de uma

pequena quantidade de células bacterianas e as estrias seriam iniciadas em uma das
bordas da placa, percorrendo a alça até a outra borda da placa.
Na forma contínua com estrias compostas em duplicata, a alça percorre somente
de uma borda até o centro da placa. Do lado oposto, na outra metade da placa, o mesmo
procedimento é repetido. As colônias isoladas estarão mais ao centro e, através da
repetição, poder-se-ia obter microrganismos que estavam presentes na segunda amostra
da colônia, porém não presente na primeira. Como alternativa, cada metade da placa
pode ser utilizada para uma colônia diferente, e este é o procedimento adotado nesta
aula prática.
Estrias simples Estrias compostas
Figura 1. Técnicas de estriamento.
Em seguida, as placas serão incubadas a 28ºC por 48 horas. Após este período, as
placas serão transferidas para geladeira até a próxima aula prática, quando avaliaremos
os resultados obtidos.
 Isolamento fúngico
Flambar uma alça de níquel-cromo em chama de lamparina.
Tocar a superfície de uma colônia.
Transferir para o centro de cada uma das duas placas contendo meio Sabouraud.
Incubar cada uma das placas em temperaturas diferentes: temperatura ambiente e
a 25ºC. Após uma semana de incubação, as placas serão estocadas em geladeira.
LEMBRETE:
Trabalhe SEMPRE mantendo as condições de assepsia:

 Desinfetar as mãos e a bancada de trabalho com álcool 70%, ANTES DE
ACENDER A LAMPARINA.
 Sempre deixe o material PRÓXIMO À CHAMA para evitar contaminação
externa.
4. RESULTADOS E QUESTÕES A SEREM RESPONDIDAS
4.1. Em relação a fungos, foi possível observar crescimento satisfatório do

microrganismo que se pretendia isolar? Houve crescimento de contaminantes?
4.2. Em relação a bactérias, foi possível observar crescimento satisfatório do

microrganismo que se pretendia isolar? Houve crescimento de contaminantes?
4.3. Seu grupo pôde observar colônias bacterianas individuais? O que isso
significa? Caso isto não tenha sido possível, discutir os fatores que dificultaram o
isolamento das colônias.
4.4. Descreva um exemplo de como a técnica de isolamento pode ser aplicada

para o estudo de algum microrganismo de interesse para a Agronomia.
4.5. Qual a diferença entre isolamento e inoculação?
4.6. Em caso do seu grupo não ter obtido uma cultura aparentemente pura, quais
seriam os próximos passos a serem realizados se o trabalho de laboratório prosseguisse
até o isolamento?
REFERÊNCIAS
AULA 04
ESTOCAGEM E MANUTENÇÃO DE MICRORGANISMOS
1. INTRODUÇÃO
A importância da manutenção e principalmente, preservação de microrganismos
caracteriza-se como reflexo da necessidade de utilização de organismos ou espécimes a
qualquer momento, quer para fins experimentais, didáticos, industriais ou estudos
comparativos. Desta forma, conhecer a melhor maneira de preservar culturas
bacterianas e dispor de técnicas simples e eficientes, reveste-se de grande valia aos
laboratórios de microbiologia. O principal objetivo da manutenção de um
microrganismo não é somente conservar seu estado inicial evitando mutações
indesejáveis, mas também garantir ao máximo a vitalidade das células e a quantidade de
células viáveis.
Após a obtenção de cultura pura (axênica), é necessário estocar estes
microrganismos. Em geral, após a repicagem dos microrganismos em placas com meio
sólido, estes são crescidos em tubos com meio sólido inclinado. Esta inclinação é
recomendada para aumentar a área de crescimento bacteriano. Após o crescimento, em
geral, coloca-se uma camada de óleo mineral esterilizado a fim de limitar a quantidade
de oxigênio disponível, causando assim uma redução no metabolismo e,
consequentemente, na taxa de multiplicação do agente.
Em nossa aula prática, faremos a transferência para um tubo com meio de cultura do
tipo BDA, solidificado em ângulo.
2. OBJETIVO
Apresentar técnica de estocagem de microrganismos.
Procedimento:
- Esterilizar a alça de platina com bico de Bunsen ou lamparina.
- Abrir a placa, esfriar a alça no canto da placa e tocando a colônia escolhida.
- Fechar a placa.
- Retirar o tampão do tubo contendo meio de BDA inclinado.
- Flambar a boca do tubo e mantê-la próximo ao bico de Bunsen.
- Introduzir a alça de platina carregada no meio inclinado.
- Inocular fazendo estrias na superfície do meio de cultura, começando do fundo do tubo
até 2/3 do comprimento da superfície.
- Flambar a boca do tubo e recolocar o tampão.
- Esterilizar a alça de platina e recolocá-la no suporte.
- Identificar o material
- Incubar a 28 - 30ºC por 48 horas. Em seguida, estocar em geladeira.
LEMBRETE!!!!
Trabalhe SEMPRE mantendo as condições de assepsia:
 Desinfetar as mãos e a bancada de trabalho com álcool 70%, ANTES DE
ACENDER A LAMPARINA.
 Sempre deixe o material PRÓXIMO À CHAMA para evitar contaminação
externa.
4.1. Foi possível observar crescimento satisfatório das bactérias que se pretendia
estocar? Houve crescimento de contaminantes?
4.2. Cite uma vantagem e uma limitação do método de estocagem utilizado na

aula prática.
4.3. Descreva um outro método de estocagem indicado para bactérias, e qual sua
aplicação na área de agronomia.
4.4. Cite dois bancos de germoplasma de microrganismos de referência no Brasil

e suas localizações.
4.5. Cite dois motivos pelos quais um pesquisador realiza a estocagem de um

microrganismo.
REFERÊNCIAS
SILVA FILHO, G. N.; OLIVEIRA, V. L. Microbiologia: manual de aulas práticas. 2.
ed. rev. Florianópolis: Ed. da UFSC, 2007.
SOLA, Marília Cristina et al. Manutenção de microrganismos: conservação e
viabilidade. Enciclopédia Biosfera - Centro Científico Conhecer, Goiânia, v.8, n.14,
p.1398-1418, 2012.
AULA 05
COLORAÇÃO DIFERENCIAL (TESTE DE GRAM)
1. INTRODUÇÃO
A observação de um microrganismo ao microscópio depende de seu contraste
com o meio que o cerca. Com exceção de estruturas celulares muito pigmentadas (p. ex.
cloroplastos), objetos biológicos absorvem muito pouca luz na região visível do
espectro e assim sendo, o contraste de uma célula viva é quase todo ele devido à
refração da luz. No entanto, o contraste pode ser bastante aumentado através de
colorações: tratamentos com corantes que se ligam seletivamente a célula inteira ou a
certos componentes celulares, promovendo desta forma uma maior absorção da luz
incidente.
Os microrganismos podem ser observados vivos, em suspensão aquosa, ou
mortos, sob a forma de esfregaços secos, fixados e corados. Neste último caso, o
processo de preparação das lâminas envolve três etapas:
a. Realização do esfregaço: estender sobre uma lâmina, uma gota de suspensão

microbiana obtida diretamente por meio do recolhimento mediante pipeta de Pasteur, de
um meio de cultivo líquido ou emulsionando em uma gota de água estéril, previamente
depositada na lâmina, o conteúdo de uma alça de platina que foi introduzida em um
cultivo sobre meio sólido. Preparar o esfregaço com o auxílio de uma segunda lâmina
ou lamínula.
b. Fixação: uma vez seco, passar o esfregaço três a quatro vezes rapidamente no
interior da parte amarela de uma chama.
c. Coloração: a coloração do material a ser observado pode ser simples ou
diferencial, conforme definido a seguir. A coloração simples consiste na aplicação de
uma única solução corante sobre o esfregaço, produzindo uma coloração uniforme em
todas as células. Como exemplo, utiliza-se o azul de metileno para observar a
morfologia das células. Já a coloração diferencial evidencia diferenças entre células ou
partes da célula. As células são expostas a mais de uma corante ou reagente.
Na microbiologia, um dos testes de coloração diferencial mais utilizado é o Teste

de Gram. A coloração consiste na aplicação de um corante básico, o cristal violeta, e
uma solução de iodo e iodeto de potássio (lugol), em um esfregaço previamente fixado
na chama. A preparação é, então, tratada com um solvente orgânico (álcool ou acetona),
com o objetivo de descolorir as células. As células que retêm o complexo cristal violeta
iodo após a lavagem com o solvente, apresentando coloração azul-violeta escura, são
denominadas Gram-positivas. As células que não retêm o corante após a ação do
solvente, quando tratadas com um segundo corante (fucsina ou safranina), chamado
corante de contraste ou contra-corante, adquirem a coloração vermelha. São
denominadas Gram-negativas.
A reação de Gram pode apresentar resultados variáveis, dependendo da idade da
cultura, das condições ambientais de crescimento e de falhas na execução da técnica,
principalmente relacionadas ao curto tempo de exposição aos diferentes reagentes. No
total, são utilizadas quatro soluções no teste de Gram:
1) Gram I - Cristal violeta (Cristal violeta), que penetra no interior das células.
2) Gram II - Solução iodo-iodetada (lugol). Há a formação de um complexo
cristal violeta+lugol no citoplasma.
3) Gram III – Álcool ou acetona. Ocorrem alterações diferenciadas na parede
celular das bactérias Gram positivas e Gram negativas. Os lipídeos são destruídos na
parede das bactérias Gram negativas e com isso, o complexo cristal violeta+ lugol sai da
célula, que perde a coloração.
4) Gram IV - Fucsina diluída ou safranina, que é o corante de contraste. Será
absorvido apenas por bactérias Gram negativas, já que estas estão internamente
insaturadas. As Gram positivas já estão preenchidas pelo complexo violeta+lugol e,
portanto, não absorvem o corante de contraste, em quantidade significativa.
Figura 1. Bactérias Gram positivas (esquerda) e Gram negativas (direita).
2. OBJETIVO
Caracterizar uma cultura bacteriana através das diferenças de parede celular pelo
Teste de Gram.
Preparo e fixação do esfregaço: a preparação inicial do esfregaço depende do
tipo de cultura disponível. Ele é constituído de uma camada muito fina de material sobre
a lâmina e deve ser seca. A fixação do material na lâmina pode ser feita pela ação do
calor, álcool, formol, ácido acético e outros produtos, e destina-se a imobilizar os
constituintes celulares, fixando o esfregaço na lâmina através de precipitação ou
coagulação do material protéico.
Procedimento para culturas em meio sólido

- Colocar uma gotícula de água esterilizada na lâmina.
- Retirar uma pequena quantidade da cultura e misturar com a água.
- Espalhar o material no centro da lâmina, tomando cuidado para não atingir as
bordas. Esterilizar a alça de platina na chama.
- Fixar o esfregaço passando a lâmina, com o lado do esfregaço virado para cima,
sobre a chama do bico de Bunsen até secagem completa. Após o resfriamento, procede-
se à coloração.
Figura 2. Preparação de lâmina para o teste de Gram a partir de culturas em meio líquido ou sólido.
Procedimento para a coloração

- Cobrir o esfregaço com o corante cristal violeta (Gram I) e deixar por 3 minutos.
- Escorrer o corante e lavar com água corrente.
- Cobrir com lugol (Gram II) e deixar por 1 minuto.
- Escorrer o lugol e lavar com água corrente.
- Lavar em álcool absoluto ou em uma mistura álcool-acetona (Gram III) até que todo o
corante seja removido.
- Lavar em água corrente.
- Colocar o corante Gram IV (Fucsina ou Safranina) e deixar agir por 30 segundos.
- Escorrer e lavar com água corrente.
- Secar com auxílio de papel, colocar a lamínula e observar ao microscópio.
4.1. Indique a coloração que cada tipo de célula bacteriana deve adquirir após o
uso de cada reagente durante o procedimento de coloração.
Procedimento Gram positiva Gram negativa
Cristal violeta
Lugol
Álcool
Fucsina ou safranina
4.2. Explique porque as células Gram positivas e Gram negativas adquirem

diferentes cores ao final de cada passo de coloração. Utilize as figuras abaixo como base
para sua resposta.
Figura 3. Parede celular bacteriana Gram-positiva
Figura 4. Parede celular bacteriana Gram-negativa

4.2. Para cada lâmina avaliada, cite qual foi o resultado do teste de Gram.
4.3. Para cada lâmina avaliada, cite qual o formato das células bacterianas
observadas.
4.4. Nas lâminas feitas, foram observados os dois tipos de reação celulares, Gram-
positiva e Gram-negativa? Caso sim, qual a explicação para este fato?
4.5. Cite duas aplicações do uso do Teste de Gram na Agronomia.

4.6. O teste de Gram funciona para diferenciar a parede celular de outros

microrganismos que não sejam bactérias? Explique o motivo.
4.7. Existem grupos de bactérias que não podem ser coradas pelo Teste de Gram,
e sim pela coloração de Ziehl-Neelsen. Explique o motivo e descreva esta técnica.
4.8. As arquéias possuem diferenças em relação a parede celular de bactérias.

Quais são elas?
4.9. Cite duas espécies de bactérias Gram negativas e qual a sua importância para
a Agronomia
4.10. Cite duas espécies de bactérias Gram positivas e qual a sua importância para
a Agronomia.
REFERÊNCIAS
MADIGAN, Michael T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de
manual de aulas práticas. 2. ed. rev. Florianópolis: Ed. da UFSC, 2007.
AULA 06
MORFOLOGIA DE FUNGOS
1. INTRODUÇÃO
Os fungos apresentam uma ampla diversidade morfológica. Essa diversidade
está, em grande parte, relacionada às atividades desenvolvidas por esses organismos. A
grande maioria dos grupos, entretanto, exibe crescimento filamentoso e isso acarreta
certa dificuldade na quantificação de seu crescimento. Enquanto para bactérias o
crescimento é facilmente quantificado através da contagem de células, para fungos o
crescimento micelial impõe algumas limitações e outras técnicas devem ser utilizadas.
As condições ótimas de crescimento também são diferentes entre bactérias e
fungos. A determinação dos valores ótimos de pH, temperatura e nutrientes são
importantes para que um fungo possa ser cultivado com sucesso. Além disso, o
conhecimento destas condições ótimas permite ao pesquisador determinar em que
condições aplicadas este fungo pode ser utilizado (por exemplo: compostagem,
degradação de xenobióticos, etc).
Além das diferenças morfológicas, os fungos apresentam, também, ampla
diversidade fisiológica. Eles ocupam os mais variados nichos nos ecossistemas. Atuam
como saprófitos (decompositores de material orgânico) ou como biotróficos. Neste
último caso, podem se comportar como parasitas de vegetais ou animais, ou como
simbiontes. Algumas simbioses são tão perfeitas, como no caso dos líquens, que parece
tratar-se de um único organismo. Dentre as associações de fungos e vegetais, chamam
atenção as que ocorrem entre basidiomicetos e espécies florestais (ectomicorrizas),
sendo algumas plantas totalmente dependentes da associação. Em outros casos, como as
micorrizas arbusculares (glomeromicetos e plantas) embora a dependência seja menor, a
participação do fungo é fundamental na produtividade da cultura.
Embora técnicas mais avançadas empregando ferramentas de biologia molecular
venham sendo utilizadas, a morfologia é ainda a principal característica utilizada na
identificação e taxonomia dos fungos. Dentre as características mais importantes na
identificação dos fungos, tem-se o tipo de micélio (septado e não septado), as hifas
especializadas na reprodução e estruturas de frutificação que podem conter diferentes
tipos de esporos de origem sexuada ou assexuada.
2. OBJETIVOS
Reconhecer a morfologia e as estruturas dos principais filos de fungos.
Observar o material biológico exposto. Para cada estação de observação nas

bancadas, desenhar e identificar as estruturas observadas. Utilizar as páginas seguintes
para anotações.
01 - Lâmina com leveduras (Saccharomyces cereviseae)

Espécie do filo Ascomicota
02 - Lâmina com Candida albicans

Espécie do filo Ascomicota
03 - Lâmina com uma espécie de Aspergillus durante fase assexuada

Espécie do Filo Ascomicota.
Figura 01: Ciclo de reprodução de Ascomicota.

04 – Líquen
Associação formada tanto com fungos do filo Ascomicota quanto Basidiomicota
05 – Corpo de frutificação
Figura 02: Ciclo de reprodução de Basidiomicota.

06 – Penicillium sp.
07 – Puccinia sp.
08 – Esporos
09 – Esporos de fungos micorrízicos arbusculares
10 – Malassezia sp.
11 – Microsporum sp.
4. RESULTADOS E QUESTÕES A SEREM ARESPONDIDAS.
4.1. Cite três exemplos de espécies de fungos ascomicetos leveduriformes e sua

importância para a Agronomia, seja em processos benéficos ou prejudiciais. Descreva
também a doença ou problema associado a estas espécies.
4.2. Cite três exemplos de espécies de fungos ascomicetos filamentosos e sua

importância para a Agronomia, seja em processos benéficos ou prejudiciais. Descreva
também a doença ou problema associado a estas espécies.
4.3. Cite três exemplos de espécies de fungos basidiomicetos e sua importância para a
Agronomia, seja em processos benéficos ou prejudiciais. Descreva também a doença ou
problema associado a estas espécies.
AULA 07
QUANTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS: DILUIÇÃO SERIADA
1. INTRODUÇÃO
A população microbiana ambiental é grande e complexa. O estudo dos
microrganismos que habitam os diversos ambientes (ar, água, solo, superfície da pele)
requer o conhecimento dos tipos específicos de microrganismos que ali se encontram.
Isto, por sua vez, requer técnicas capazes de separar as espécies distintas na forma de
culturas puras a partir de culturas mistas.
A obtenção de uma cultura pura envolve não apenas o isolamento de um dado
microrganismo de uma população microbiana natural mista, mas também a manutenção
do indivíduo isolado e sua progênie em um ambiente artificial. Existe uma variedade de
técnicas através das quais as diferentes espécies de um espécime natural podem ser
isoladas e desenvolvidas em cultura pura, como:
1. Técnica de enriquecimento: o processo de plaqueamento pode ser precedido
pelo crescimento em um meio de enriquecimento para melhorar as chances de
isolamento de alguns tipos fisiológicos.
2. Técnica da placa derramada (“pour-plate”): sucessivas diluições do inóculo são
colocadas em placas de Petri estéreis e misturadas ao meio contendo ágar fundido, que
logo em seguida solidifica. As colônias subsequentemente desenvolvem-se embebidas
no ágar. Esta técnica pode ser usada para análises quantitativas e/ou qualitativas.
Usando-se o processo quantitativo é possível determinar o número de um tipo de
bactéria, por exemplo, presente no inóculo, assim como isolar esses tipos em cultura
pura.
3. Técnica das diluições sucessivas ou seriada: A técnica de diluição é muito útil
quando se deseja saber quantas unidades formadoras de colônias (UFC) existem em
uma suspensão bacteriana. Esta técnica pode ser aplicada quando se quer determinar,
por exemplo, a população bacteriana ao longo do tempo, ou UFC de uma bactéria
fitopatogênica ou patogênica presente em um extrato obtido de uma amostra vegetal ou
animal.
Esta metodologia consiste na diluição progressiva da suspensão microbiana,
tomando-se uma pequena alíquota de uma suspensão mais concentrada, de onde se faz a
transferência desta para uma solução salina esterilizada, com volume previamente
determinado. Esta técnica permite obter colônias isoladas de microrganismos, além de
estimar a comunidade microbiana cultivável. Recomenda-se que o número final de
colônias por placa seja entre 30 e 300, quantidade que facilita a contagem e estimativa
da comunidade presente.
2. OBJETIVO
Realizar a técnica de diluição seriada para quantificação de populações
microbianas edáficas.
Em nossa aula prática, quantificaremos a população microbiana de amostras de
solo.
A diluição inicial será feita com 10g de solo em 90mL de água (no Erlenmeyer).
Portanto, já iniciamos com uma relação de 10g de solo em cada 100mL de solução: 1/10
(fator de diluição 101).
Deste Erlenmeyer, tomamos 1mL e pipetamos no tubo A que contém 9mL de
água destilada. Aumentamos fator de diluição para 102.
Do tubo A, coletamos 1mL da solução e transferimos para o tubo B, que contém
9mL de água destilada. Desta forma, o fator de diluição no tubo B é de 103.
Do tubo B, coletamos 1mL da solução e transferimos para o tubo C, que contém
9mL de água destilada. Desta forma, o fator de diluição no tubo C é de 104.
Do tubo C, coletamos 1mL da solução e transferimos para o tubo D, que contém
9mL de água destilada. Desta forma, o fator de diluição no tubo D é de 105.
Do tubo D, coletamos 1mL da solução e transferimos para o tubo E, que contém
9mL de água destilada. Desta forma, o fator de diluição no tubo D é de 106.
Após o preparo das diluições, inocula-se 0,1 mL de cada um dos tubos (B, C, D e
E) em quatro placas de Petri distintas contendo meio LB (denominadas B, C, D, e E,
respectivamente) e procede-se o espalhamento do inóculo com auxílio de alça de
Drigalski. Incubar as placas invertidas a 28oC por 48h.
Figura 01: Procedimento da diluição seriada.

Adaptada de: http://fitopatologia1.blogspot.com.br/2013_06_01_archive.html
4.1. Qual a diferença entre uma célula bacteriana e uma unidade formadora de
colônia (UFC)?
4.2. Qual o número de UFCs obtidas nas amostras de seu e de outros grupos?
Bactérias Fungos
Grupo
Grupo
Grupo
Grupo
4.3. Caso haja diferenças entre os valores observados entre o seu grupo e os
demais, quais os fatores que podem ter contribuído para isso?
4.4. A quantidade de fungos e bactérias foi igual, maior ou menor? Por que há
essa semelhança (ou diferença)?
4.5. Existe algum erro de manipulação de vidraria ou de pipetagem que pode ter
ocorrido durante o trabalho do seu grupo? Como você poderia detectar isso nesta
técnica?
4.6. Como você acha que a técnica de diluição seriada para contagem da
comunidade microbiana pode ser útil na sua futura atuação como engenheiro (a)
agrônomo (a)? Ou seja, para que tipo de trabalhos ou estudos esta pode ser utilizada?
4.7. Cite cinco exemplos de espécies de bactérias comumente encontradas no

solo, e que processos elas realizam.
4.8. Caso houvesse interesse em estudar isoladamente uma colônia de bactérias

observada em uma placa de diluição seriada, quais seriam os passos a serem tomados
para que esta bactéria fosse isolada?
4.9. Explique o motivo pelo qual não é possível realizar a quantificação de

microrganismos sem antes realizar a diluição do solo.
REFERÊNCIAS
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. 10 ed.
Porto Alegre, RS: Artmed, 2012.
AULA 08
PROVAS BIOQUÍMICAS
1. INTRODUÇÃO
A identificação de bactérias requer a observação e apreciação de diferentes
características morfológicas, culturais, metabólicas, genéticas, etc. A investigação de
somente um tipo dessas características raramente é suficiente para identificação de uma
espécie bacteriana.
O estudo de seus caracteres bioquímicos (reações metabólicas) é muito
importante na identificação das bactérias. Provas bioquímicas consistem em testes
utilizados na verificação das transformações químicas que ocorrem num substrato
(composto) pela ação de um determinado microrganismo que auxiliam na sua
identificação.
2. OBJETIVO
Conhecer os princípios das provas bioquímicas utilizadas na identificação das
espécies microbianas.
3.1. FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES
As espécies microbianas podem diferir em sua capacidade de utilizar (fermentar)
açúcares (glicose, lactose, maltose, sacarose, manose, xilose, etc). A fermentação de
determinados carboidratos, principalmente mono e dissacarídeos, é evidenciada pela
produção de ácidos e/ou gás no meio de cultura. Para detecção do ácido, usa-se, em
geral, um meio básico contendo apenas uma fonte de carbono (açúcar que se deseja
testar) e um indicador de pH (Vermelho de fenol).
A produção de gás associada à fermentação pode ser avaliada pela presença de
bolha no interior do pequeno tubo invertido (tubo de Durham) colocado no meio de
cultura, quando for o caso.
3.1.1. TESTE DA GLICOSE

Determinar a capacidade de um microrganismo em fermentar a glicose incorporada em
meio basal, com produção de ácido e/ou gás.
Composição do meio:
Glicose 10g
Peptona 10g
Cloreto de sódio 5g
Vermelho de fenol 10,0ml
(sol. 0,18%)
Água destilada 1L
pH do meio = 7,4. O meio apresenta cor laranja (antes da inoculação).
Coloração do Vermelho fenol em diferentes pH:

Ácido Neutro Alcalino
Amarelo Laranja Vermelho
Este caldo é colocado em tubos de ensaio contendo no seu interior tubos de

Durham, cuja função é coletar os gases produzidos pela bactéria.
Procedimento: A inoculação deve seguir as técnicas para semeadura em meios

líquidos. Incubar a 30C/24h.
Na próxima aula, observa-se o resultado:

Se o carboidrato não for fermentado, a cor do meio permanece a mesma (cor
laranja - teste negativo).
Se a bactéria fermentar o açúcar, o pH do meio diminui (reação ácida) e a cor do
meio muda para amarelo (teste positivo).
Observar a presença de bolhas no interior do tubo de Durham que indica a
produção de gases.
Figura 1. Resultados possíveis da prova de fermentação da glicose.
3.1.2. TESTE DA SACAROSE

Determinar a capacidade de um microrganismo em fermentar a sacarose incorporada em
meio basal, com produção de ácido e/ou gás.
Sacarose 10g
Peptona 10g
Cloreto de sódio 5g
Vermelho de fenol 10,0ml
(sol. 0,18%)
Água destilada 1L
pH do meio = 7,4. O meio apresenta cor laranja (antes da inoculação).

Coloração do Vermelho fenol em diferentes pH:

Ácido Neutro Alcalino
Amarelo Laranja Vermelho
Este caldo é colocado em tubos de ensaio contendo no seu interior tubos de

Durham, cuja função é coletar os gases produzidos pela bactéria.
Procedimento: A inoculação deve seguir as técnicas para semeadura em meios

líquidos. Incubar a 30C/24h.

Se o carboidrato não for fermentado, a cor do meio permanece a mesma (cor
Laranja - teste negativo).
Se a bactéria fermentar o açúcar, o pH do meio diminui (reação ácida) e a cor do
meio muda para amarela (teste positivo).
Observar a presença de bolhas no interior do tubo de Durham que indica a
produção de gases.
Figura 2. Resultados possíveis da prova de fermentação da sacarose.
3.2. TESTE DA CATALASE

Certas bactérias produzem peróxido de hidrogênio em presença de oxigênio livre.
O acúmulo de peróxido de hidrogênio nas culturas é nocivo à bactéria, podendo ser
controlado por dois fatores: catalase bacteriana e/ou o grau de sensibilidade da bactéria
ao composto. A catalase é uma enzima presente em muitas bactérias aeróbias que
catalisa a seguinte reação: 2H2O2 – 2H2O + O2.
Procedimento:
- Retirar com auxílio de alça de platina, uma parte do crescimento bacteriano e
colocar sobre lâmina de vidro.
- Gotejar sobre a amostra, o reagente peróxido de hidrogênio a 3%.
Resultado: Observar a formação de bolhas.
Figura 3. Resultados possíveis observados em bactérias catalase positivas (parte superior) e bactérias
catalase negativas (parte inferior).
3.3. TESTE DA PRODUÇÃO DE UREASE

A urease é uma enzima hidrolítica que ataca as fontes de nitrogênio e carbono
amidas como a uréia, formando amônia como produto final. A amônia liberada no meio
reage com a água produzindo amônio e OH-, aumentando o pH. Assim, a produção de
urease por um microrganismo é facilmente detectada quando esse organismo é cultivado
em um meio contendo uréia e um indicador de pH como vermelho de fenol.
Ureia 8,00g
Extrato de levedura 0,04g
Fosfato de sódio 3,80g
Fosfato dipotássico 3,64g
Vermelho de fenol (0,18%) 20,0mL
Água destilada 380mL
pH = 6,8
Procedimento: A inoculação é feita em meio líquido. Incubar a 30C/24h.

Na próxima aula, observa se o resultado:
Caso o meio permaneça ácido, não há alteração de cor e permanecerá amarelo
(teste negativo). Se houver alteração para pH alcalino, haverá mudança de cor para rosa
avermelhado (teste positivo).
Figura 4. Resultados possíveis observados em bactérias urease positivas (esquerda) e bactérias urease
negativas (direita).
3.4. PROVA DO CITRATO

Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte
de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio. O Ágar Citrato
Simmons é recomendado para diferenciação e identificação de Enterobacteriaceae com
base da utilização do citrato.
Composição do meio (por litro):

Sulfato de magnésio 0,2g
Fofato de amônia dihidrogenado 1,0g
Fosfato dipotássico 1,0g
Citrato de sódio 2,0g
Cloreto de sódio 5,0g
Azul de Bromotimol 0,08g
Ágar 15,0g
pH do meio = 6,9, no qual a cor é verde (antes da inoculação).
Este meio é preparado em tubos inclinados, conforme ilustração abaixo.
Figura 5. Tubo de cultura contendo meio Ágar Citrato Simmons.
Procedimento: A inoculação deve ser feita com uma estria simples ao longo da
superfície do meio. Em seguida, incubar a 36,0±1ºC por 24-48h.

Organismos capazes de solubilizar o fosfato de amônio diidrogênio e o citrato de
sódio como únicas fontes de nitrogênio e carbono, respectivamente, irão crescer neste
meio e produzirão uma reação alcalina evidenciada pela mudança de cor do indicador
azul de bromotimol, de verde (neutro) para azul (alcalino).
Figura 6. Resultados possíveis da prova do citrato.
3.5.HIDRÓLISE DO AMIDO
O amido é um polímero constituído de moléculas de glicose. Como o polímero é
muito grande, sua utilização pelos microrganismos deve ser precedida de uma
degradação, com a formação de substâncias mais simples e facilmente assimiláveis.
Muitas espécies bacterianas são capazes de produzir amilases que causam a
hidrólise do amido com a formação de maltose. A maltose pode, então, entrar na célula
onde é hidrolisada a glicose. Em alguns casos a hidrólise do amido é incompleta,
resultando no acúmulo de dextrinas no meio. O amido se cora de azul com o iodo, mas
seus produtos de hidrólise (dextrinas, maltose e glicose) não produzem essa reação.
Composição do meio com amido

Amido 2g
Extrato de carne 10g
Na2HPO4 1g
NaCl 5g
Agar 15g
Composição do reativo lugol

Iodo 1g
Iodeto de potássio (KI) 2g
Procedimento: Inocular o meio a bactérias por meio de estrias sobre a placa contendo
meio com amido e incubar por 48h a 30C.
Na próxima aula, observa se o resultado:
Cobre-se a superfície do meio sólido com lugol (5-10mL) e observa-se a

coloração:
Azul: amido presente – não houve hidrólise
Incolor: hidrólise completa pela ação de beta-amilases
Vermelho: hidrólise parcial, pela ação de alfa-amilases.
Figura 7. Colônias microbianas produtoras de amilases.
4.1. Explique o que é uma prova bioquímica.
4.2. Apresentar os resultados positivos e negativos de todas as provas bioquímicas

conforme tabela abaixo.
Fermentação da Fermentação Urease Catalase Amilase
glicose da sacarose
Bactéria
Bactéria
4.3. Por que a catalase é importante no metabolismo de bactérias aeróbicas? Por

que a catalase é utilizada para distinguir entre Staphylococcus e Streptococcus?
4.4. Qual a importância da urease para uma espécie bacteriana de importância

para a Agronomia?
4.5. Descreva duas aplicações de provas bioquímicas em áreas de atuação do

Engenheiro Agrônomo.
4.6. A prova do citrato é usada para detecção de um determinado grupo de

bactérias. Qual é ele? Quais processos esse grupo de bactérias realiza?
REFERÊNCIAS
AULA 09
MICROBIOLOGIA DO SOLO: ISOLAMENTO DE RIZÓBIOS
1. INTRODUÇÃO
Os rizóbios são bactérias que em simbiose com as plantas da família das
leguminosas, fixam nitrogênio atmosférico. A fixação do N2 se dá pelo complexo
enzimático denominado nitrogenase, presente nos rizóbios (microssimbiontes).
Atualmente, vários gêneros são caracterizados como rizóbios, como Rhizobium,
Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium. A maior parte dos nódulos é formada
no sistema radicular. Entretanto, em alguns gêneros botânicos, como Aeschynomene e
Discolobium, há a formação de nódulos no caule.
Se a linhagem bacteriana for eficiente, todo o nitrogênio exigido pela planta pode
ser suprido por essa associação, sendo indicada para produção de inoculantes. Nesses
casos, deve apresentar alta capacidade de fixação, alta capacidade competitiva por sítios
de infecção, baixa especificidade hospedeira e alta capacidade de sobreviver e colonizar
o solo.
Há uma constante necessidade de obtenção de novas linhagens de rizóbios, quer
seja para plantas que dispõe de inoculante, e se deseja maior eficiência, quer para as que
não dispõem de rizóbios eficientes. Qualquer que seja o caso, a obtenção de novas
estirpes de rizóbios tem início com o isolamento.
2. OBJETIVO
Isolar bactérias fixadoras de N2 a partir de nódulos radiculares.
Procedimento
 Selecionar de três a cinco dos maiores nódulos com coloração intensa
avermelhada, o que indica presença de leg-hemoglobina e atividade da nitrogenase.
 Remover os nódulos da raiz e lavá-los com água.
 Lavar os nódulos com álcool 95% em um béquer durante 1 minuto.
 Retirar o álcool e adicionar água sanitária. Deixar o nódulo imerso no béquer por
5 minutos.
 Lavar os nódulos com água esterilizada e destilada por cinco vezes.
 Macerar os nódulos com um bastão de vidro estéril.
 Coletar uma pequena alíquota desta suspensão com uma alça de platina
flambada.
 Inocular uma placa contendo ágar meio manitol (YMA) vermelho congo
fazendo estrias compostas de forma a obter colônias isoladas.
 Incubar as placas a 28ºC, no escuro, na posição invertida.
 Avaliar o crescimento bacteriano após sete dias.
Composição do meio ágar manitol (YMA) Vermelho congo

0,5g de K2HPO4
10g de manitol
0,1g de MgSO4 . 7H2O
0,1g de NaCl
3,0g de extrato de levedura
20,0g de ágar
1mL de solução vermelho congo 2,5%
Completar o volume para 1000 mL de água destilada
1. Qual a diferença entre uma bactéria do gênero Rhizobium e um rizóbio?
2. A maioria das bactérias obtidas em cultura é rizóbio ou não?
3. Qual a origem mais provável dos contaminantes que você observa na placa?
4. Se você tivesse que repetir esta técnica, alteraria algum procedimento para tentar
diminuir a ocorrência de contaminantes? Qual seria esse?
5. O que você faria para tentar minimizá-los e aumentar suas chances de encontrar
rizóbios?
6. Quais os problemas que você enfrentaria caso resolvesse isolar bactérias fixadoras
de nitrogênio das raízes de uma planta não leguminosa, que não formam nódulos?
REFERÊNCIAS
HUNGRIA, Mariangela. Coleta de nódulos e isolamento de rizóbios. In: HUNGRIA,
Mariangela; ARAÚJO, Ricardo S. Manual de métodos empregados em estudos de
microbiologia agrícola. Série Documentos 46. Brasília: EMBRAPA-CNPAF, 1994, p.
45-61.
AULA 10
MICROBIOLOGIA DO SOLO:
CARACTERIZAÇÃO DE RIZÓBIOS.
1. INTRODUÇÃO
Após o isolamento do rizóbio de nódulos, é necessária sua caracterização baseada
em características morfológicas, fisiológicas e genéticas, além de sua eficiência na
formação de nódulos em uma planta-teste.
Algumas avaliações baseadas nas características morfológicas e bioquímicas são
úteis para diferenciação dos rizóbios. Um dos testes mais simples é o de Gram que,
como já vimos em aulas anteriores, consiste em diferenciar as bactérias em dois grandes
grupos (Gram-positivo e Gram-negativo), devido a diferenças na composição da parede
celular. Por esse teste, pode-se observar que os rizóbios são bastonetes, Gram-negativos
e flagelados.
Os rizóbios podem ser ainda, classificados pela taxa de crescimento que, inclusive
influencia na sua denominação. Os rizóbios de crescimento rápido levam de três a cinco
dias para crescimento, enquanto os de crescimento lento necessitam de sete a dez dias.
Um exemplo do uso da taxa de crescimento para denominação de rizóbios é observado
no gênero Bradyrhizobium. O prefixo Brady significa lento. A espécie Bradyrhizobium
japonicum é específica para nodulação da soja (Glycine max L. Merril).
Outro atributo importante para caracterização é a modificação de pH do meio de
cultivo. Nesse aspecto, os rizóbios podem ser classificados em três classes: estirpes que
acidificam o meio (mais comum entre rizóbios de crescimento rápido), as que não
alteram o pH e as que o alcaliniza (mais comum entre rizóbios de crescimento lento).
Essa diferenciação é observada em meio especifico (YMA) contendo indicador Azul de
bromotimol que, em pH 6,8, apresenta a coloração verde.
2. OBJETIVO
Caracterizar os rizóbios isolados pela taxa de crescimento e tipo de modificação
de pH em meio de cultivo.
3.1. Procedimento para os rizóbios originados dos nódulos.

 A partir das colônias isoladas e puras obtidas em meio YMA vermelho congo
(última aula), selecionar três.
 Coletar uma pequena alíquota de cada uma, com uma alça de platina flambada.
Inocular em três placas contendo ágar meio YMA Azul de bromotimol fazendo estrias
simples. Composição do meio ágar manitol (YMA) Azul de bromotimol
0,5g de K2HPO4
10g de manitol
0,1g de MgSO4 . 7H2O
0,1g de NaCl
3,0g de extrato de levedura
20,0g de ágar
0,5mL de solução Azul de bromotimol 0,5%
Completar o volume para 1000mL de água destilada.
 Avaliar o crescimento bacteriano.
3.2. Procedimento para os rizóbios comerciais, usados como padrão.

A partir do inoculante líquido distribuído para cada grupo, realizar a inoculação
em uma placa de Petri contendo ágar meio YMA Azul de bromotimol
 Coletar uma pequena alíquota do meio de cultura com uma alça de platina
flambada.
 Inocular a placa de Petri fazendo uma estria simples.
 Avaliar o crescimento bacteriano.
O indicador Azul de bromotimol em pH neutro (pH=6,8) possui cor esverdeada.
Em pH ácido (pH<6,8), torna-se amarelo e em pH alcalino (pH>6,8) desenvolve
coloração azul.
Figura 1: Gradiente de coloração por alteração do pH em meio YMA azul de bromotimol pelo
crescimento de rizóbios. (a) pH alcalino; (b) pH neutro; (c) pH ácido.
1. Qual o tempo de crescimento das colônias em placa? Houve alteração de pH? Se

houve, qual a coloração desenvolvida? Qual (is) a (s) causa(s) da alteração?
2. Apenas estas características são suficientes para garantir a identificação e

eficiência do rizóbio? Por quê?
3. Vocês fariam outros testes ou análises? Quais?
REFERÊNCIAS
HUNGRIA, Mariangela. Coleta de nódulos e isolamento de rizóbios. In: HUNGRIA,
Mariangela; ARAÚJO, Ricardo S. Manual de métodos empregados em estudos de
microbiologia agrícola. Série Documentos 46. Brasília: EMBRAPA-CNPAF, 1994, p.
45-61.
AULA 11
INOCULAÇÃO DE SEMENTES
1. INTRODUÇÃO
As fontes de nitrogênio disponíveis para a soja são os fertilizantes nitrogenados e
a fixação biológica de nitrogênio (FBN), que no Brasil se constitui na mais viável
economicamente e ecologicamente para a cultura. A simbiose que ocorre entre as
plantas leguminosas e bactérias do gênero Bradyrhizobium (bactérias do grupo rizóbio),
que resulta na formação de nódulos nas raízes da soja, possibilita a obtenção de todo o
nitrogênio que a cultura necessita para alta produtividade.
Existem dois tipos de inoculantes microbianos comercializados: líquido e turfoso.
Os inoculantes turfosos, líquidos ou outras formulações devem conter uma população
mínima de 1 x 109 células por grama ou mL de inoculante, terem eficiência simbiótica
comprovada pela Reunião da Rede de Laboratórios para a Recomendação, Padronização
e Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbianos de Interesse Agrícola (RELARE) e
serem registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA).
A quantidade mínima de inoculante deverá ser aquela que forneça pelo menos
600.000 células bacterianas por semente de soja. Contudo, as avaliações realizadas em
Roraima e nas principais regiões produtoras de soja tem mostrado que uma dose de
1.200.000 células por semente tem apresentado benefícios significativos na nodulação e
FBN, mostrando ser interessante a utilização de uma maior concentração de células
bacterianas nas sementes. Dessa forma, recomenda-se a dose de 1,2 milhões de células
viáveis por semente, especialmente em áreas de primeiro cultivo ou com pousio
prolongado.
2. OBJETIVO
Familiarizar o estudante com a prática de inoculação de sementes utilizando
material de origem líquida e turfosa.
3.1. INOCULAÇÃO COM MATERIAL LÍQUIDO
- Pesar 100g de sementes de soja e acondicioná-las em embalagem plástica.
- Realizar o cálculo da quantidade de inoculante necessária para 100g de
sementes, conforme instruções contidas na embalagem do produto. A dose de
inoculante a ser aplicada é sempre apresentada na embalagem. No caso do inoculante
para a soja que estamos utilizando, a dose a ser utilizada é de 2mL por kg de semente.
Portanto, será aplicado 0,2mL de inoculante líquido em 100g de sementes.
- Pipetar 0,2mL de inoculante e despejá-lo sobre as sementes. Encher o saco
plástico com ar e homogeneizar.
- Deixar as sementes secarem a sombra antes do plantio, que deve ser realizado
dentro de no máximo 24 horas.
- Levar à casa-de-vegetação e plantar em vasos contendo substrato e observar a
nodulação após três a quatro semanas.
3.2. INOCULAÇÃO COM MATERIAL TURFOSO

- Pesar 100g de sementes e acondicioná-las em embalagem plástica.
- Realizar o cálculo da quantidade de solução açucarada 10% que é necessária
para inocular 100g de sementes, conforme instruções contidas na embalagem do
produto. Se para 50kg de semente são utilizados 300mL, então em 100g serão utilizados
0,6mL.
- Pipetar 0,6mL de solução açucarada e despejá-la sobre as sementes. Encher o
saco plástico com ar e homogeneizar.
- Realizar o cálculo da quantidade de inoculante necessária para 100g de
sementes, conforme instruções contidas na embalagem do produto. Se para 50kg de
semente são utilizados 100g de inoculante, então em 100g de semente será aplicado
0,2g de inoculante.
- Pesar 0,2g de inoculante turfoso em papel alumínio.
- Despejar o inoculante sobre as sementes.
- Homogeneizar as sementes com o inoculante e a solução açucarada até que o
material encontre-se uniformemente distribuído na superfície de todas as sementes.
- Deixar as sementes secarem a sombra antes do plantio, que deve ser realizado
dentro de no máximo 24 horas.
- Levar à casa-de-vegetação e plantar em vasos contendo substrato e observar a
nodulação após três a quatro semanas.
4. CONSIDERAÇÕES SOBRE O PROCESSO DE INOCULAÇÃO

No Brasil, o cultivo da soja pode ser feito sem utilizar-se adubação nitrogenada.
Assim, a comercialização de inoculantes é prática rotineira entre os agricultores.
Entretanto, certos cuidados devem ser tomados com o inoculante e o processo de
inoculação:
- Adquirir inoculantes recomendados pela pesquisa e devidamente registrados no
MAPA. O número de registro deverá estar impresso na embalagem.
- Não usar inoculante com o prazo de validade vencido.
- Ao adquirir o inoculante, certifique-se que o mesmo estava armazenado em
condições satisfatórias de temperatura e arejamento. Transportá-lo e conservá-lo em
lugar fresco e bem arejado.
- Os inoculantes devem conter as estirpes recomendadas para o Brasil (no caso da
soja, por exemplo, elas são SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080).
Observação: SEMIA = Seção de Microbiologia Agrícola da Secretaria da Agricultura
do Rio Grande do Sul.
- Em caso de dúvida sobre a qualidade do inoculante, entrar em contato com um
profissional da área.
- Fazer a inoculação das sementes à sombra e, preferencialmente, efetuar a
semeadura no mesmo dia, especialmente se as sementes foram tratadas com fungicidas
e micronutrientes, mantendo as sementes inoculadas protegidas do sol e calor excessivo.
- Evitar aquecimento em demasia do depósito das sementes na semeadora, pois
altas temperaturas reduzem o número de bactérias viáveis aderidas às sementes.
- Se for realizado o tratamento das sementes com fungicidas, observar as
instruções da embalagem do inoculante. Alguns inoculantes podem ser aplicados
juntamente com o tratamento de sementes, outros não.
Cada produto comercial deve conter na embalagem a forma de inoculação. Por
isso, antes de utilizar o produto é importante que o produtor leia a embalagem do
inoculante. A inoculação clássica é feita misturando o produto às sementes, seja ele
líquido ou turfoso. Um método de inoculação que tem sido utilizado para substituir os
tradicionais é a aplicação do inoculante por distribuição no sulco de plantio. Para esse
método, tem sido recomendada uma dose de inoculante pelo menos seis vezes maior
que a dose para inoculação nas sementes. Já existem equipamentos próprios no mercado
para esta aplicação, sendo recomendado o uso de pelo menos 50L ha-1 da solução água e
inoculante. A principal vantagem de utilizar esse método de inoculação é reduzir os

efeitos tóxicos do tratamento com fungicidas e micronutrientes na semente.
Por volta dos 25-30 dias após a germinação das plantas o produtor pode
inspecionar a lavoura e verificar se a FBN está ocorrendo de forma satisfatória.
Observa-se o aspecto geral do desenvolvimento das plantas e, percorrendo-se os talhões,
arrancam-se algumas plantas, tomando o cuidado de coletar todas as raízes, e observa-se
os nódulos formados. Uma planta bem desenvolvida deve apresentar pelo menos 10-15
nódulos com tamanho em torno de 2 mm na coroa da raiz (local de inserção das raízes
primárias). É importante também cortar alguns nódulos e observar a coloração interna.
Nódulos plenamente ativos apresentam coloração rósea, como resultado da presença da
proteína leghemoglobina.
Existem também tecnologias em fase de teste que permitem que as sementes

sejam inoculadas e estocadas por até 30 dias antes da semeadura. Estes produtos são
denominados de aditivos. Laboratório de Microbiologia do Solo da UFSC testou este
produto nas duas últimas safras e os resultados servirão de suporte para o registro destas
tecnologias junto ao MAPA.
1. O que é um inoculante?
2. Cite três benefícios do uso de inoculantes para espécies utilizadas em

agrossistemas.
3. Quais as diferenças entre inoculantes para espécies de leguminosas e não

leguminosas?
4. Descreva duas vantagens e duas limitações dos inoculantes turfosos em

comparação aos inoculantes líquidos.
REFERÊNCIAS
HUNGRIA, M. Inoculação com Azospirillum brasiliense: inovação em rendimento a
baixo custo. Londrina, PR: Embrapa Soja, 2011.
MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e Bioquímica do Solo. 2 ed.
Lavras: Editora UFLA, 2006.
MUNHOZ, André Thiago; RONSANI, Aline de Liz; ALMEIDA, Roberto de; PURIN,
Sonia. Efeito de técnicas de coinoculação e inoculação pré-semeadura da soja até
30 dias antes do plantio. IN: FERTBIO 2014, Araxá, MG.
RONSANI, Aline de Liz; PINHEIRO, Magaiver Gindri; PURIN, Sonia. Efeitos de
diferentes formulações e técnicas de inoculação no crescimento da soja. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA DO SOLO, 34., 2013, Florianópolis, SC.
AULA 12
MICROBIOLOGIA DO SOLO
CICLO DO CARBONO:
RESPIRAÇÃO BASAL DO SOLO
1. INTRODUÇÃO
Os microrganismos são os responsáveis pela decomposição da matéria orgânica e
responsáveis pela ciclagem de nutrientes e fluxo de energia. A respiração microbiana,
ou seja, absorção de O2 e liberação de CO2, pode ser utilizada para determinar a
atividade microbiana no solo e, consequentemente, a fertilidade e qualidade do solo.
(ANDRÉA; PETTINELLI, 2000; ALEF, 1995). Em geral, estima-se a liberação de
CO2, pois esse, tanto pode refletir a atividade de microrganismos aeróbicos, quanto de
anaeróbicos.
A respiração microbiana do solo é também conhecida como Respiração Basal do
Solo (RBS), pois reflete a atividade microbiana em função do próprio teor de matéria
orgânica presente nesse (DIONÍSIO et al., 2016). Essa está diretamente ligada à
decomposição da matéria orgânica e da mineralização do húmus, sendo possível,
através de sua análise, ter um indicativo do estado metabólico total do solo (MOREIRA
e SIQUEIRA, 2006).
Para determinar a RBS pela liberação de CO2, diversas metodologias podem ser
utilizadas (DIONÍSIO et al., 2016). A titulação do gás capturado em solução básica
(NaOH ou KOH) é uma das mais utilizadas e de fácil execução.
2. OBJETIVO
Estimar a respiração basal do solo, como indicativo de atividade microbiana.
Material
100g de solo
Frascos tipo Pirex de 250mL
Frascos de penicilina
Erlenmeyers de 125mL
KOH 0,3M
Cloreto de bário 20%
Fenolftaleína
HCl 0,1M
Procedimentos
a. Pesar 20g de solo úmido1 e acondicionar em frascos de 250mL que possuam
vedação (ex: frascos Pirex).
b. Pesar igual volume de solo em cápsulas de peso conhecido e levar a estufa a
105C por 48h, para determinar o peso seco.
c. Os frascos com o solo do item (a) devem receber frascos de penicilina,
contendo 10 mL de KOH 0.3 M (agente aprisionador de CO2).
d. Incubar por uma semana, no escuro a 25C.
e. Após este período, transferir o volume dos frascos de penicilina para
erlenmeyers de 125mL, adicionar 3 mL de BaCl (20%), adicionar uma gota
de fenolftaleína (indicador) e agitar.
f. Com o auxílio de uma bureta de 50mL contendo HCl 0,1M padronizado,

acrescentá-lo ao erlenmeyer do item (e), até que a coloração passe de rosa
para transparente (ponto de equivalência) (Figura 1)
1
Para análises de pesquisa, deve – se calcular a Capacidade de Campo (CC) e
levar o solo até 70% da CC.
Figura 1: Ponto de equivalência para determinação de CO2.

Fonte: J.C. Silveira e V. Bonato.
Reações para titulação do CO2:
2KOH + CO2 K2CO3 + H2O (em água é solúvel, formando 2K+ e CO32-)
(Agente aprisionador de CO2)
K2CO3 + BaCl2 2KCl + BaCO3
(É solúvel, formando:
Ba + CO32-)
2+
CO32- + H2O HCO32- + HO-
(HO- torna o meio básico. Coloração rosa)
BaCO3 + 2HCl BaCl2 + H2O + CO2
(Colaboração: Profa Hérica A. Magosso)
Cálculo
Para calcular a RBS, utiliza-se a seguinte equação:
C-CO2 mg/Kg/h = {[ (Vb - Va) x ¨M x 6 x 1.000]/g}/ h, onde:
Vb – Volume de HCl gasto na prova em branco*

Va - Volume de HCl gasto na amostra
M- Molaridade do HCl (previamente determinada na padronização)
g- peso de solo obtido após secagem a 105C, até peso constante
h – número de horas de incubação da amostra.
*Este volume é obtido pela titulação de 10mL de KOH 0,3M com HCl0, 1M
(ambos previamente padronizados), contendo uma gota de fenolftaleína, até
atingir o ponto de equivalência descrito acima.
4.1. Anote os resultados obtidos e compare os valores de C-CO2 obtido nos

diferentes grupos.
Amostra C-CO2 mg/Kg/h
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
4.2. Quais os fatores poderiam afetar as taxas de RBS?
4.3. O que podem significar taxas elevadas de RBS no solo? Quais as

consequências para a qualidade do solo?
4.4. Como a relação C/N de resíduos incorporados ao solo pode alterar a RBS?
REFERÊNCIAS
ALEF, K. Soil Respiration. In: ____;NANNIPIERI, P. (Eds). Methods in Soil
Microbiology and Biochemistry.San Diego: Academic Press Inc., 1995, p. 214-215.
ANDRÉA, M.M.; PETTINELLI Jr., A. Efeito de aplicações de pesticidas sobre a
biomassa e a respiração de microrganismos de solos. Arq. Inst. Biol., v.67, p.223-228,
2000.
DA SILVA, E.E.; De AZEVEDO, P.H.S.; De-POLLI, H. Determinação da respiração
basal (RBS) e quociente metabólico do solo (qCO2).Seropédica: Embrapa
Agrobiologia, 2007. 4p. ( Embrapa Agrobiologia. Comunicado técnico, 99).
DIONISIO, J. A.; PIMENTEL, I. C.; SIGNOR, D. Respiração microbiana. In:
_____.;_______.; ______.; PAULA, A. M. de; MACEDA, A.; MATANNA, A. L
(Coord.). Guia prático de biologia do solo. Curitiba: SBCS: NEPAR, 2016., cap. 12,
p.72-77.
MOREIRA, F. M. de SOUZA e SIQUEIRA, J.O. Microbiologia e bioquímica do solo.
2. ed. atual. ampl. Lavras: Editora UFLA, 2006. 729p.
AULA 13
ECTOMICORRIZAS E FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES
1. INTRODUÇÃO
Existem dois grupos de fungos micorrízicos de importância destacada para o
Engenheiro Agrônomo: os fungos ectomicorrízicos e os fungos micorrízicos
arbusculares.
Os fungos ectomicorrízicos ocorrem tanto no filo Ascomicota quanto
Basidiomicota e promovem diversos benefícios para seu hospedeiro. Os filamentos
fúngicos, denominados hifas, retiram das árvores compostos orgânicos necessários à
sobrevivência do fungo e à produção de novos cogumelos ou basidiocarpos. Em
contrapartida, as plantas tornam-se mais bem nutridas e apresentam maior sobrevivência
e longevidade no campo. Além desses efeitos diretos sobre os membros da simbiose, os
fungos ectomicorrízicos desempenham importante papel nos ciclos de alguns elementos
químicos nos ecossistemas florestais.
No Brasil, muitas plantas arbóreas de importância econômica, usadas na produção
de madeira, carvão e celulose, como o Pinus, o Eucalyptus e a Acacia mangium, são
capazes de associar-se simbioticamente com fungos, resultando na formação de
ectomicorriza.
As ectomicorrizas caracterizam-se por apresentarem uma camada de hifas, o
manto, que recobre as células da epiderme radicular; a rede de Hartig, formada pelo
crescimento das hifas nos espaços intercelulares da epiderme e do córtex; e uma rede
externa de hifas que interligam as raízes ao solo e aos basidiocarpos (corpos de
frutificação).
Manto Rede de Manto Hifas externas Corpos de

Hartig frutificação
Figura 1. Estruturas produzidas por fungos ectomicorrízicos.
Já os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs, Filo Glomeromycota) estabelecem

associações micorrízicas com as raízes da maioria das plantas presentes em diferentes
ecossistemas terrestres. Os FMAs são simbiontes obrigatórios, ou seja, eles conseguem
completar seu ciclo de vida apenas quando associados com uma planta hospedeira, a
qual lhes fornece carboidratos necessários para seu desenvolvimento e formação dos
esporos. O corpo vegetativo desses fungos se diferencia em estruturas como
arbúsculos, vesículas, micélio intra-radicular e extra-radicular e esporos, inexistindo
uma fase sexuada em seu ciclo de vida.
Arbúsculos dentro de Vesículas dentro da raiz

células da raiz
Esporos
Hifa
Micélio intra-radicular
Raiz
Figura 2. Estruturas produzidas por fungos micorrízicos arbusculares.
2. OBJETIVOS
Familiarizar o estudante com as estruturas produzidas por ectomicorrizas em
mudas de Pinus.
Identificar as estruturas produzidas por fungos micorrízicos arbusculares.
3.1. ECTOMICORRIZAS
Procedimento: identificar as estruturas fúngicas nas mudas de Pinus produzidas

em tubetes.
3.1.1 QUESTÕES A SEREM RESPONDIDAS
1. Citar as estruturas de ectomicorrizas que foram observadas em aula e explicar

suas respectivas funções.
2. Discuta, no mínimo, três benefícios que você poderia atribuir à colonização de

uma planta pelos fungos ectomicorrízicos, primeiramente na fase de viveiro e
posteriormente na fase de introdução das mudas ao campo.
3. Qual a origem do prefixo “ecto” na nomenclatura de fungos ectomicorrízicos?

Justifique sua resposta.
4. Fungos ectomicorrízicos podem ser inoculados em qualquer espécie vegetal?

Justifique sua resposta.
3.2. FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES
Procedimento: Identificar e caracterizar estruturas fúngicas nas lâminas e placas

de Petri, discutindo os pontos apresentados. Para cada estação de observação nas
bancadas, desenhar e identificar as estruturas apontadas. Para os demais materiais,
anotar todos os pontos discutidos em sala de aula e responder às questões da apostila.
Placa de Petri:
FMA em associação com uma raiz geneticamente transformada
Microscópio 1 – Hifas intra e extra-radiculares

Microscópio 2 – Vesículas
Microscópio 3 - Esporos
1. Como é produzido inoculante de fungos micorrízicos arbuscularesf?
2. Como este inoculante é aplicado para inocular uma planta?
3. Quais as principais limitações para o uso destes inoculantes comercialmente?

Pense na comparação com inoculantes bacterianos que utilizamos na aula prática sobre
inoculação de sementes.
4. Os fungos micorrízicos arbusculares podem ser usados para inocular mudas de

Pinus? Justifique sua resposta.
REFERÊNCIAS
CLETO, Carla Cândida; PURIN, Sonia. Efeito da inoculação e adubação orgânica na
colonização de raízes de milho crioulo por fungos micorrízicos arbusculares. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA DO SOLO, 34., 2013. Florianópolis, SC.
COSTA, Mauricio Dutra et al. Ectomicorrizas: A face oculta das florestas.
Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, n. 29, p. 38-46.
MOREIRA, Fatima Maria de Souza; SIQUEIRA, José Osvaldo. Microbiologia e
Bioquímica do Solo. 2 ed. Lavras: Editora UFLA, 2006.
SIQUEIRA, José Osvaldo; LAMBAIS, Marcio Rodrigues; STÜRMER, Sidney Luiz.
2002. Fungos Micorrízicos Arbusculares. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento,
n. 25, p. 12-21.
SIQUEIRA, José Osvaldo et al. Micorrizas: 30 anos de pesquisas no Brasil. Lavras:
Editora UFLA, 2010.
AULA 14
MICROBIOLOGIA DA ÁGUA:
TESTE PRESUNTIVO
1. INTRODUÇÃO
As análises de água são realizadas segundo normas adotadas por cada país ou
região. No caso brasileiro, os procedimentos utilizados são os do “Standard Methods
for Examination of Water and Wastewater”, da American Public Health Association
(APHA). As análises microbiológicas da água podem ser tanto no aspecto quantitativo
quanto no qualitativo.
No aspecto quantitativo, procura-se avaliar as populações de um modo geral. Sua
importância está mais relacionada a estudos ecológicos, de monitoramento ambiental ou
dos tratamentos efetuados, mas seus dados podem ajudar também na avaliação da água
quanto a sua potabilidade. Água com altas populações de microrganismos tem maiores
possibilidades de conter organismos patogênicos, podendo indicar, também, um alto
conteúdo orgânico. A decomposição da matéria orgânica pode consumir o oxigênio,
produzindo ácidos e gases tóxicos. Embora a legislação não apresente padrões
restritivos quanto ao número de microrganismos, autores sugerem que águas de boa
qualidade para consumo devem ter populações de bactérias inferiores a 100 UFC/mL.
Além do aspecto de potabilidade, a qualidade microbiológica da água é que vai decidir
sobre seus possíveis usos, como, por exemplo, a irrigação de lavouras (legumes, frutas,
cereais e florestas), a recreação (balneabilidade), a criação de animais (meio de criação
e dessedentação), entre outros.
A contagem de microrganismos em geral, particularmente a de bactérias, também
pode ser um bom indicador no cultivo de animais aquáticos. Avaliações constantes nas
populações de microrganismos existentes nestes ambientes permitem o conhecimento
da população em equilíbrio. Alterações nessas populações podem indicar alterações nas
condições do meio. Um exemplo comum consiste no excesso de alimentação ou na
sobra de alimentos provocada por algum estresse. Isso resulta no aumento da população,
que consumirá mais oxigênio, promovendo a fermentação e alteração de substâncias
tóxicas, o que provocará a morte da criação. Assim, antes de ocorrerem estes problemas,
pode-se prevê-los fazendo-se avaliações periódicas das populações microbianas nos
tanques.
A contagem de fungos não tem uma grande aplicação prática. No entanto, em
algumas situações em que há suspeita de contaminação da água com fungos patógenos
ou toxigênicos, pode ser importante um procedimento de contagem, mas com o objetivo
de verificar os tipos que ocorrem. Por exemplo, Aspergillus flavus, produtor de
aflatoxina.
Vários procedimentos podem ser utilizados na avaliação de amostras de água; no
entanto, os mais utilizados são os testes para indicação da ocorrência de coliformes
totais e fecais. O teste para detecção de coliformes totais consiste de duas etapas, o teste
presuntivo e o teste confirmativo, cujas características já estudamos em aula teórica. A
pesquisa de coliformes é baseada nas características do grupo bastonete Gram-negativo,
que produz ácido e gás a partir de lactose.
2. OBJETIVOS
Iniciar a avaliação da qualidade de amostras de água pela análise preliminar da
quantidade de coliformes totais.
No teste presuntivo, presume-se que os microrganismos que crescem e produzem
gás a partir de lactose sejam coliformes. Entretanto, como não há outras informações
sobre as demais características desses microrganismos, são necessários outros testes
para confirmação. A pesquisa pode ser conduzida de várias maneiras, entre elas, pela
técnica dos tubos múltiplos e do filtro de membrana.
O procedimento adotado na técnica dos tubos múltiplos depende do objetivo da
análise. Nesta aula, usaremos cinco tubos de ensaio contendo 10mL de caldo lactosado
em uma concentração de 13g/L.
Procedimentos
a) Medir um volume de 100mL da amostra trazida do campo com o auxílio de
uma proveta.
b) Serão utilizados cinco tubos de cultura com um tubo de Durham invertido.
Neles, foram adicionados 10mL de caldo lactosado e foi realizada a esterilização por 20
minutos a 121ºC previamente a realização desta aula prática.
c) Do volume de água de 100mL, pipetar 10mL da amostra de água a ser
examinada em cada um dos 5 tubos. Utilizar pipetas previamente esterilizadas.
d) Incubar os tubos a 35ºC por 48 horas. Após este período, eles serão transferidos
para a geladeira até a próxima aula prática.

Na próxima aula prática, fazer a leitura considerando positivos os tubos com
presença de gás dentro do tubinho de Durham.
Se houver crescimento bacteriano e formação de gás dentro do tubo de Durham,
significa que o teste presuntivo foi positivo. Neste caso, os tubos positivos serão
utilizados para fazer o teste confirmativo e o teste para coliformes fecais.
Se não houver a formação de gás durante o período de incubação, o exame
termina nesta fase e o resultado do teste é considerado negativo. Estes tubos são
descartados.
Figura 1. Resultados possíveis do teste presuntivo.

4.1. Apresente os resultados do teste confirmativo.
Tubo Crescimento Produção de gás Resultado
microbiano
4.2. O que é coliforme?
4.3. Qual a função do tubo de Durham utilizado nesta análise?

4.4. Descreva a base teórica (fundamentação) do teste presuntivo.
4.5. Explique o motivo de utilizar-se a temperatura de 35 graus para o crescimento

de coliformes.
REFERÊNCIAS
BRASIL. Fundação Nacional de Saúde. Manual prático de análise de água. 2 ed.
Brasília, DF: Fundação Nacional de Saúde, 2006.
SANTOS, Gilmario Vilela; PURIN, Sonia; LEITE, Nei Kavaguichi. Análise
microbiológica de água subterrânea na bacia do Rio Marombas, SC. In:
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 23., 2013, Florianópolis, SC.
AULA 15
MICROBIOLOGIA DA ÁGUA:
TESTE CONFIRMATIVO E COLIFORMES FECAIS.
1. INTRODUÇÃO
A água potável não deve conter microrganismos patogênicos e deve estar livre de
bactérias indicadoras de contaminação fecal. Os indicadores de contaminação fecal,
tradicionalmente aceitos, pertencem a um grupo de bactérias denominadas coliformes.
O principal representante desse grupo de bactérias chama-se Escherichia coli.
A Portaria nº 518/2004 do Ministério da Saúde estabelece que sejam
determinados, na água, para aferição de sua potabilidade, a presença de coliformes
totais e termotolerantes de preferência Escherichia coli e a contagem de bactérias
heterotróficas. A mesma portaria recomenda que a contagem padrão de bactérias não
deve exceder a 500 Unidades Formadoras de Colônias por 1 mililitro de amostra
(500/UFC/ml).
A maioria das doenças veiculadas pelas águas tem sua origem na contaminação
fecal. Exemplos destas são: a febre tifoide (Salmonella typhi), a shigelose (Shigella), a
hepatite “A” de origem viral, os rotavírus, os polivírus, as gastroenterites (Salmonella) e
a cólera (Vibrio cholerae), além de parasitas como os protozoários Entamoeba
hystolytica e Giardia lamblia, que causam a disenteria. Seria praticamente impossível
investigar a presença de cada microrganismo patogênico que pudesse ser transmitido
pela água. Além do que, muitos deles são liberados em pequenas quantidades e às vezes
de forma descontínua. Tudo isto teria um custo elevado e levaria um tempo precioso na
determinação do contaminante. Assim, a opção foi escolher um microrganismo que
indicasse a contaminação da água com fezes e, portanto, a suspeita de conter
microrganismos patogênicos. O microrganismo escolhido foi a Escherichia coli. Ela é
constante no intestino humano e no de animais de sangue quente, é abundante nas fezes,
cresce facilmente em meios de cultura e vive bastante tempo na água. Outros grupos de
microrganismos também podem estar presentes nas fezes, como os enterococos
(Streptococcus faecalis) e bacilos (Clostridium perfringens), e têm sido sugeridos como
indicadores. Apesar de algumas desvantagens apresentadas pela Escherichia coli
(menor resistência à cloração e menor viabilidade na água do mar), suas vantagens em
relação aos outros indicadores são significativas.
A Escherichia coli faz parte de um grupo de microrganismos denominados
genericamente de coliformes, que inclui Enterobacter aerogenes, E. cloaceae,
Klebsiella e Citrobacter. Dentre os coliformes presentes nas fezes, a grande maioria é E.
coli (95%). À exceção dos coliformes fecais, os demais podem ser encontrados em
outros ambientes como solo, água e vegetais.
2. OBJETIVOS
Avaliar a qualidade de amostras de água pela análise da população de coliformes
totais e fecais.
- Teste confirmativo
a) tomar o número de tubos do Teste Presuntivo que deram positivos.
b) tomar igual número de tubos contendo o meio de cultura Caldo Bile Verde
Brilhante a 2%;
c) com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo
uma porção de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio de cultura
Caldo Bile Verde Brilhante.
d) identificar os tubos com o nome do grupo;
e) incubar durante 48 horas a 35ºC;
f) se no final do período de 48 horas houver crescimento bacteriano e formação de
gás dentro do tubo de Durham, o teste é considerado positivo. Caso não haja formação
de gás, o teste é considerado negativo.
Figura 1. Resultados possíveis do teste confirmativo.
Expressão dos resultados para coliformes totais

a) os resultados são expressos em NMP (Número Mais Provável)/100mL de
amostra.
b) para se determinar o NMP, verifica-se a combinação formada pelo número de
tubos positivos no Teste Confirmativo e consulta-se a Tabela 1.
Tabela 1. Número mais provável (N.M.P.) de coliformes quando se adotam 5 porções de 10mL de
amostra.
Número de tubos positivos Índice de N.M.P./100mL
0 <2,2
1 2,2
2 5,1
3 9,2
4 16,0
5 >16,0
Teste de coliformes fecais

a) tomar todos os tubos do teste presuntivo que apresentaram resultados positivos;
b) transferir, com alça de platina flambada e fria, uma porção para os tubos de
ensaio contendo meio de cultura EC na concentração de 37g/L;
c) incubar a 44,5º C durante 24 horas;
e) se no final de 24 horas ou menos houver a formação de gás, está indicado a
presença de coliformes de origem fecal;
Figura 2. Resultados possíveis do teste EC.
f) calcular o NMP de coliformes fecais da mesma maneira que calculado o de

coliformes totais, através da Tabela 1.
Apresentar o que foi observado a respeito da qualidade de cada amostra de água

com base em cada um dos testes realizados.
1. Apresente os resultados do teste confirmativo.
microbiano
5
2. Qual o número mais provável de coliformes totais na amostra testada?
3. Apresente os resultados do teste para coliformes fecais.
microbiano
4. Qual o número mais provável de coliformes fecais na amostra testada?
5. Dentro dos resultados observados, compare os dados com os padrões de

qualidade da legislação vigente. Baseados nesta comparação, vocês podem afirmar que
a amostra de água está dentro do padrão de qualidade exigido por lei? Caso não, quais
as possíveis causas desta alteração observada?
6. Com base na qualidade da água analisada em laboratório, você recomendaria

o seu uso com que finalidade?
7. Em que áreas da sua atuação como engenheiro(a) agrônomo(a) você acredita

que esta aula prática pode ser útil?
8. Descreva a base teórica (fundamentação) do teste confirmativo.

9. Descreva a base teórica (fundamentação) do teste de coliformes fecais.
10. Explique a função dos sais biliares no meio de cultivo usado para coliformes
totais.
11. Explique o motivo de utilizar-se a temperatura de 44,5 graus para o

crescimento de coliformes fecais.
REFERÊNCIAS
BRASIL. Fundação Nacional de Saúde. Manual prático de análise de água. 2 ed.
Brasília, DF: Fundação Nacional de Saúde, 2006.
SANTOS, Gilmario Vilela; PURIN, Sonia; LEITE, Nei Kavaguichi. Análise
microbiológica de água subterrânea na bacia do Rio Marombas, SC. In:
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 23., 2013, Florianópolis, SC.
AULA 16
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS:
QUALIDADE DO LEITE.
1. INTRODUÇÃO
O leite é um excelente meio de cultura para vários microrganismos. Ao ser
produzido é estéril, mas à medida que se desloca pelos canais das glândulas, pode
contaminar-se com microrganismos, cujos tipos são variáveis dependendo do animal do
qual é retirado. Algumas vezes, o leite pode conter microrganismos patogênicos
(Salmonella, Coxiella burnetti, Mycobacterium bovis, M. tuberculosis, Brucella
abortus) originários ou não do próprio animal.
A contaminação do leite pode continuar durante a ordenha, o transporte e o
armazenamento. Pessoas portadoras de infecções que participam da manipulação do
produto também podem representar fonte de contaminação. Assim, grandes populações
de microrganismos degradadores (Sreptococcus, Leuconostoc, Lactococcus,
Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus) podem estar presentes no leite. Grandes
populações são indicativas de que as características iniciais do leite foram modificadas
pelo crescimento microbiano. Assim, a qualidade do leite pode ser avaliada em função
de sua microbiota, fornecendo informações que refletem as condições sob as quais o
alimento foi produzido, beneficiado e/ou mantido (refrigeração e armazenamento
inadequado).
Vários procedimentos são utilizados para avaliação da qualidade do leite. Alguns
adotam conhecimentos práticos (teste da fervura e teste do álcool 70%), outros
empregam a atividade enzimática (teste da redutase) e há ainda, os que avaliam o
tamanho da microbiota (contagem em placa) ou a presença de grupos de
microrganismos (coliformes, salmonelas).
2. OBJETIVO
Avaliar a qualidade de amostras de leite através dos testes de fervura, álcool, azul
de metileno e contagem de bactérias.
3.1. Teste da fervura

O teste da fervura é o mais prático e rotineiro de todos. Ele se baseia no fato de
que o aquecimento reduz o pH. Se um leite se apresenta bastante alterado (pH baixo),
embora com aspecto físico normal, ele coagulará ao ser aquecido, pois o pH baixa ainda
mais.
Procedimento
- Colocar 5mL de leite em um tubo de ensaio;
- Levar à fervura;
- Observar se há ou não coagulação (no leite alterado ocorre coagulação).
3.2. Teste do álcool

O princípio deste teste é semelhante ao anterior, só que mais sensível. Além disso,
ele é particularmente útil na identificação de animais portadores de infecções sem
manifestações clínicas, como as causadas, por exemplo, pelo gênero bacteriano
Streptococcus. Animais infectados levam à coagulação do leite, neste teste, que pode
aparecer rapidamente ou demorar de 4 a 6 horas, quando as alterações são pequenas.
Procedimento
- Colocar 5mL de leite em um tubo de ensaio;
- Adicionar 5mL de álcool 70%;
- Observar se há ou não coagulação (no leite alterado ocorre coagulação).
3.3. Teste do azul de metileno

O crescimento de microrganismos no leite provoca o consumo do oxigênio
presente no meio. Esse fenômeno leva à produção de substâncias redutoras, diminuindo
o potencial óxido-redutor. Através de uma substância indicadora, é possível acompanhar
ou medir essa diminuição de potencial.
O corante azul de metileno é um exemplo de substância indicadora. Em sua forma
oxidada, ele apresenta a cor azul, e, em sua forma reduzida, ele é incolor. Quando
introduzido numa cultura bacteriana, ou em qualquer meio contendo bactérias, o azul de
metileno age como aceptor de elétrons, ou seja, sofre redução, tornando-se incolor. A
velocidade dessa transformação é diretamente proporcional à concentração bacteriana
no meio. É possível, dessa forma, avaliar a concentração microbiana no meio pela
adição desse corante e pela determinação do tempo de descoloração.
Tabela 1. Relação entre o tempo de descoloração do leite e o número de bactérias após a adição de azul
de metileno.
Tempo de descoloração UFC/mL Qualidade

Menos de 20 minutos >20 . 106 Péssima
20 minutos a 2 horas 4 . 106 até 20 . 106 Má
2 horas a 5,5 horas 5 . 105 a 4 . 106 Regular
Mais de 5,5 horas Menos de 5 . 105 Boa
Procedimento
- Pipetar em um tubo de ensaio, 10mL do leite a ser testado;
- Adicionar 1mL de azul de metileno (0,02%);
- Misturar e colocar na incubadora a 37ºC. Anotar o horário de início;
- Fazer a primeira leitura após 20 minutos e as seguintes, após 2 e 5,5 horas.
Considera-se um teste positivo, quando for detectada cor branca no tubo de
ensaio.
3.4. Contagem de bactérias

O procedimento é semelhante ao utilizado nas avaliações da água e do solo, e
apresenta as mesmas restrições. No entanto, para a comparação dos resultados, utilizam
se métodos padronizados. No Brasil e vários outros países, utilizam-se os
procedimentos do Compendium of Methods for the Microbiologial Examination of
Foods, da American Public Health Association.
Procedimento
- Preparar diluição seriada até 104.
- Inocular nas placas 0,1mL das diluições de 102 a 104, em três repetições.
- Incubar por dois a três dias a 30ºC.
- Realizar a contagem de UFCs.
Composição do meio de cultura padrão

15g de peptona de caseína
5g de peptona de soja
5g de NaCl
15g de ágar
1000mL de água destilada
Corrigir o pH para 7,1 a 7,5.
Meio padrão
Figura 1. Procedimento para análise de qualidade do leite por diluição seriada.
A Portaria Número 451, de 19 de setembro de 1997, da Secretaria de Vigilância

Sanitária do Ministério da Saúde, estabelece os critérios e os padrões microbiológicos
para alimentos expostos à venda no comércio ou de alguma forma dados ao uso e/ou
consumo. Ela estabelece a metodologia, número de amostras e o tamanho das unidades
a serem analisadas, as tolerâncias e os critérios recomendados.
Tabela 2. Resumo do Anexo I – Limites e tolerâncias para os diferentes tipos de leite.
Tipo de leite Salmonelas Coliformes Coliformes Contagem em

(ausência em) totais fecais placas (máximo)
NMP máximo NMP máximo
A 25 mL 1/mL Ausente 2.103/mL
B 25 mL 4/mL 1/mL 8.104/mL
C 25 mL 10/mL 2/mL 3.105/mL
A portaria integral pode ser encontrada no seguinte endereço eletrônico:

http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/451_97.htm#
Apresentar o que foi observado a respeito da qualidade de cada amostra de leite

com base em cada um dos testes realizados.
1. Com relação ao teste do azul de metileno, como foi classificada amostra de leite?
2. Qual a relação entre o tempo de mudança de coloração do azul de metileno (se

houver), com o tamanho da comunidade microbiana?
3. Qual a classificação do leite baseada na contagem de bactérias?
4. Há correlação entre os dois testes descritos acima? Se houver, descreva a correlação.

5. Os testes realizados são utilizados para aferição de qualidade em outros alimentos?

Quais?
6. Discuta quais práticas de manejo ou tratamento você, na condição de engenheiro

agrônomo, recomendaria para que a qualidade do leite estudado pudesse ser melhorada.
REFERÊNCIAS
MADIGAN, Michael T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. 10 ed.
Porto Alegre, RS: Artmed, 2012.

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APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS

MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA (CBA106)

PROFas GLÓRIA BOTELHO/ SONIA PURIN DA CRUZ

Aluno (a): _____________________________________________

AULA 01 - Introdução ao laboratório de microbiologia: BOAS PRÁTICAS

1. Regras de trabalho no Laboratório de Microbiologia.

Em um laboratório de microbiologia é imprescindível que algumas regras

1. Materiais e equipamentos básicos:

Tubos de cultura Placa de Petri Tubos de Durham

Figura 1. Vidrarias utilizadas no Laboratório de Microbiologia

Alça de platina Alça de Drigalski

Figura 2. Materiais usados para inoculação e repicagem de culturas microbianas.

 Equipamentos: Autoclave, microscópio, microscópio estereoscópio (lupa),

Autoclave Câmara de fluxo laminar Contador de colônias

Figura 3. Equipamentos utilizados para trabalhos no Laboratório de Microbiologia.

MÉTODOS DE CONTROLE DE CRESCIMENTO MICROBIANO

A grande capacidade dos microrganismos de multiplicação e utilização de nutrientes

Alguns termos são utilizados para o controle do crescimento microbiano:

Ainda quanto à terminologia, lembramos que:

O sufixo – cida significa tratamento que causa a morte direta de microrganismos.

Qual a ação dos agentes microbianos sobre as estruturas celulares?

O controle de crescimento de microrganismos é possível pela ação de agentes

• Temperatura (calor e baixa temperatura)

Formas vegetativas – procariotos 60-70C

Esporos bacterianos >100C

Esporos de fungos 60-70C

1.1.1. Calor úmido

Procedimento para o uso correto da autoclave:

Objetos que podem ser esterilizados:

OBS: Na indústria a autoclave é utilizada para esterilizar certas conservas alimentares

1.1.2. Calor seco

Esterilização por ar quente – Temperatura de 170C por 2h (ex: estufas)

Ex: Forno de Pasteur

Funcionamento do forno de Pasteur:

Curiosidade: Uso de controle do crescimento microbiano no solo.

Solarização - é a colocação de filme plástico transparente sobre o solo umedecido para

Figura 4. Uso de plástico para a prática de solarização.

Figura 5. Procedimento de esterilização por filtração.

• HEPA – (High Efficiency Particulate Air) – filtro de partículas de ar de alta

Figura 6. Processo de esterilização do ar com filtro de partículas de ar de alta eficiência em câmara de

Espectro de energia radiante

Figura 7. Espectro de radiações.

4. QUESTÕES A SEREM RESPONDIDAS

1. Completar o quadro abaixo com as vidrarias e instrumentos apresentados e seus

Vidraria/instrumento Finalidade de uso

2. Descreva dois exemplos de técnicas de esterilização e sua aplicação na

3. Descreva dois exemplos de técnicas de desinfecção e sua aplicação na

4. Cite e explique o princípio de funcionamento de dois equipamentos utilizados

5. Como Agrônomo(a), imagine que você precisa preparar 1000mL de solução de

6. Cite três finalidades de uso da autoclave em um Laboratório de Microbiologia.

Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em:

Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos

Outras classificações dividem os meios de cultura em:

diferenciação de enterobactérias e o Ágar sangue para verificar hemólise por espécies de

1.2. Métodos de Controle Químicos

Desinfetantes são agentes químicos capazes de destruir os microrganismos em

Utilização de agentes químicos:

 Detergente: É indicado para desinfecção de baixo nível. Indicado para

 Água sanitária: É indicada para desinfecção de médio nível de artigos ou

 Álcool: É indicado para desinfecção de alto nível. É usado na antissepsia