Boas práticas laboratorias

Microbiologia Teorico-Prático

 Classificação de meios de cultura quanto ao estado físico

- Líquido: os microrganismos multiplicam-se , mas não é possível a distinção e

separação de diferentes espécies de uma mistura.

- Sólido: possuem agar-agar (polissacarídeo) que é um agente gelificante ( a

temperatura inferior a 45ºC), possuem, geralmente 15g/L de agar não sendo
degradado pela maioria dos microrganismos e é possível a contagem de colónias
( permite a obtenção de culturas puras) e são utilizadas na multiplicação e
isolamento de estirpes.

- Semi-sólido: possuem uma menos quantidade de agar e permitem a mobilidade

dos microrganismos.

 Classificação quanto à composição

-Definidos ou sintéticos: são conhecidos ao pormenor todos os seus componentes

-Complexos : é desconhecida a composição química exata do meio.

 Classificação quanto à função:

- Gerais: permitem o crescimento de todo o tipo de organismos (ex: agar nutritivo)

- Enriquecido: adição de aditivos vegetais ou animais, permitindo o crescimento de
microrganismos fastidiosos ( exigentes a nível nutricional)
- Seletivos: possuem substâncias (inibidoras) que inibem o crescimento de alguns
microrganismos.
-Diferenciais: permitem o desenvolvimento/crescimento de vários tipos de
microrganismos permitindo que estes se diferenciem devido à sua capacidade de
metabolizarem componentes específicos do meio ou devido à morfologia das
colónias.

Meios de cultura:
- NA ( nutritivo Agar)
- MAS ( manitol salt agar)
- MRS( mon Rogosa e Sharpe Agar)
Trabalho prático nº1 – preparação e esterilização de meios de cultura
Objetivos:

- Conhecer os diferentes tipos e funções dos meios de cultura

-Preparar meios de cultura a partir de preparados comerciais desidratados

-Esterilizar os meios de cultura previamente preparados

Preparação de meios de cultura:

1) Pesagem: não é rigoroso mas existem certos componentes que conferem
seletividade ao meio( ex: antibióticos) que devem estar em concentrações
rigorosas.
2) Dissolução em água destilada/ desionizada: não pode possuir iões para que os
microrganismos se alimentem exclusivamente dos nutrientes existentes no meio
de cultura
3) Medir e ajustar o valor do pH : sempre feito de forma rigorosa com NaOH e HCl.
4) Destribuição por recipientes, se for o caso
5) Identificção com fita autoclave
6) Esterelização na autoclave: T=121ºC, P=1atm, t= 15 min
7) Retirar da autoclave; deixar arrefecer até ± 45 ºC (de preferência num banho),
distribuir por placas de Petri (ca. de 15 ml por placa), deixar solidificar, inverter
as placas e guardar a 4 ºC.

Trabalho prático nº 2
Inoculação de microrganismos: transferência assética

Objetivo - Inocular diferentes meios de cultura com culturas de microrganismos por

transferência assética

Manipulação de culturas bacterianas

Em microbiologia, a manipulação de microganismos deve ser executada num ambiente

assético, ou seja, num ambiente livre de contaminação (a área junto ao bico de Bunsen).

As ansas são um instrumento base para semear/inocular microrganismos. As mesmas

devem ser esterilizadas no bico de Bunsen antes e depois da inoculação.
Como fazer uma transferência assética a partir de uma cultura líquida:

1º - Agitar o tubo com a suspensão da cultura a inocular;

2º - Flamejar a ansa até ao rubro;

3º - Remover a tampa do tubo e flamejar a abertura do tubo;

4º - Arrefecer a ansa, com o cuidado de não tocar nas paredes do tubo, e retirar um pouco
de inóculo;

5º - Flamejar a abertura do tubo outra vez;

6º - Tapar o tubo e colocá-lo no suporte;

7º - Transferir asseticamente o inóculo para o novo meio de cultura (sólido ou líquido);

8º - Flamejar a ansa novamente até ao rubro e pousá-la encostada ao bico de bunsen

Métodos de inoculação de microrganismos

-Inoculação em meio liquido

Transferir asseticamente as culturas para caldo glucosado com ou sem tubo Durhan.

O tubo Durhan é utilizado para verificar se o microrganismo em causa liberta ou não CO2 durante o
seu crescimento. Se o tubo apresentar bolhas de ar significa que produz CO2 logo, usa a
fermentação para crescer. ( presente na E.coli)

Se o liquido do tubo ficar turvo significa que há presença de microrganismos em crecimento.

-Inoculação por estria em rampa de meio

Transferir asseticamente as culturas para Citrato de Simmons (partircularmente útil para o

crescimento de bactérias enterococos) fazendo uma estria à superfície do meio de cultura.

Nota: O Citrato de Simmons indica se a bactéria utiliza citrato como única fonte de carbono. A prova
é feita semeando-se a bactéria no meio sólido inclinado de citrato de Simmons, (contém azul de
bromotimol como indicador), o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde (negativa). O consumo do
citrato alcaliniza o meio e a cor do indicador altera para azul (positiva)

Se ficar azul significa que liberta CO2 (compostos alcalinos) – ocorre no uso de pseudomonas

Se permanecer verde significa que não faz respiração celular – ocorre no uso da E.coli

-Isolamento por estria em placa de Petri

Usado para criar colónias isoladas.

Transferir asseticamente as culturas para NA, riscando cuidadosamente no meio de cultura sólido
em placa (preste atenção à força com que aplica a ansa na superfície do agar, de forma a não o
rasgar).
-Inoculação em profundidade em meio sólido

-Para conservar, fazer isolamento.

-Os microrganismos com mais mobilidade movem-se para as paredes do tubo

-Procedimento utilizado para verificar se o microrganismo necessita de oxigénio

-Se o crescimento de microrganismos provocar fracturação do meio significa que não usa oxigénio
para sobreviver.

Trabalho prático nº 3 – Importância da desinfeção da bancada após derrame

biológico

Objetivo: - Consolidar a importância das boas práticas de laboratório (desinfeção de superfícies)

Procedimento:

1. Dividir a meio uma placa de meio NA (na superfície inferior) e identificar cada metade com
“antes” e “depois” da desinfeção.
2. Verter para um prato de plástico uma cultura de E. coli de 24 horas, simulando assim um
derrame biológico no laboratório.
3. Com uma zaragatoa, recolher uma amostra e passar na metade “antes” do meio de cultura
sólido NA.
4. Aplicar lixívia ou água sobre o derrame e deixar atuar 15 minutos.
5. Após o tempo, recolher uma nova amostra, com uma zaragatoa e passar na metade
“depois” do meio de cultura sólido NA.
6. Incubar a 37 ºC durante 24 horas
Trabalho prático nº 4 – Importância da lavagem das mãos

Objetivos: - Consolidar a importância da higiene das mãos

- Compreender a importância da lavagem das mãos após uma ida ao W.C.

- Neste trabalho prático será usada uma cultura de E. coli, bactéria usual no trato gastrointestinal,
estando presente em toda a região anal. Como meio seletivo será usado MacConkey Agar, que inibe
o crescimento dos microrganismos existentes na pele. Esta selectividade torna a visualização da
estirpe patogénica (E. coli) mais fácil, sendo assim possível fazer o estudo do grau de contaminação
através do papel higiénico, antes e após a lavagem das mãos

NOTA:

Meio MacConkey:

-Seletivo: Só crescem células Gram -, inibe o crescimento de microrganismos existentes na pele

-Deferencial: através da cor das colónias, consegue-se verificar se as células fermentam lactose

Procedimento experimental

1. Verter uma cultura de E. coli (com 24 horas) para uma placa de Petri contendo NA até cobrir
toda a superfície. Aguardar alguns minutos e, em seguida, rejeitar o excesso de cultura para
recipiente com lixívia.
2. Calçar luvas
3. Envolver o dedo em papel higiénico e tocar na superfície do NA contaminado, simulando
assim o uso do papel higiénico no W.C. Rejeitar o papel higiénico para desinfetante;
4. Dividir uma placa com meio de MacConkey em duas partes: numa das partes colocar o dedo
contaminado pressionando o agar;
5. Lavar os dedos como normalmente faria, secando depois em papel e colocar o mesmo dedo
na placa de MacConkey, agora na parte não utilizada;
6. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.

Trabalho prático nº 5 – Coloração de Gram

Objetivos: - Conhecer a morfologia de diferentes células bacterianas

- Diferenciar bactérias Gram positivo de Gram negativo

Introdução

-A coloração de Gram é um método de coloração diferencial, dado que se pode dividir as bactérias
em dois grandes grupos:

-Gram positivo: retêm o primeiro corante (cristal violeta)

-Gram negativo: não sendo capazes de reter o primeiro corante, retêm o segundo (safranina)

-Este facto deve-se à diferença na espessura da camada de peptidoglicano existente na parede

bacteriana.

Procedimento laboratorial

Preparação do esfregaço:

1. Limpar a lâmina com álcool a fim de a desengordurar e identificá-la;

2. Colocar uma gota de água no centro da lâmina;

3. Com uma ansa retirar um pouco de uma colónia isolada em meio de cultura sólido (grandes
quantidades têm efeitos negativos na visualização);

4. Com a ansa, estender a gota de suspensão sobre a lâmina, obtendo assim um esfregaço fino;

5. Deixar secar ao ar durante 30 a 60 segundos;

6. Segurando a lâmina com uma pinça, passar rapidamente a lâmina pela chama para fixar o material
(repetir 3 vezes, não aquecer demasiado para não alterar a forma das bactérias)

Coloração de Gram

1. Colocar a lâmina num suporte e cobrir a preparação com Cristal de Violeta. Deixar atuar
durante 1 min; Depois deste passo as bactérias ficam coradas de violeta
2. Cobrir a lâmina com Reagente de Lugol (solução iodada). Deixar atuar durante 1 min; O iodo
do reagente de Lugol liga-se ao violeta de cristal. O complexo formado é mais difícil de
remover. As bactérias ficam violeta escuro
3. Lavar com água destilada;
4. Lavar com Álcool; Neste passo ocorre uma alteração da parede celular; as bactérias Gram
negativo perdem o complexo cristal violeta-iodo, ficando incolores. As bactérias Gram
positivo retêm o complexo de cristal de violeta-iodo, ficando coradas de violeta escuro.
5. Lavar com água destilada
6. Cobrir a lâmina com a solução Safranina. Deixar atuar durante 30 s; Neste passo, as bactérias
incolores ficam coradas de cor-de-rosa (cor da safranina, também chamada contra-corante).
7. Lavar com água destilada e deixar secar;
8. Observar ao Microscópio Ótico. Usar a objetiva de imersão (x100); Não esquecer de colocar
o óleo de imersão!
9. Limpar a objetiva, retirando o excesso de óleo com papel e de seguida passar com álcool
Manuseamento com o microscópio ótico

1. Retirar a cobertura de segurança e proteção do microscópio;

2. Verificar a posição do diafragma e da platina (corrigi-las se necessário) e colocar a objetiva de

menor ampliação no trajeto da luz;

3. Colocar a preparação com a platina na posição inferior;

4. Subir a platina o mais possível;

5. Ligar a lâmpada do microscópio;

6. Adaptar a distância entre as oculares ao observador;

7. Para focar, começar com a objetiva de 10x;

8. Baixar lentamente a platina utilizando o parafuso macrométrico; observar nas oculares até
verificar a focagem da imagem;

9. Apenas com o olho direito aberto ajustar a focagem da imagem com o parafuso micrométrico;

10. Apenas com o olho esquerdo aberto ajustar a imagem ao nível da respetiva ocular;

11. Observando de lado, mudar para uma objetiva de maior ampliação;

12. Com o parafuso micrométrico ajustar a focagem;

13. Mudar para a objetiva de imersão:

I - Colocar em posição a objetiva de imersão (100x) e verificar que esta não toca na preparação;

II - Retirando a objetiva do trajeto da luz, colocar uma gota de óleo de imersão na preparação. Voltar
a colocar a objetiva de imersão;

III - Colocar o diafragma na sua posição máxima. Ajustar a intensidade da luz com o botão regulador.
Diminuir a posição do diafragma de modo a obter maior contraste;

IV - Se for necessário ajustar a focagem, usar com muita precaução o parafuso micrométrico.
 Trabalho prático nº6 – Pesquisa de Stephylococcus aureus no nariz
Objetivo - Conhecer e simular o isolamento de microrganismos presentes na cavidade nasal

Procedimento laboratorial

1. Acenda o bico de Bunsen antes de iniciar as operações;

2. Pegue numa zaragatoa esterilizada e embeba a ponta em soro fisiológico estéril, escorrendo-
a nas paredes do tubo;
3. Introduza a zaragatoa no nariz o mais profundo que conseguir, e rode-a nos dois sentidos;
4. Retire a zaragatoa do nariz e, perto da chama, toque com ela no canto de uma placa
comMSA;
5. Faça o isolamento com a ansa a partir da zona contaminada (ver figura 5);
6. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.
7. Após incubação, fazer coloração de Gram e teste da catalase às colónias suspeitas
(amarelas)

Teste da catalase:

- Colocar uma gota de peróxido de hidrogénio numa lâmina

- Com uma ansa retirar uma colónia a testar e colocá-la sobre a gota de peróxido de hidrogénio

- Considerar o aparecimento de efervescência como resultado positivo

- Usar como controlo positivo uma cultura de Staphylococcus aureus

Trabalho prático nº7 – Crescimento de microrganismos – Contagem de microrganismos

Objetivos - Compreender os diferentes métodos usados na determinação do crescimento dos
microrganismos

- Perceber o conceito de unidade formadora de colónia

- Uso da técnica de incorporação para a contagem de E. coli em placa

Contagem de microrganismos

- Contagem em placa

Método de contagem de microrganismos mais comum (Método Quantitativo de Sementeira em

Placa), que se baseia na relação teórica de que cada célula bacteriana origina uma colónia, o que
nem sempre é verdade. Portanto, o número de colónias que se formam, após incubação adequada,
é contado e corresponde a uma estimativa do número inicial de células bacterianas na amostra. Por
isso os resultados são normalmente expressos em termos de unidades formadoras de colónias (UFC)
Métodos de contagem em placa

1. Método de espalhamento
O número de células viáveis é estimado; um volume conhecido de uma suspensão de
microrganismos (0,1 ml), convenientemente diluída, é espalhado por uma placa com meio
de cultura previamente solidificado.

2. Método de incorporação
O número de células viáveis é estimado; um volume conhecido de uma suspensão de
microrganismos (1 ml), convenientemente diluída, é incorporado no meio de cultura ainda
líquido (temperatura de cerca. de 45 ºC).

3. Método da gota (Miles & Misra3)

O número de células viáveis é estimado; um volume conhecido de uma suspensão de
microrganismos, convenientemente diluída, é colocado numa placa com meio de cultura
previamente solidificado, sendo esse volume muito reduzido (0,02 ml)
Procedimento:

1. A partir de uma cultura de E. coli (obtida em NA no trabalho prático nº 2), retirar uma
colónia isolada e ressuspender a ansa em 10 ml de Ringer. Esta será a amostra,
correspondendo a uma diluição da colónia de 1:10 (10-1)
2. Fazer diluições decimais sucessivas da amostra em 9 ml de Ringer
3. Plaquear as quatro últimas diluições em NA usando o método de incorporação
4. Após solidificação do meio de cultura, inverter e incubar as placas 24h a 37 ºC.
5. Registar os resultados.
6. Determinar as Unidades Formadoras de Colónias por colónia (UFC/colónia), aplicando a
expressão fornecida
Leitura:

Selecionar a(s) placa(s) que contenha(m) entre 30 e 300 colónias. Contar todas as colónias.

Resultados:

Expressar os resultados em UFC/colónia, usando a seguinte fórmula:

N = Nº total de colónias / n x V x d

Em que:
n – número de placas selecionadas para a contagem
V – volume de inóculo
d – a diluição referente à(s) placa(s) selecionada(s)

Microbiologia TEÓRICO

Risco: probabilidade de ocorrência de um efeito adverso resultante da presença de um

perigo e da severidade desse efeito
Perigo: agente biológico, químico ou físico que pode causar um efeito adverso à saúde

Perigo biológico: Microrganismos (incluindo os geneticamente modificados, culturas de

células e endoparasitas humanos) suscetíveis de provocar infeções, alergias ou toxicidade
 Classificação de agentes biológicos por nível de risco infecioso

Grupo I – Nenhum ou baixo risco individual e coletivo

Exemplo: Lactobacillus Bulgaricus

Grupo II – Risco individual moderado, risco coletivo baixo

Exemplo: Salmonella Enteriditis

Grupo III – Alto risco individual, risco coletivo baixo

Exemplo: Salmonella Typhi

Grupo IV – Alto risco individual e coletivo

Exemplo: Vírus Ebola

Grupos de risco vs níveis de segurança biológica, práticas e equipamento

Equipamento de proteção coletiva e individual (EPI)

- Camara de segurança biológica classe 1: protege apenas a pessoa, mas não o produto

-Camara de segurança biológica classe 2: protege a pessoa e o produto porque o ar que ventila é
esterilizado (filtro HEPA)

-Camara de segurança biológica classe 3: com porta-luvas

EPI:

Manuseamento de resíduos

- Todos os materiais contaminados devem ser descontaminados antes de serem descartados ou

reutilizados (esterilizado em autoclave ou incinerado).

- Material cortante contaminado - agulhas hipodérmicas, facas e vidro partido; este material deve
sempre ser arrumado em recipientes munidos de tampas, antiperfurantes, e tratado como material
infecioso

- Micropipetas são usadas para medir volumes rigorosos, variáveis, podendo dispensar volumes na
ordem dos microlitros.
Química
Produtos químicos : perigoso, causando danos na saúde e no ambiente, armadilha mortal
quando não utilizados com as devidas precauções, é necessário identificar e avaliar riscos, informar e
formar os utilizadores.

-Substancias: Elementos quimicoa ou compostos, no seu estado natural ou produzidos (ex: O2,
H2O,NH3)

-Preparações: Misturas ou soluções compostas por duas ou mais substancias (tintas,etc)

Critérios Gerais de Classificação

- Propriedades físico-quimicas: Explosivas, comburentes, extremamente inflamáveis, facilmente

inflamáveis

-Propriedades toxicológicas: Muito tóxica, nocivo, corrosivo, irritante, sensibilidade

Rótulo: dá-nos informação relativamente ao conteúdo, aplicações, cuidados, eliminação de

resíduos e da embalagem e forma de utilização

Contém:

-Nome do fornecedor

-Nome do produto

-Pictogramas

-Palavras-sinal

-Frases de perido e precaução (H e P)

-Número CE

-Data de validae

-Concentrações

-Massa Molar

-Pureza (%)

Pictogramas:
Perigos físicos e para a saúde :
 1) Explosivo 6) Toxicidade aguda
2) Liquidos inflamáveis 7)Corrosivo cutâneo
3) Liquidos comburentes 8) Irritação cutânea
4) Gases comprimidos 9)Perigo de aspiração
5) Corrosivo para metais 10) Perigo para o ambiente aquático

Palavras sinal :

Informam-nos para o nível de risco, alertando para potencias perigos ( danger; warning)

-Frases P (prudência) : indicam precauções a tomar na utilização

- Frases H( perigo): indicam precauções a tomar na utilização

Ficha de segurança ( Material Safety Data Sheet)

- Identificação do produto e fabricante, composição, perigos, medidas a tomar em caso de incêndio

ou fugas acidentais, manuseamentos e armazenamento, propriedades físicas e químicas (…)
Soluções preparadas em laboratório – rótulo

-nome do composto / código

-concentração

-data de preparação

-nome de quem preparou

Sinalização de segurança

Vermelho: proibição, alarme, material de combate a incêndios (atitudes perigosas,pausas,

dispositivos de emergência , evacuações ,identificaçao , localização)

Amarelo: aviso (atenção, precaução, verificação)

Azul: obrigação (comportamentos específicos e obrigação de utilizar material de proteção individual)

Verde: salvamentos, socorro, segurança ( portas, saídas , vias, material, postos,…)

Armazenamento de reagentes- Regras básicas

- Local exterior ao labotarório, fresco e ventilado

-Fichas de segurança

-Ordenar de acordo com a perigosidade e incompatibilidade

- Stock mínimo necessário no interior do laboratório

-Nunca empelhar

-Ácidos separados das bases

-Ácidos concentrados em prateleiras inferiores

-Reagentes inflamáveis afastados das fontes de ignição

-Reagentes sensíveis à agua armazenados em locais secos ou exicadores

Resíduos laboratoriais

-Corrosivos - Tóxicos

-Reativos - Inorgânicos ( ácidos, bases e metais)

-Inflamáveis - Orgânicos(orgonoclorados,hidrocarbonetos, álcoois e cetonas, …)

Material de uso corrente

-Goblé

-Matraz ou Ertenmeyer

-Frascos de vidro

Material de medição rigorosa

-Bureta (volumes variáveia) :medir

-Pipeta volumétrica (volumes fixos) :medir

-Balão volumétrico (volumes fixos) . preparar

Material de medição não rigorosa

-Proveta: medir

-Pipeta graduada : medir

-Goblé : preparar

-Matraz : preparar

Frascos de vidro : armazenar

Material Volumétrico – Inscrições comuns

- marca ou fabricante

-capacidade máxima/ volume

-tolerância

-temperatura a que foi calibrado; tipo de calibração

-tipo de calibração (In ou Ex)

-classe

-tempo de escoamento

Erros comuns de leitura: leitura do menisco, medição de soluções quentes ou frias, material
inadequado ou sujo, formação de bolhas, controlo indevido da velocidade.
Tipos de calibração

In: a quantidade de liquido contido é exatamente a capacidade inscrita (ex: provetas, balões
volumétricos)

Ex: a quantidade de líquidos vertido é exatamente a capacidade inscrita (ex: pipetas graduadas e
volumétricas, buretas)

Classes:

A/AS : mais rigorosas ( A difere de AS devido ao tempo de escoamento)

B: menos rigorosas

Designação Capacidade Tolerância Classe Tempr.cali (ºC) Tempo escoa (s) Tipo IN ou EX

Proveta 10 ml +/- 0.15ml A 20ºC In

Pipeta volum. 10ml +/-0.02ml AS 20ºC 15 segundos Ex

Pipeta gradua. 5ml +/- 0.03ml A 20ºC 15 segundos Ex

Goblé 50ml

Bureta 25ml +/-0.030ml A 30 segundos Ex

Matraz 50ml In

Balão volum. 50ml +/- 0.06 A 20ºC In

Micropipetas: medem volumes rigorosos fixos ou variáveis

Manuseamento de buretas

Vinicial= 24,0ml Vfinal= 26,6ml

V= Vf-Vi = 26,6 – 24,0= 2,6 +/-0.030 ml

Balanças: localizadas numa bancada de base firme, livre de correntes de ar e nivelada.

-Analíticas: medição rigorosa de massas ( +/- 0.0001 ou +/- 0.00001)

- Precisão : medição menos rigorosa ( +/- 0.01)

Cuidados:

-temperatura

-sobrecargas

-janelas fechadas

Água para fins laboratoriais

Contaminantes:

-sais

-matéria orgânica

-partículas

-microrganismos

-gases dissolvidos

Classificações :

-Tipo 3 (destiliada/desionizada):

Aplicações- preparação de soluções ; análise corrente

Preparação- destilação simples por osmose inversa ou desionização

- Tipo 2 (biodestilada) :

Aplicações- análise de substâncias com concentrações vestigiais (espetroscópio e absorção

atómica)

Preparação- Redestilação da água tipo 3

-Tipo 1 ( ultra-pura) :

Aplicações – análises com exigências mais restritivas (cromotografia)

Preparação- a partir da água tipo 2 : osmose inversa; desionização seguida de filtração;

redestolação
Preparação de soluções
-Soluções padrão (concentração conhecida; ex: 6,012mol/L)

- a partir de uma substância sólida primária

- diluição a partir de uma solução liquida padrão

-Soluções não padrão (concentração aproximada; ex: 6,1 mol/L)

- a partir de sólidos

- a partir de liquidos

Preparação de soluções padrão

- A partir de sólidos:

-lavar material e secá-lo

- com a espátula, colocar o sólido no vidro de relógio e pesar na balança analítica

- verter para o goblé e colocar água desionizada

- verter para o balão volumétrico com ajuda de um funil e de uma vareta e encher até ao
traço de referência com a ajuda do conta gotas

- homogeneizar a mistura

- A partir de líquidos (por diluição):

-lavar matérias e secá-lo

- medir o volume com uma pipeta volumétrica

- Verter a solução para o balão volumétrico

- encher até ao traço de referência com a ajuda de um conta gotas

- homogenizar a mistura