Diagnóstico Laboratorial das doenças virais

Aula 05 -
Diagnóstico
Laboratorial das
doenças virais
Profª Drª. Liana Vilas Boas

Finalidade
Diagnóstico diferencial
Identificação de patógenos novos
Diferenciação de fases da doença
Triagem e avaliação de tecidos e órgãos
Imunidade pós vacinal
Vigilância Epidemiológica
Iniciar tratamento específico
Diagnóstico de doenças virais
• Genoma viral - PCR • ELISA
• Cultura celular para • Western Blotting
isolamento (Efeito citopático) • Imunofluorescência
• Microscopia eletrônica
• Detecção de antígeno viral –
Imunofluorescência (IF),
Ensaio imunoenzimático
(EIE)
Detecção Detecção
direta indireta
Diagnóstico de doenças virais
• Isolamento viral em hospedeiro

Métodos (cultura de células, ovos
clássicos embrionados, animais
• Sorologia
Métodos • Imunológicos
• Biologia molecular
rápidos • Microscopia eletrônica
Tipos de amostras clínicas
Tecidos Biópsia, sangue, raspados Todo material deve ser

acompanhado de uma
ficha clínica com dados
e histórico do paciente.
Urina, leite, soro, líquor
Fluidos (LCR), líquido sinovial,
líquidos cavitários
A depender da suspeita
clínica e da fase da
doença
Fezes, secreções,
Outros tipos lavados
Fase da doença
• Fase sintomática presente nos primeiros dias da
doença. Há replicação viral e, em muitos casos, ainda
Fase não houve produção de anticorpos.
• Pesquisa-se:
aguda: • Partícula do vírus;
• Antígeosno vírus ;
• Genoma viral na amostra clínica.
Após fase • Coleta de sangue para pesquisa de

aguda anticorpos.
Isolamento e identificação viral
Animais de laboratório
• Inoculação do vírus em animais de experimentação
Ovos embrionados
• Inoculação de vírus
Cultivo celular
• Cultivo de vírus
• Cada tipo de vírus exige uma cultura celular diferente
• Na cultura celular, as células são mantidas viva e em
multiplicação fora de seu tecido original e em condições
controladas
Cultura celular -Quando
começou?
Harrison (1907) e Carrel (1912) –
tecidos fragmentados.
Primeira linhagem – HeLa (câncer de

colo uterino)
• Herietta Lacks (1920 – 1951)
• A Vida imortal de Henrietta Lacks
Diversos tipos de câncer, desenvolvimento de vacinas

(Pólio), mapeamento de genes, tratamento de doenças.
Tuberculose, HIV e HPV.

Modelos de pesquisa para vacinas
Estudo de novas moléculas e

medicamentos
Propagação de microrganismos –
Vírus
Doenças degenerativas
Cultura
celular - Terapia celular
Aplicações
Vantagens
• Homogeneidade
• Controle da amostra
• Substitui uso de animais*
Desvantagens
• Matriz reduzida
Cultura • Sem arquitetura tridimensional
celular
Cultura celular
– Exemplos de
linhagens
Cultivo celular – Efeito
citopático
Para revelar a presença do vírus Reações das células na

na cultura célula presença do vírus:
• Efeito citopático: alterações que a • Picnose;
replicação viral causa à célula hospedeira • Apoptose;
• Imunofluorescência • Inclusões;
• Teste de neutralização • Formação de sincício;
• Hemadsorção: Quando o vírus possui • Vacuolização; Arredondamento;
glicoproteínas hemaglutinantes na sua • Lise.
estrutura do envoltório
Efeito citopático do poliovírus em células Vero
Efeito citopático do Vírus Sincicial Respiratório

Efeito
Efeito citopático do
HHV-1 em células Vero
citopático
Sorologia
Imunológico
• Essas técnicas permitem detectar antígenos virais (métodos diretos) ou

anticorpos (métodos indiretos/sorologia)
Imunofluorescência
ELISA direto (ED) ou Testes
direta (IFD) ou indireta
indireto (EI) imunocromatográficos
(IFI)
Direta
Detecção de
ANTÍGENOS
virais no interior das
Células.
Indireta
Detecção de
ANTICORPOS.
Imunofluorescência
Imunofluorescência
Controle negativo Controle positivo
Imunofluorescência indireta em células Vero E6 na presença de

anticorpo monoclonal AntiSARS-CoV-2, lâmina observada em
microscópio de fluorescência (x400).
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
- ELISA
Ensaio de imunoabsorção enzimática
Baseado na interação antígeno-anticorpo, o

ELISA vem sendo utilizado no diagnóstico
de várias doenças que induzem a produção
de imunoglobulinas, em especial para o HIV.
O que é necessário para fazer
ELISA?
Antígeno ou Anticorpo
Soluções-
anticorpo conjugado a
padrão
Purificado uma enzima
Substrato da Substrato da Leitor de

enzima enzima ELISA
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - ELISA
Imunocromatografia
Reação em Cadeira de
Polimerase - PCR
Diagnóstico e monitoramento da doença
Baseia-se na multiplicação in vitro de

fragmentos de DNA
Enzima termo-resistente (DNA polimerase

termo-resistente)
Reação da cadeia da polimerase
– PCR
PCR consiste na detecção e na

amplificação in vitro de regiões
específicas de ácidos nucleicos (DNA e
cDNA)
Reação da cadeia da polimerase – PCR
Desnaturação
• Aquecimento 92 - 95°C, 15 s
• Rompimento de pontes de hidrogênio e
abertura da dupla fita
Anelamento
• Incubação 50 a 60°C, 30 s
• Ligação dos primers nas regiões específicas
que se amplificar
Extensão
• 70 a 72°C, 1,5 min
• Ativação da Taq polimerase e síntese das
novas cadeias
Reação da cadeia da polimerase –
PCR
• Primers: identificação do local • MgCl2 e tampão da PCR:
correto do material a ser colaboração com a atividade da
amplificado polimerase
• dNTP’s (desoxirribonucleotídeos • Termociclador: controle das
fosfatados): síntese de novas temperaturas que levam à
cópias do material a ser amplificado desnaturação da molécula de DNA ou
• Taq polimerase (termoestável): cDNA, ao anelamento dos primers, e
síntese de novas cadeias de DNA ao alongamento/extensão das novas
ou cDNA cadeias de DNA
Reação em Cadeia de
Polimerase - PCR
Mg 2+ Taq Polimerase
Tampão 10x
COMPONENTES DA PCR
dCTP H20 Milli-Q:

Água ultrapura
dGTP
dNTP
dATP Iniciadores/primers:
Forward/Reverse
dTTP
Reação em Cadeia de Polimerase
Etapa 1: 1˚ Ciclo 2˚ Ciclo

DESNATURAÇÃO
94-96˚C por 30’
Etapa 3:
Etapa 2: POLIMERIZAÇÃO
ANELAMENTO 72˚C por 1min
50- 65˚C por 1min
Número de ciclos numa reação: 30 a 35

PCR Quantitativa
Na qPCR são utilizados 3 primers: Reto, reverso

e central;
O primer central tem fluorôfero e quencher;
Quando a enzima chega no primer central, o

fluorôfero é liberado, emitindo fluorescência;
A quantidade de fluorescência liberada é

proporcional à quantidade de modelo presente.
PCR Quantitativa
Cada vez que a região de interesse é

copiada, tem fluorescência liberada;
Quanto mais moléculas presentes para

copiar, mais fluorescência liberada;
A quantidade de fluorescência dobra

com cada ciclo; Termociclador com sistema óptico
composto por uma fonte de iluminação
ultra-violeta e um detector de
Essa fluorescência é detectado pelo
fluorescência + um computador com
computador;
software próprio para a aquisição de
dados.
Há uma leitura ao final de cada
PCR Quantitativa
ciclo;
Ao traçar a fluorescência contra

o número do ciclo, o instrumento
PCR em tempo real gera uma
curva de amplificação que
representa o acúmulo do produto
ao longo de toda a PCR;
O primeiro aumento significativo

na quantidade de produto
amplificado (Ct-thresholdcycle)
está relacionado à quantidade
inicial de amostra-alvo.
qRT-PCR
Western Blotting
Técnica que permite a identificação, quantificação e

detecção de proteínas, as quais são separadas por
eletroforese em gel e transferidas para uma
membrana adsorvente
Permite detectar, caracterizar e semi-quantificar
múltiplas proteínas, principalmente aquelas que
estão em baixas quantidades na amostra
Western Blotting
Etapas
• Extração das proteínas
• Eletroforese – SDS PAGE
• Transferência para membrana
• Bloqueio (com leite ou
albumina)
• Adição de anticorpos
específicos
• Detecção da reação (por
filmes de raios-X ou câmeras
especiais que obtêm imagem
digitalizada)
Western Blotting
Gel de acrilamida
Bloqueio
Transferência para membrana

Western Blotting
Indireto
Western Blotting
Detecção da reação

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Profª Drª. Liana Vilas Boas

• Isolamento viral em hospedeiro

Tecidos Biópsia, sangue, raspados Todo material deve ser

Após fase • Coleta de sangue para pesquisa de

• Inoculação do vírus em animais de experimentação

Primeira linhagem – HeLa (câncer de

Diversos tipos de câncer, desenvolvimento de vacinas

Tuberculose, HIV e HPV.

Estudo de novas moléculas e

Para revelar a presença do vírus Reações das células na

Efeito citopático do Vírus Sincicial Respiratório​

• Essas técnicas permitem detectar antígenos virais (métodos diretos) ou

Imunofluorescência indireta em células Vero E6 na presença de

Baseado na interação antígeno-anticorpo, o

Substrato da Substrato da Leitor de

Baseia-se na multiplicação in vitro de

Enzima termo-resistente (DNA polimerase

PCR consiste na detecção e na

dCTP H20 Milli-Q:

Etapa 1: 1˚ Ciclo 2˚ Ciclo

Número de ciclos numa reação: 30 a 35

Na qPCR são utilizados 3 primers: Reto, reverso

O primer central tem fluorôfero e quencher;

Quando a enzima chega no primer central, o

A quantidade de fluorescência liberada é

Cada vez que a região de interesse é

Quanto mais moléculas presentes para

A quantidade de fluorescência dobra

Ao traçar a fluorescência contra

O primeiro aumento significativo

Técnica que permite a identificação, quantificação e

Transferência para membrana

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