UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS DA SAUDE
ÁREA DE EPIDEMIOLOGIA DE AGRAVOS TRANSMISSÍVEIS E NÃO TRANSMISSÍVEIS

DETECÇÃO MOLECULAR E CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE

ARBOVÍRUS EM MOSQUITOS Aedes aegypti NA REGIÃO
METROPOLITANA DE CUIABÁ, MATO GROSSO

Doutoranda: Janaína Rigotti Kubiszeski

Orientadora: prof. Dr. Renata Dezengrini Slhessarenko

Cuiabá, 2024
 RESUMO
Arbovírus são vírus de RNA transmitidos por artrópodes hematófagos e, no Brasil, os gêneros Alphavirus,
Flavivirus e Orthobunyavirus estão entre os principais causadores de doenças em humanos no Brasil. No
ambiente urbano, o mosquito Aedes Stg. aegypti é o principal vetor de vírus como Dengue (DENV),
chikungunya (CHIKV) e Zika (ZIKV) e a expansão geográfica do mosquito implica no aumento do número
de casos, resultando em uma constante ameaça à saúde pública. A região metropolitana de Cuiabá, MT,
engloba uma variedade de fatores relevantes para a disseminação do mosquito Ae. aegypti, logo, o aumento
da transmissão de arbovírus. Assim, o objetivo deste estudo é investigar, por métodos moleculares, a presença
de arbovírus em mosquito Ae. aegypti coletados nos municípios de Cuiabá e Várzea Grande. Inicialmente,
armadilhas ovitrampa serão distribuídas por bairros de diferentes densidades demográficas e os mosquitos
adultos emergidos serão submetidos a extração de RNA e, então, à reação de multiplex RT-qPCR para deteção
de diferentes espécies de Flavivirus e Alphavirus e as amostras positivas serão sequenciadas nanoporos para
metagenômica viral. Serão calculados os índices de vetores que estimam a abundância de mosquitos e esses
índices serão correlacionados com variáveis climática e de ambiente. A partir desse estudo espera-se não só
compreender a dinâmica de transmissão de arbovírus em Cuiabá e Várzea Grande, mas também o processo
evolutivo dos vírus, de forma a fornecer ao sistema de saúde informações relevantes para o controle eficaz
de vetores e de prevenção de surtos na região.
Palavras-chave: Ovitrampa. Arbovirose. Vigilância. Dengue.
EQUIPE
Coordenadora: profª dra. Renata Dezengrini Slhessarenko
Alunos: Janaína Rigotti Kubiszeski;
 1. INTRODUÇÃO
Arbovírus são vírus transmitidos por artrópodes hematófagos, como mosquitos e carrapatos,
e incluem uma variedade de vírus com genoma RNA. As espécies pertencentes aos gêneros
Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus estão entre as principais causadoras de doença febril aguda
conhecida como arbovirose em humanos no Brasil (Vasconcelos et al, 1998).
Os arbovírus são mantidos na natureza em um ciclo enzoótico silvestre entre vetores
artrópodes e mamíferos como hospedeiros e reservatórios, no entanto, vírus como Dengue (DENV),
chikungunya (CHIKV) e Zika (ZIKV) não mais necessitam da manutenção enzoótica, e hoje são
responsáveis por epidemias urbanas em diversas regiões, em especial regiões tropicais, tendo o
mosquito Aedes Stg. aegypti como principal vetor urbano, e Aedes Stg. Albopictus em ambientes
peridomiciliares, e o ser humano como hospedeiro amplificador (Weaver; Reisen, 2010).
Diversos fatores estão envolvidos na emergência de arbovírus em ambientes urbanos, como
por exemplo, desmatamento, aquecimento global, transição de pessoas de ambientes florestais para
urbanos e a própria característica genética desse vírus que lhes permite expandir seu espectro de
hospedeiros e ampliar sua capacidade vetorial de transmissão (Anez et al, 2012; Lopes et al, 2014;
Weaver; Reisen, 2010).
O Brasil, que possui um dos maiores reservatórios de arbovírus do mundo na região amazônica
(Vasconcelos et al, 2001), tem uma considerável extensão de seu território localizada nos trópicos.
Como resultado, o país é endêmico para arbovírus, enfrentando surtos anualmente (OMS, 2023).
Esses eventos ressaltam a urgência de compreender a epidemiologia de diversos arbovírus para
preparar adequadamente estratégias voltadas para promoção da saúde pública e mitigar possíveis
epidemias. Por isso, a vigilância entomológica e epidemiológica configura um importante fator para
o combate às arboviroses e consequente controle de população de vetores (Lima-Câmara et al, 2016;
Taipe-Lagos et al, 2003). O entendimento da diversidade e das características evolutivas de arbovírus
circulantes em uma região contribuem para a compreensão de características epidemiológicas,
infecciosas e de transmissibilidade.
Assim, este trabalho tem o propósito de identificar os arbovírus circulantes na região
metropolitana de Cuiabá, e caracterizar o genoma destes vírus, colaborando com informações
relevantes para o monitoramento epidemiológico e, de forma indireta, com a elaboração de estratégias
de prevenção e controle de surtos eficazes, de maneira a reduzir seu impacto na saúde pública
regional.
 2. JUSTIFICATIVA

A adaptação dos arbovírus ao ambiente urbano resultou em uma ameaça constante à saúde
pública. Estima-se que o DENV causa entre 50-100 milhões de infecções por ano, sobretudo em áreas
tropicais, onde o desenvolvimento e tempo de vida de populações do mosquito vetor é favorecido
pelas temperaturas elevadas (Bhatt et al, 2013; Stanaway et al, 2016). A Organização Mundial da
Saúde estima que aproximadamente 40 mil mortes por ano sejam devidas ao Dengue, tornando-o o
arbovírus mais prevalente na América do Sul (OMS, 2020). Até abril de 2024, a OMS registrou 3,4
milhões de casos no mundo (WHO, 2024).
O cenário brasileiro não difere do mundial. Desde 2022, o país enfrenta epidemias sucessivas,
com predominância do sorotipo DENV-1. Em 2024, até a semana epidemiológica 26, mais de seis
milhões casos suspeitos de dengue foram notificados no país; além de 233.225 casos prováveis de
chikungunya e 8.519 de Zika. Os casos de dengue, chikungunya e Zika aumentaram gradativamente
nos últimos três anos, predominando nas regiões Sudeste, Sul e Centro-Oeste (além de Norte e
Nordeste para zika (BRASIL, 2024).
A transmissão dos arbovírus no Brasil envolve, principalmente, os mosquitos Ae. Stg. aegypti e
Ae. Stg. albopictus, ambos encontrados em praticamente todo o território brasileiro (Rufalco-
Moutinho et al, 2021; Ricas Rezende et al, 2020). Historicamente, a distribuição territorial desses
vetores está associada a ocorrência de arboviroses e estima-se o aumento de sua expansão territorial
nos próximos anos, com consequente aumento do número de casos de arboviroses (Leta, et al, 2018;
Laporta et al, 2023; Kraemer et al, 2019).
O Programa Nacional de Controle da Dengue tem, entre outros, o objetivo de estabelecer uma
vigilância entomológica e epidemiológica constante de arbovírus a fim de identificar os vírus
circulantes, as áreas com maior infestação vetorial, bem como maiores taxas de infecção por arbovírus
(Fundação Nacional De Saúde, 2002). De fato, estudos demonstram que a detecção de arbovírus em
mosquitos permite monitorar sua dinâmica de transmissão entre vetores bem como preparar o sistema
de saúde para controle de surtos, visto que mosquitos positivos são detectados positivos para
arbovirus semanas antes do início de surtos em uma região (Ndiaye et al, 2018; Rios et al, 2023). A
vigilância de arbovírus em mosquitos possibilita não só a identificação de novos arbovírus e
linhagens, mas também a detecção de potenciais mutações que amplifiquem seu fitness viral
(Crabtree et al, 2009; Gu et al, 2008).
O clima tropical do Brasil é favorável à proliferação de mosquitos e sua manutenção por períodos
mais prolongados, consequentemente, favorecendo a disseminação de arbovírus e a ocorrência de
surtos. O estado do Mato Grosso é particularmente propício à disseminação de arbovírus devido às
suas características territoriais e climáticas. A região abriga três biomas brasileiros - Amazônia,
Cerrado e Pantanal - e possui um clima quente e úmido equatorial, com estações de chuva e seca bem
definidas (Embrapa, 2024.). Essas condições criam um ambiente ideal para a reprodução e
disseminação de mosquitos transmissores de arbovírus. Com efeito, estudos demonstram a
diversidade de mosquitos no estado do Mato Grosso e em regiões próximas (Vieira et al, 2020;
Puavolid-Corrêa et al, 2013) assim como detecção de arbovírus diferentes de DENV, ZIKV e CHIKV
(Serra et al, 2016; Moraes et al, 2022; Vieira et al, 2019).
 3. OBJETIVOS

Investigar e caracterizar molecularmente espécies de Flavivirus e Alphavirus em mosquitos

da espécie Ae. Stg. aegypti e Ae. Stg. albopictus emergidos a partir de ovos coletados na região
metropolitana de Cuiabá.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Coletar ovos de Ae. Stg. aegypti e Ae. Stg. albopictus em bairros de Cuiabá e Várzea Grande
durante um ano epidemiológico;
 Analisar por PCR em tempo real pools de mosquitos para a detecção de espécies de Flavivirus
e Alphavirus;
 Calcular a taxa de infecção para os mosquitos detectados com arbovírus;
 Sequenciar, caracterizar o genoma e analisar filogeneticamente os arbovírus detectados;
 Calcular índices de positividade vetorial e densidade de ovitrampa, número médio de ovos e
índice de casas positivas a fim de estimar a abundância de mosquitos;
 Correlacionar as variáveis climáticas, demográficas, local de instalação da armadilha e casos
locais de arboviroses com os índices de vetores e avaliar a utilizaçãodes esses índices como
metodologia de predição de surtos de dengue.
 4. METODOLOGIA
4.1 ÁREA DE ESTUDO

A região metropolitana de Cuiabá está situada na região Centro-Sul do estado de Mato Grosso,
Centro-Oeste do Brasil, de clima tropical com médias de temperatura anual de 26.3 °C e pluviosidade
anual média de 1498 mm, caracterizado por uma estação chuvosa, de outubro a abril, e uma seca, que
se inicia em maio e perdura até setembro. Cuiabá é a capital do estado, com 650.877 habitantes
(IBGE, 2020). A região metropolitana de Cuiabá inclui a cidade vizinha, Várzea Grande, com 300.078
habitantes (IBGE, 2020). As cidades conurbadas contabilizam juntas 26% da população do estado, e
abrangem uma extensa área geográfica que engloba os biomas do Cerrado e Pantanal. Essa
diversidade geográfica e climática torna a região um local de interesse para o estudo e vigilância de
arbovírus.
Neste estudo observacional transversal, a seleção dos pontos de instalação das ovitrampas será
baseada em três critérios principais: densidade demográfica, histórico epidemiológico e tipologia do
uso do solo (público, comercial ou residencial). Previamente, serão obtidas autorizações para o
desenvolvimento do estudo junto à Secretaria Municipal de Saúde de cada município. O
CEUA/UFMT dispensa a autorização ética para estudos conduzidos com artrópodes. Neste estudo,
áreas de preservação ambiental sujeitas à licença ambiental (ICMBio, IBAMA) não serão incluídas.
Foram definidas cinco classes de densidade demográfica com base na quantidade de
habitantes por hectare (hab/ha): a) Baixa (0 a 11,4 hab/ha); b) Médio-baixa (11,05 a 28,76 hab/ha); c)
Médio-alta (28,77 a 57,39 hab/ha); d) Alta (57,40 a 86,02 hab/ha); e e) Muito alta (> 86,03 hab/ha)
(Figura 1 e 2; Quadro 1).
A cada ciclo de coleta mensal, três bairros de cada classe para cada município serão
selecionados aleatoriamente, e a armadilha será instalada na região central de cada bairro. Áreas
residenciais serão prioritárias devido à constante interação humana, mas pontos em áreas comerciais
e públicos também serão selecionados para garantir uma cobertura abrangente das diferentes áreas
urbanas. Será obtido consentimento escrito do residente no ponto de coleta.
Quadro 1 Relação de bairros do município de Várzea Grande de acordo com as classes demográficas
Classe demográfica (hab/ha) Bairros
23 de Setembro; Novo Mundo; Petrópolis; Primavera; Vitória
Baixa Régia; Capão do Pequi; Centro Norte; Ponte Nova; São Simão;
São Matheus; Paiaguás
Glória; Mapim; Jardim dos Estados; Ikaray; Costa Verde; Parque
Médio-baixa
do Lago; Marajoara; Canelas; Santa Izabel

Médio-alta Centro Sul; Cristo Reis

Adaptado do Plano Municipal de Saneamento Básico de Várzea Grande, MT (2014)

Figura 1 Mapa de abairramento do município de Várzea Grande
Figura 2 Mapa de abairramento do município de Cuiabá de acordo com a densidade demográfica
 4.2 COLETA DE E OVOS, CRIAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS MOSQUITOS

A coleta de ovos de será conduzida mensalmente, entre janeiro e dezembro de 2025. A

armadilha ovitrampa consiste em um frasco (11x12 cm) preto fosco de 800mL, com uma palheta de
madeira compensada (3 x 12 cm) presa verticalmente no interior por meio de um clipe com a
superfície rugoso voltada para cima. A armadilha será preenchida com 600mL de água destilada e
2mL de solução atrativa para mosquitos preparada com 10% de levedo de cerveja.
A ovitrampa será instalada no peridomicílio, ao abrigo da chuva e do sol, inacessíveis para
crianças e animais domésticos. Cada ovitrampa receberá um número de série, endereço e coordenadas
do Sistema de Posicionamento Global para facilitar a coleta e o gerenciamento de dados.
Após cinco dias, as armadilhas serão recolhidas e levadas para o laboratório; as palhetas serão
deixadas para secar por 24 horas. Em seguida, os ovos serão contados com auxílio de uma lupa, e
então imersos em água destilada para eclosão, em recipiente protegido com rede. Será adicionado
alimento para peixes ornamentais para nutrição das larvas, de acordo com o esquema demonstrado
no quadro 2, até os mosquitos adultos emergirem. As pupas serão removidas com auxílio de pipeta
de Pasteur e alocadas em recipiente plástico preenchido com água destilada e com tampa de proteção
para impedir a saída dos mosquitos adultos, os quais serão alimentados com solução de sacarose a
10% até a identificação.
Quadro 2: Esquema de nutrição
das larvas até mosquitos adultos
emergirem
Dia mg/larva
Eclosão 0,2
1 0,2
2 0,3
3 0,4
4 0,6
5 0,6
6 0,6
7 0,6

Os mosquitos adultos serão submetidos a resfriamento a 4°C por quatro minutos e serão
identificados com base na chave dicotômica de Consoli e Lourenço-de-Oliveira (1994); os mosquitos
serão agrupados em pools de até 25 indivíduos, de acordo com ponto de coleta, mês de coleta, espécie
e sexo, terão suas patas, asas e cabeça removidas, e serão armazenados a -80oC até o seu
processamento.
 4.3 DADOS METEREOLÓGICOS

Os dados de temperatura, umidade e precipitação serão obtidos do Instituo Nacional de

Meteorologia brasileiro e serão registrados no primeiro dia de instalação e no dia de retirada da
armadilha ovitrampa em cada ponto de coleta.

4.4 EXTRAÇÃO DE RNA VIRAL E MULTIPLEX RT-QPCR PARA ARBOVÍRUS

Os pools serão macerados em água ultrapura (0,4 mL) e centrifugados a 4.000 x g, 5 min a
4oC. O ácido nuclêico viral será extraído do sobrenadante (0,2 mL) utilizando o kit MagMax Viral
Pathogen (Applied Biossystems) de acordo com as instruções do fabricante, e imediatamente
submetido a protocolos padronizados no laboratório de virologia, para detecção simultânea de
arbovírus.
Para triagem dos pools, será inicialmente usado o protocolo Triplex CDC dengue zika
chikungunya que inclui como alvos regiões 5´UTR do vírus da dengue, ENV do Zika e NSP1 do
Chikungunya, além de região do gene endógeno da actina do gênero Aedes como controle interno. A
reação de multiplex RT-PCR em tempo real contém 10 µL de RNA, 12.5 µL de mastermix, primers
em concentração final de 1 µM, dengue probe a 0.3 µM, chikungunya probe a 0.15 µM, Zika probe a
0.15 µM, e água ultrapura nuclease-free nonDEPC para atingir volume final de 25 µL. A ciclagem
inclui a transcrição reversa (RT) a 50 °C for 30 min, inativação da RT/denaturação inicial a 95 °C por
2 min, e 40 ciclos de 95 °C 15 s, anelamento e detecção de fluorescência a 60 °C 1 min (Santiago et
al, 2018; Silva et al, 2024)
A segunda reação de Multiplex RT-qPCR incluirá iniciadores e sondas para detecção do vírus
do Nilo Ocidental (WNV, Env 70 bp) e encefalite de Saint Louis (SLEV NS1 68 bp) (Lanciotti; Kerst,
2001), e incluirá iniciadores 50 pmol cada primer e probe de SLEV, 1,25 uM de primers e 0,1875 uM
de sonda do WNV, mastermix, água ultrapura RNAse free nonDEPC qsp e 10 µL de RNA em volume
total de reação de 40 µL, de acordo com as recomendações do fabricante do Mastermix, ciclados a
50oC por 30 min para RT, 95oC 5 min para inativação da RT/denaturação inicial, 45 ciclos de 95oC
15 s, 60oC 1 m.
A terceira reação de multiplex qPCR para detecção de Mayaro e Oropouche, detecta regiões
dos genes NSP1 e Segmento S respectivamente desses arbovírus (Naveca et al, 2017) e inclui 300
nM de cada primer e 100 nM de cada probe, Mastermix, 5 uL de RNA e água ultrapura RNAse free
nonDEPC em 20 uL de volume final de reação, e ciclagem de 50 °C 5 min para RT, 95 °C 20 s para
inativação da RT e denaturação inicial, 45 ciclos of 95 °C for 3s e 60 °C for 30s.
Para os pools positivos para os sorotipos do vírus da Dengue, será utilizado o protocolo
descrito por Johnson et al., 2005, que detecta o DENV-1 (NS5 112 bp); DENV-2 (Env 23 bp), DENV-
3 (PrM 74 bp), DENV-4 (PrM 89 bp). As reações incluirão sondas marcadas com fluorófogos (FAM,
ABY, JUN e VIC), iniciadores, 5 µL de RNA, mastermix contendo DNTPs, tampão, enzimas RT e
DNA polimerase, em volume total de 25 µL, e serão cicladas conforme recomendações do fabricante
do Mastermix, ajustando-se a temperatura de anelamento/extensão aos primers ao protocolo universal
de qPCR (50 °C 20 min para transcrição reversa, 95oC 15 min, 40 ciclos de 94 °C 15 por s, 60°C por
40s).
Todas as reações, conduzidas no aparelho Quantistudio 5 (Applied Biossystems), serão
consideradas positivas quando as amostras apresentarem CT<38. Em todos os testes, serão incluídos
controles positivos e negativos para os vírus testados.

4.5 SEQUENCIAMENTO PORTÁTIL EM TEMPO REAL POR NANOPOROS PARA

METAGENÔMICA VIRAL E BIOINFORMÁTICA

Os ácidos nucléicos de pools de mosquitos serão randomicamente amplificados para vírus

pela metodologia Rapid SMART-9N. Após purificação do produto de DNA, quantificação e ligação
de adaptadores e barcodes (identificadores), o produto purificado será aplicado na flowcell no
dispositivo MinION Mk1B IT, e sequenciado pelo aplicativo MinKNOW.
As sequências geradas serão tratadas para remover sequências de primers, adaptadores e
barcodes, e gerar os contigs virais. Estes serão submetidos a BLASTn e BLASTx, alinhados a um
banco de sequências genômicas da espécie/família viral identificada, obtido do GenBank (NCBI).
Assim, caracterizaremos o genoma ou os genes dos vírus, as sequências dos genomas virais serão
verificadas manualmente com o programa Geneious (Biomatters, New Zealand). ORFs de genomas
virais e massa molecular de cada uma das proteínas virais identificadas serão preditas,
determinaremos os domínios de proteínas com os programas InterProScan e o Conserved Domain
Database. Também, identificaremos regiões transmembrânicas e peptídeo sinal com o TOPCONS
webserver. Motifs característicos serão identificados com o programa Geneious Prime baseado no
alinhamento em aminoácidos.
Para elucidar os processos evolutivos dos vírus identificados, alinharemos as sequências
previamente públicas com as geradas neste estudo utilizando MAFFT, visualizaremos e editadaremos
os alinhamentos no AliView. Depois, faremos análises filogenéticas de máxima verossimilhança (ML
- Maximum likelihood) usando IQ-Tree ou Geneious, com o modelo de substituiçaõ de nucleotid́ eos
determinado pelo Modelfinder ou MEGA.
Os suportes estatísticos das árvores filogenéticas serão calculados com ultrabootstrap com
1,000 réplicas. A análise do sinal evolutivo molecular temporal será realizada com o TempEst. Em
seguida, faremos as análises do relógio molecular bayesiano usando uma estrutura de bayesiana
flexível implementada no programa BEAST v.1.10.112 . Para determinar a inferência à cronologia, a
dispersão especial e a dinâmica populacional dos vírus, com modelos de coalescência bayesianos com
funções demográficas exponencial, constante, Skyline e Skygrid. As árvores filogenéticas serão
editadas no programa FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) para inclusão da escala
temporal baseada na sequência mais ancestral, além dos valores de suporte posterior. a partir do
alinhamento com a sequência de referência, serão ainda analisadas possíveis trocas de aminoácidos
(mutações sinônimas e não sinônimas).

4.6 TAXA DE INFECÇÃO

A taxa de infecção será calculada com a fórmula número de pools positivos/total de mosquitos
testados multiplicado por 1000 (Gu et al, 2004; Nasci; Mitchell, 1996).

4.7 ÍNDICES DE VETORES

A partir da vigilância de mosquitos utilizando as ovitrampas, serão calculados os seguintes índices

de vetores: índice de casas positivas, o qual refere-se à proporção de casas com ovitrampas positivas;
índice de positividade da ovitrampa, calculado a partir do número de armadilhas positivas com ovos
de Aedes sp. dividias pelo número total de armadilhas instaladas; índice de densidade da ovitrampa,
referente ao número médio de ovos de Aedes sp. por ovitrampa positiva (Sasmita et al, 2021).

4.8 ANÁLISE DOS DADOS

Os pools de mosquitos que testarem positivos para os arbovírus em qPCR e/ou

sequenciamento por nanoporos serão representados em um mapa utilizando o programa QGIS para
demonstrar os bairros com índices de maior positividade (QGIS.org 2024).
Todas as análises serão conduzidas usando a versão mais recente da plataforma IBM SPSS
(SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) em α = 0,05.
Para a associação de índices de vetores com número de casos de dengue será utilizado o
modelo estatístico de análise de regressão.
Os efeitos das variáveis climáticas (temperatura, umidade e precipitação) e o tipo de local de
instalação da armadilha (público ou residencial) serão analisados através do modelo linear
generalizado com distribuição logística. Por fim, para avaliar o impacto da densidade demográfica
será utilizado o modelo de regressão linear múltipla.
5. CRONOGRAMA

ATIVIDADES ANO 1 ANO 2 ANO 3 ANO 4

Submissão do projeto a agência de
X X
fomento

Disciplinas obrigatórias e optativas X X X X X

Coleta das amostras X X X X

Processamento das amostras X X X X

Sequenciamento X X

Avaliação dos resultados X X

Qualificação X

Redação do artigo para publicação X X X

Defesa X
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