Universidade Federal da Bahia

Instituto de Biologia

Curso de Ciências Biológicas

IDENTIFICAÇÃO MORFOLÓGICA E AVALIAÇÃO GÊNICA DO POTENCIAL

TÓXICO DE CIANOBACTÉRIAS NO DIQUE DO TORORÓ, SALVADOR - BAHIA

por

CYNTIA SIZÍLIO ANICETO

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao Instituto de Biologia da
Universidade Federal da Bahia como
exigência para obtenção do grau de
Bacharel em Ciências Biológicas.

Orientadores:
Profa. Dra. Taiara Aguiar Caires (Orientadora - Faculdade São Salvador)
Prof. Dr. José Marcos de Castro Nunes (Co-orientador - UFBA)

Salvador, Bahia
(2018)
Data da defesa: 31/07/2018

Banca examinadora

Drª. Taiara Aguiar Caires – Orientadora e Presidente da banca

Faculdade São Salvador

Drª. Helen Michelle de Jesus Affe

Jardim Botânico do Rio de Janeiro

Dr. Doriedson Ferreira Gomes

Universidade Federal da Bahia
 RESUMO

As cianobactérias pertencem a um importante grupo de procariotos com grande diversidade

morfológica e adaptativa, sendo organismos fotossintetizantes e produtores de metabólitos
secundários com propriedades farmacológicas e biotecnológicas que beneficiam a humanidade, mas
que também podem provocar graves problemas à saúde pública e ao meio ambiente devido à produção
de cianotoxinas. Estas toxinas podem acumular-se na cadeia trófica e causar graves efeitos biológicos,
sendo classificadas, a depender do órgão afetado, em hepatotoxinas, neurotoxinas e dermatotoxinas.
O aumento de compostos orgânicos na água, processo chamado de eutrofização, proporciona
condições para que ocorra uma proliferação de cianobactérias. Este fenômeno foi observado em um
importante corpo d’água da cidade de Salvador, Bahia, o Dique do Tororó. Amostra dessa
proliferação de cianobactérias foi coletada para identificação e cultivo, com o objetivo de analisar a
presença de genes produtores de cianotoxinas nas espécies presente. Para esta avaliação, foi utilizada
a prospecção gênica baseada em PCR e oligonucleotídeos iniciadores específicos (primers) para
detecção de genes codificadores das cianotoxinas. Os primers utilizados para detecção dos genes
codificadores de microcistina foram mcyD, mcyE e mcyG; para saxitoxina foram empregados sxt1,
sxtA e OCT; e para avaliar o potencial de produção de cilindrospermopsina foi utilizado o primer
Cynsulf. Foram identificados morfologicamente cinco gêneros de cianobactérias: Chroococcus,
Geitlerinema, Microcystis, Leptolyngbya e Phormidium, sendo possível o isolamento e cultivo de
Geitlerinema amphibium, Leptolyngbya tenerrima e Microcystis aeruginosa. Dentre as quatro cepas
analisadas, duas apresentaram genes codificadores de microcistina, sendo elas G. amphibium e L.
tenerrima. Esse estudo, além de demonstrar a diversidade de cianobactérias presentes na proliferação
de cianobactérias registradas no Dique do Tororó, em outubro de 2017, também evidenciou o
potencial tóxico de Geitlerinema amphibium e Leptolyngbya tenerrima ocorrentes neste ambiente,
dado a sua capacidade para produzir a toxina microcistina. A presença destes organismos
potencialmente tóxicos no referido corpo hídrico, serve de alerta para a tomada de decisão quanto à
limpeza e monitoramento, dado ao comprometimento da qualidade da água para os usos do Dique do
Tororó.
 ABSTRACT

The cyanobacteria belong to an important group of prokaryotes with great morphological and
adaptive diversity; they are organisms that produce secondary metabolites with pharmacological and
biotechnological properties, which can benefit humanity, but they can also cause serious problems
for public health and the environment due to production of cyanotoxins. These toxins can accumulate
in the trophic chain and cause severe biological effects, being classified, depending on the affected
organ, into hepatotoxins, neurotoxins and dermatotoxins. The increase of organic compounds in
water, a process called eutrophication, provides conditions for a proliferation of cyanobacteria. This
phenomenon was observed in an important water body of the city of Salvador, Bahia, the Dique do
Tororó. Sample of the cyanobacteria proliferation was collected for identification and cultivation,
with the objective of analyzing the presence of cyanotoxin producing genes in the present species.
PCR reactions were performed with specific primers for the detection of genes encoding cyanotoxins.
The primers used for microcystin detection were mcyD, mcyE and mcyG; to saxitoxin were used
sxt1, sxtA and OCT; and to cylindrospermopsin was used the primer Cynsulf. We identified
morphologically five genera of cyanobacteria: Chroococcus, Geitlerinema, Microcystis,
Leptolyngbya and Phormidium, being possible the isolation and cultivation of Geitlerinema
amphibium, Leptolyngbya tenerrima and Microcystis aeruginosa. Among the four strains analyzed,
two presented genes encoding microcystin, being G. amphibium and L. tenerrima. This study, besides
demonstrating the diversity of cyanobacteria presents in cell proliferation in water body, like bloom
event, the results also showed the toxic potential of Gleitlerinema amphibium and Leptolyngbya
tenerrima to produce microcystin. The presence of these potentially toxic organisms in the
aforementioned water body serves as an alert for decision making regarding cleaning and monitoring,
due to the impairment of water quality for the uses of the Dique do Tororó.
 AGRADECIMENTOS

Ao curso de graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal da Bahia. Agradeço a todos

os professores do Instituto de Biologia que fizeram parte da minha formação, em especial ao
coordenador do curso Gilberto Cafezeiro, à Drª. Nádia Roque e à Drª Rejâne Maria Lira da Silva.

Agradeço à Fundação de Amparo à pesquisa do Estado da Bahia (Projeto de Pesquisa em Redes –

RED 006/2012).

À minha orientadora Drª Taiara Aguiar Caires, por ser a melhor orientadora que eu poderia ter, pelo
exemplo de profissional, pela dedicação, empenho e ensinamentos. Muito obrigada por me mostrar
que o caminho no universo das cianobactérias não seria fácil, mas o processo seria gratificante!

Ao Prof. Dr. José Marcos de Castro Nunes (co-orientador), que disponibilizou o acesso ao
Laboratório de Algas Marinhas (LAMAR) para o desenvolvimento dos estudos.

Ao Dr. Eduardo Mendes da Silva, à Drª Suzana da Cunha Lima pela disponibilização do espaço do
Laboratório Maremba/UFBA e do LaBBiotec/UFBA para o estabelecimento do cultivo de
cianobactérias. À Dra. Alessandra Selbach Schnadelbch, coordenadora do LAGEV/UFBA por ter
disponibilizado toda a infraestrutura para a realização das análises moleculares, e ao Dr. Doriedson
Ferreira Gomes pela realização da coleta.

À Valter Loureiro, colega de curso e estagiário do Laboratório de Algas Marinhas – LAMAR, pelos
ensinamentos e por ser fundamental na realização desse trabalho. Obrigada pelo tempo e dedicação.

Aos Biólogos Rosa Daltro e Jansen Gaspar pela oportunidade de conhecer alguns mananciais da
Bahia, por toda atenção e ensinamentos no meu estágio supervisionado. Minha sincera gratidão!

Agradeço aos meus colegas de curso, que se transformam em bons amigos e compartilharem essa
trajetória, tornando esse processo muito mais divertido.

Agradeço aos meu pais, Hélio e Fátima, vocês são as pessoas mais importantes na minha vida e sem
vocês nada disso seria possível. Aos meu irmãos, Hélio e Flávia e aos meu sobrinhos, Arthur e
Beatriz.

À todos que os nomes não foram mencionados, mas que participaram dessa importante fase e
contribuíram para meu crescimento.

Por fim, agradeço a Deus, por ser minha base e dar sentido em tudo na minha vida.

i
 SUMÁRIO

RESUMO
ABSTRACT
AGRADECIMENTOS i
SUMÁRIO ii
1. INTRODUÇÃO GERAL 1
1.1. Área de estudo 2
2. OBJETIVOS 3
3. JUSTIFICATIVA 4
4. ORGANIZAÇÃO DO TRABALHO 4
5. CAPÍTULO 1 5
6. CONCLUSÕES 25
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 26
ANEXO A – Normas de formatação da Revista 29

ii
 1

1. INTRODUÇÃO GERAL

As cianobactérias pertencem a um grupo distinto de procariotos que apresentam

características similares tanto às bactérias quanto às algas. Apresentam uma considerável diversidade
morfológica, podendo ser unicelulares ou filamentosas, ocorrendo individualmente ou em colônias
(Calijuri et al., 2006). O sistema de classificação das cianobactérias mais recente foi proposto por
Komárek et al. (2014), o qual utiliza uma abordagem polifásica e divide a Classe Cyanophyceae em
oito ordens: Gloeobacterales, Synechococcales, Spirulinales, Chroococcales, Pleurocapsales,
Chroococcidiopsidales, Oscillatoriales e Nostocales.

A ordem Gloeobacterales, representada por um único gênero é caracterizada por não possuir
tilacoides. Synechococcales é um grande grupo com cepas unicelulares e filamentosas, agrupando-se
pela presença de tilacoides parietais. Quanto à ordem Spirulinales, caracteriza-se por típicos tricomas
espiralados sem bainhas. A ordem Chroococcales inclui formas cocoides e espécies não produtoras
de baeócitos. A ordem Pleurocapsales agrupa gêneros com base em sequências de DNA disponíveis,
células das espécies pertencentes a essa ordem forma baeócitos internamente. Chroococcidiopsidales
compreende um grupo de organismos que vive principalmente em habitats extremos. Já a ordem
Oscillatoriales inclui gêneros filamentosos com citologia complexa, além de morfotipos cocoides. A
ordem Nostocales, por sua vez, representa as cianobactérias filamentosas com morfologia
diversificada, com acinetos e heterocitos proeminentes, contendo cepas com ramificação verdadeira
ou falsa (Komárek et al., 2014)

A reprodução das cianobactérias ocorre de forma assexuada, por processos de fissão binária
ou múltipla, brotamento e fragmentação. Sua mobilidade está relacionada à expulsão de material
orgânico, pois não possuem cílios e flagelos. Algumas espécies apresentam vacúolos gasosos que
permitem controlar sua flutuabilidade, além de conseguirem desempenhar a fotossíntese em
ambientes de grande profundidade e inadequados para as células eucarióticas, pois possuem
ficocianinas e ficoeritrina como pigmentos acessórios. Nos ecossistemas de água doce, espécies que
habitam este ambiente, encontram as condições mais favoráveis para o seu desenvolvimento, como
alta concentração de fósforo e nitrogênio, pH entre 6 a 9 e temperaturas entre 15ºC e 30ºC (Calijuri
et al., 2006).

As cianobactérias são excelentes colonizadoras, podem ser planctônicas ou bentônicas, e

apresentam uma grande capacidade adaptativa em diversos ambientes, fato este decorrente das suas
características morfológicas e fisiológicas (Calijuri et al., 2006). A sua origem antiga, cerca de 2,5
bilhões de anos, estabilidade de tipos distinguíveis, capacidade de diversificação, adaptação a várias
 2

situações ecológicas e especificidades estruturais e metabólicas, fazem das cianobactérias um dos

grupos mais fascinantes de organismos (Komárek & Anagnostidis, 1998).

Pesquisadores de várias partes do mundo deram uma notória importância às cianobactérias

nos últimos anos, especialmente na área biotecnológica, devido aos seus benefícios e malefícios.
Esses organismos são fontes ricas de metabólitos secundários e são amplamente estudados pela sua
capacidade em sintetizar compostos bioativos com potencial farmacológico para a síntese de novas
drogas, com atividades antioxidante, antitumoral, antimicrobiana, além da produção de cianotoxinas
(Singt, et al., 2011; Vaz, 2014; Caires, 2017).

As cianotoxinas podem atingir um extenso conjunto de organismos, pois podem acumular-se

na cadeia trófica causando graves efeitos biológicos (Bittencourt-Oliveira & Molica, 2003). De
acordo com Calijuri et al. (2006), as causas para a produção de toxinas em cianobactérias são
amplamente discutidas, as quais podem estar relacionada à competição por recursos, às condições de
crescimento e também para proteção contra a predação. Mohamed (2013) evidenciou que espécies de
cianobactérias podem sintetizar compostos alelopáticos, como o antialgal norharmane, que apresenta
efeitos de inibição de crescimento em outras espécies de cianobactérias.

De acordo com sua origem e forma de dispersão no ambiente, as toxinas podem ser
classificadas em: endotoxinas, que constituem a parede celular e são liberadas quando as células
sofrem lise, sendo fatais em grandes concentrações, como exemplo o lipopolissacarídeo (LPS),
considerado dermatotóxico, podendo causar inflamação, coagulação e febre. A segunda categoria é
formada pelas exotoxinas, proteínas altamente específicas, são compostas pelas neurotoxinas,
saxitoxinas, citotoxinas e hepatotoxinas, sendo as toxinas mais poderosas. A contaminação por
cianotoxinas pode ocorrer por diversas formas: inalação, contato dermal e ingestão de água (Calijuri
et al., 2006). No Brasil, há relatos de contaminação por cianotoxinas, mas muitos não foram
devidamente comprovados (Bittencourt-Oliveira & Molica, 2003).

1.1. Área de Estudo

O Dique do Tororó localiza-se no centro da cidade de Salvador, Bahia, (latitude: 12º59’4’’

S; longitude: 38º30’21’’ W), é uma lagoa com forma estreita e alongada, de dimensão correspondente
a 11,5 hectares de espelho d’água e 25 mil m2 de área verde (Fig. 1). De acordo com o Sistema de
Áreas de Valor Cultural e Ambiental de Salvador (SAVAM) e a Resolução n. 357/2005 do
CONAMA, o Dique está classificado em Espaços Abertos de Recreação e Lazer, na subcategoria de
Espaços Abertos Urbanizados (EAU) e sua água é classificada como água doce de classe III, que
pode ser destinada à pesca amadora à recreação de contato secundário e à dessedentação de animais.
 3

No passado, já possuiu limites mais amplos, pois cerca de dois terços de sua área original foi aterrada
pela população e pelas autoridades em função de obras públicas (Oliveira, 2007; Santos et al., 2010).
Uma conclusão elaborada sobre a origem de suas águas é inexistente, pois alguns autores afirmam
que são provenientes de nascentes das encostas ou do fundo do seu leito, enquanto outros relatos
afirmam que o Dique é obra dos holandeses para proteger a cidade de invasões (Oliveira, 2007;
Dourado, 2009). O Dique assumiu diversas funções ao longo do tempo, sendo elas: práticas
esportivas, via de acesso através dos barcos, receptor de esgoto doméstico, depósito de lixo e fonte
de alimento, sendo fornecedor de peixes para a população de baixa renda. Apesar da sua importância,
é uma área marcada por longos períodos de negligência, sendo alvo constante de estudos
diversificados das mais distintas áreas do conhecimento, como a importância da vegetação na
paisagem, suas nascentes, a qualidade da água, sua importância cultural e para a prática religiosa
(Oliveira, 2007; Dourado, 2009; Santos et al., 2010; Silva et al., 2011). Um estudo realizado por Silva
et al. (2011), revelou que as concentrações de nutrientes no Dique do Tororó apresentavam valores
acima dos limites estabelecidos pela Resolução n. 357/2005 do CONAMA para água doce de classe
III, estando relacionados a fontes de lançamentos de esgotos na lagoa, tornando este ambiente
eutrofizado.

Fig 1. Imagem aérea do Dique do Tororó. Fonte: https://hiveminer.com

 4

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o potencial gênico para síntese de cianotoxinas nas espécies identificadas em um

evento de proliferação de cianobactérias no Dique do Tororó, Salvador, Bahia.

2.2 Objetivos Específicos

a. Identificar as espécies de cianobactérias ocorrentes em um evento de proliferação de

no Dique do Tororó, Salvador, Bahia;

b. Investigar a presença dos genes envolvidos na biossíntese de microcistina (mcyD,

mcyE e mcyG), saxitoxina (sxtA e sxtI) e cilindrospermopsina (cyrJ) destas espécies
mantidas em cultivo;

c. Ampliar o conhecimento sobre cianobactérias em ambientes dulciaquícolas de áreas

urbanas.

3. JUSTIFICATIVA

O Dique do Tororó sofreu diversas ações antrópicas negativas e se transformou em um

ambiente eutrofizado de acordo com estudos anteriores, sendo assim, propício ao desenvolvimento
de florações de cianobactérias e à ocorrência de eventos de intoxicação por cianotoxinas pela
população e pelos animais que frequentam este local. Sendo assim, faz-se necessário identificar os
eventos de florações tóxicas de cianobactérias, pois eles provocam graves problemas à saúde pública
e ao meio ambiente. A detecção precoce de cianotoxina pode ser realizada através de técnicas da
biologia molecular, como a PCR (reação de cadeia da polimerase), a qual utiliza oligonucleotídeos
iniciadores específicos para a sequência de genes envolvidos na produção destas toxinas, sendo
possível analisar se as cepas presentes são potencialmente tóxicas.

4. ORGANIZAÇÃO DO TRABALHO

O presente trabalho de conclusão de curso está estruturado em um capítulo no formato de

artigo, intitulado “Avaliação do potencial gênico tóxico em grandes adensamentos de cianobactérias
em um corpo d’água urbano”, que será submetido ao periódico Rodriguésia.
5. CAPÍTULO 1

Avaliação do potencial gênico tóxico em grandes adensamentos de cianobactérias em um

corpo d’água urbano

Cyntia Sizílio Aniceto1, Valter Loureiro1, José Marcos de Castro Nunes1, Taiara Aguiar Caires1

1
Universidade Federal da Bahia, Instituto de Biologia. Departamento de Botânica, Laboratório de
Algas marinhas (LAMAR). Rua Barão de Jeremoabo s/n – Ondina. Cep: 40.170-115 – Salvador,
Bahia, Brasil.

[email protected]

Nome da revista: Rodriguésia (Revista do Jardim Botânico do Rio de Janeiro)

Homepage do periódico: http://rodriguesia.jbrj.gov.br

5
 6

Avaliação do potencial gênico tóxico em grandes adensamentos de cianobactérias em um

corpo d’água urbano

Cyntia Sizílio Aniceto1*, Valter Loureiro1, José Marcos de Castro Nunes1, Taiara Aguiar

Caires1

1
Universidade Federal da Bahia, Instituto de Biologia. Departamento de Botânica,

Laboratório de Algas marinhas (LAMAR). Rua Barão de Jeremoabo s/n – Ondina. Cep:

40.170-115 – Salvador, Bahia, Brasil.

Apoio Financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (Projeto de Pesquisa

em Redes – RED 006/2012).

Cyntia Sizílio Aniceto / [email protected]

Morfologia e análise de cianotoxinas

Autor para correspondência: [email protected] (Cyntia Sizílio Aniceto)

 7

Resumo

Avaliação do potencial gênico tóxico em grandes adensamentos de cianobactérias em um corpo

d’água urbano

O filo Cyanobacteria é constituído por um grande grupo de procariotos responsáveis pela

conversão anóxica da atmosfera através da fotossíntese, liberando oxigênio. Devido à produção

de cianotoxinas, algumas espécies podem causar graves efeitos a outros organismos. Alguns

ambientes aquáticos que sofrem distúrbios abióticos, como a eutrofização, são propícios a

ocorrência de proliferação de cianobactérias que podem causar desequilíbrios ecológicos e

alteram as propriedades da água, além de representar graves riscos à saúde pública. Um

fenômeno desse tipo foi verificado no Dique do Tororó, uma lagoa urbana, no centro de

Salvador – BA, de uso recreativo público. Devido às implicações que esses organismos podem

provocar, foram analisadas a presença de genes produtores de cianotoxinas através de extração

de DNA e reações de PCR nas espécies identificadas. Cinco táxons de cianobactérias foram

identificados: Chroococcus sp., Microcystis aeruginosa, Phormidium sp., Geitlerinema

amphibium e Leptolyngbya tenerrima. As duas últimas apresentaram resultados positivos

quanto a detecção de genes (mcyE e mcyG) codificadores de microcistina. The presence of

potentially microcystin-producing strains on the site reveals the importance of implementing

projects that aim to maintain the ecological balance of the site, avoiding possible damages to

public health and the environment.

Palavra-chave: cianotoxinas, espécies nocivas, prospecção gênica, saúde pública.

 8

Abstract

Evaluation of toxic gene potential in large cyanobacterial densities in an urban water body

Phylum Cyanobacteria is constituted by a large group of prokaryotes responsible for the anoxic

conversion of the atmosphere through the photosynthesis processes that release the oxygen.

Due to the production of cyanotoxins, some species can cause serious effects on other

organisms. Some aquatic environments suffering from abiotic disturbances, such as

eutrophication, are prone to the occurrence of cyanobacterial proliferation that can cause

ecological imbalances and alter the properties of water, and pose serious public health risks. A

phenomenon of this type was verified in Dique do Tororó, a lagoon urban, in the center of

Salvador - BA, of public use, Due to the implications that these organisms can induce, the

presence of cyanotoxin-producing genes was analyzed through DNA extraction and PCR

reactions in the identified species. Five taxa of cyanobacteria were identified: Chroococcus sp.,

Geitlerinema amphibium, Leptolyngbya tenerrima, Microcystis aeruginosa and Phormidium

sp. Two species, G. amphibium and L. tenerrima showed positive results regarding the detection

of microcystin toxin.

Keywords: cyanotoxins, genetic prospection, harmful species, public health.

 9

Introdução

O filo Cyanobacteria é constituído por um grande grupo de bactérias fototróficas

oxigênicas que apresentam grande diversidade morfológica e ecológica (Madigan et al. 2016).

Algumas espécies de cianobactérias podem causar graves danos aos animais e à saúde pública

por produzirem metabólitos secundários com propriedades tóxicas, as denominadas

cianotoxinas (Carneiro et al. 2007). De acordo com Fiore et al. (2011), se essas toxinas forem

incorporadas pelo consumo de água ou alimentos contaminados, podem causar graves efeitos

biológicos, sendo classificadas como: hepatotoxinas (microcistinas e nodularinas),

neurotoxinas (saxitoxinas, anatoxina-a, anatoxina (S) e homoanatoxina-a), citotoxinas

(cilindrospermopsina), toxinas irritantes e gastrointestinais (aplisiatoxina,

debromoaplisiatoxina e lynbyatoxina), endotoxinas e outras cianotoxinas, cujos perfis

toxicológico e ecotoxicológico necessitam de maior compreensão.

Ambientes aquáticos que recebem grande aporte de nutrientes provenientes de esgotos

domésticos, industriais ou fertilizantes agrícolas, se transformam em ambientes eutrofizados,

propícios ao crescimento acelerado de cianobactérias (Souza 2006). Vários fatores bióticos e

abióticos, que se relacionam sinérgica ou antagonicamente, favorecem a ocorrência de

florações, como: disponibilidade de luz, estabilidade da coluna d’água, altas temperaturas,

maior tempo de residência das águas, declínio da herbivoria devido à produção de biotoxinas e

morfologia das cianobactérias (Fernandes et al. 2009). Algumas cianobactérias possuem

aerótopos, vesículas gasosas que possibilitam a flutuação e permanência da célula na superfície

da água. Quando estes organismos formam um extenso adensamento celular, podem mudar a

coloração da água e formar camadas espessas na superfície. Além da produção de cianotoxinas,

as florações podem causar desequilíbrios ecológicos mudando as propriedades organolépticas

da água (cor, odor e sabor desagradável). (Bittencourt-Oliveira et al. 2001; Souza 2006).
 10

O Dique do Tororó é um lago natural, apesar da sua origem ser bastante discutida, possui

uma área de 110.000 m2 utilizada como espaço de recreação e lazer, localiza-se no centro da

cidade de Salvador, Bahia, é um ambiente que sofreu diversas ações antrópicas, como

aterramentos na sua área, também recebeu durante muitos anos, esgoto sanitário sem nenhum

tratamento associado às águas pluviais (Dourado 2009; Santos et al. 2010). Por ser um local de

acesso e uso público, faz-se necessário a detecção precoce de cianobactérias tóxicas para que

ações corretivas e de controle tenham êxito, pois grandes adensamentos de cianobactérias

podem causar graves inconvenientes para a população e para os animais, como: forte odor,

alteração nas propriedades da água, comprometendo a importância do local como ponto

turístico, riscos de intoxicação e alteração no equilíbrio ecológico do ambiente. Sendo assim, o

presente trabalho avaliou, através de análises de prospecção gênica, o potencial genético para

produção de cianotoxinas de populações de cianobactérias coletadas em um evento de grande

adensamento celular no Dique do Tororó, tendo como finalidade inferir se as espécies

identificadas apresentam riscos para a saúde pública quanto ao seu potencial tóxico.

Material e Métodos

As cianobactérias foram coletadas no mês de outubro de 2017, na superfície da coluna

de água do Dique do Tororó, Salvador – Bahia. A amostra continha um grande adensamento de

cianobactérias, característico de uma floração, entretanto, a densidade celular não foi realizada

para corroborar a ocorrência desta. Uma alíquota desta amostra foi acondicionada para cultivo.

Identificação, isolamento e cultura

As cepas foram analisadas sob um microscópio de luz, equipado com uma câmera

digital QImaging GO-3 (Olympus CX31RTS5®, Tóquio, Japão), realizou-se a análise

morfométrica de 20 células por colônia ou filamentos de cada cepa, através do software

AxioVision 4.8®. Após a identificação morfológica, as cepas foram isoladas para cultura através
 11

do método de seleção por capilar, para os exemplares cocoides, e pescaria, para os organismos

filamentosos. Todas as etapas foram realizadas em câmara de fluxo laminar. Os exemplares

isolados foram inoculados em meio líquido BG-11(Rippka 1979). Cada cultura uniespecífica

foi mantida em tréplicas, cultivadas sob fotoperíodo de 14:10 h (claro:escuro), com irradiação

de 30 µmol fótons m-2 s-1 a 25 ± 1ºC de acordo com Jacinavicius et al. (2012). As cepas foram

preservadas no Laboratório de Monitoramento, Avaliação e Reabilitação de Ecossistemas

Naturais e Artificiais do Estado da Bahia (MARENBA – IBIO/UFBA) e as alíquotas foram

depositadas e preservadas em formol 4% no herbário Alexandre Leal Costa (ALCB - UFBA).

Prospecção gênica de cianotoxinas

A detecção dos agrupamentos gênicos codificadores de cianotoxinas foi baseada em

PCR utilizando o DNA genômico extraído das cepas. Para esta extração, as cepas mantidas em

cultivo foram maceradas de acordo com Fiore et al. (2000) para Microcystis aeruginosa, e pelo

método CTAB (Doyle & Doyle 1987), para as cepas filamentosas. A detecção dos

agrupamentos gênicos para a produção de microcistina foi realizada pela investigação da

presença dos genes mcyD, mcyE e mcyG (Rantala et al. 2004). O marcador mcyD codifica para

uma enzima do grupo PKS (policetídeo sintase tipo 1), responsável pela reação da síntese da

microcistina, enquanto os marcadores mcyE e mcyG codificam para enzimas do grupo NRPS

(Peptídeo Sintetase Não Ribossômica) e PKS, sendo consideradas híbridas (Tillet et al. 2000).

O fragmento gênico mcyD foi amplificado através do conjunto de oligonucleotídeos

iniciadores mcyDF/mcyDR (5’ -GATCCGATTGAATTAGAAAG – 3’/5’ -

GTATTCCCCAAGATTGCC- 3’), cujo tamanho do produto estimado é 818 pb. Para o gene

mcyE utilizou-se mcyEF2/mcyER4 (5’ -GAAATTTGTGTAGAAGGTGC- 3’/5’ -

AATTCTAAAGCCCAAAGACG- 3’), com tamanho estimado de amplificação entre 809 pb a

812 pb, (Rantala et al. 2004). Para o agrupamento gênico mcyG, foi utilizado o conjunto de
 12

oligonucleotídeos mcyGF/mcyGR (5’ -GAAATTGGTGCGGGAACTGGAG- 3’/5’-

TTTGAGCAACAATGATA- 3’), cujo produto de amplificação possui tamanho estimado entre

385 pb e 560 pb (Fewer et al. 2007). A amplificação dos três conjuntos de primers ocorreu nas

seguintes condições: um ciclo de 3 min a 94ºC; 30 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 56ºC e 1 min a

72ºC, e extensão final de um ciclo de 10 min a 72ºC.

O potencial de produção da saxitoxina foi verificado através do gene sxtA, que foi

amplificado pelos primers sxtA-F (5’ -GGACTCGGCTTGTTGCTTC- 3’) e sxtA-R (5’ -

CCAGACAGCACGCTTCATAA- 3’), com as seguintes condições: um ciclo de 5 min a 94ºC;

35 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 60,2ºC, 30 s a 72ºC, e extensão final de 7 min a 72ºC. O tamanho

estimado do produto amplificado é de 200 pb (Hoff-Risseti et al. 2013). O marcador genético

sxtA codifica para uma enzima do grupo PKS (Moustafa et al. 2009). O gene sxtI, considerado

exclusivo para cepas produtoras de saxitoxinas, foi amplificado pelo conjunto de

oligonucleotídeos iniciadores sxt1-F/sxt1-R (5’ -GCTTACTACCACGATAGTGCTGCCG-

3’/5’ -GGTTCGCCGCGGACATTAAA- 3’). As etapas da amplificação para este primer

foram: um ciclo de 34 min a 94ºC; 30 ciclos de 10 s a 94º C, 20 s a 55ºC, 1 min a 72ºC, e

extensão final de 7 min a 72ºC, com produto de amplificação estimado em 1.669 pb. Para

amplificar esta região gênica, também foi utilizado o conjunto iniciador OCT-F/OCT-R (5’ -

TGCCGTTTTGTGCTTAGATG- 3’/5’ -GGACGGAAGGACTCACGATA- 3’), cujo produto

de amplificação possui tamanho estimado de 923 pb. As etapas para a amplificação foram as

seguintes: um ciclo de 5 min a 94ºC; 35 ciclos de 30 s a 94ºC, 1 min a 61ºC, 90 s a 72ºC e

extensão final de 7 min a 72ºC (Kellmann et al. 2008).

O potencial de produção da cilindrospermopsina foi verificado pela presença do

agrupamento gênico cyrJ, utilizando o conjunto de oligonucleotídeos iniciadores Cynsulf-F (5’

-ACTTCTTCTCCTTTCCCTATC- 3’) e Cynsulf-R (5’ -

GAGTGAAAATGCGTAGAACTTG- 3’), com as seguintes condições: um ciclo de 4 min a

 13

94ºC; 30 ciclos de 20 s a 94ºC, 1 min a 54ºC, 2 min a 72ºC, com extensão final de 7 min a 72ºC,

cujo produto de amplificação possui tamanho estimado de 780 pb A biossíntese da

cilindrospermopsina é, provavelmente, realizada pela ação de uma sulfotransferase codificada

pelo gene cyrJ, justificando-se a escolha do marcador genético para investigar a produção da

toxina (Mihali et al. 2008).

As reações de PCR foram realizadas com 10 ƞg de DNA genômico, 0,5 µM de cada

oligonucleotídeo iniciador, 200 µM de dNTPs, 2,0 mM de MgCl2, l X PCR de 1,5 U Taq DNA

polimerase (Applied Biological Materials, Richmond, Canadá) em um volume total de 25 µL.

As reações de PCR foram realizadas em termociclador Veriti® 96 (Applied Biosystems®,

Foster City, Califórnia, EUA). Os produtos de PCR foram avaliados em gel de agarose (1% w

/ v), usando marcador de peso molecular (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) para comparação

com o tamanho dos fragmentos amplificados. As análises moleculares foram realizadas no

Laboratório de Genética e Evolução de Plantas (LAGEV – IBIO/UFBA).

Resultados e Discussão

Identificação e caracterização das cianobactérias isoladas

Foram identificados cinco gêneros de cianobactérias através de suas características

morfológicas, hábito e habitat de acordo com bibliografias especializadas: Chroococcus sp.,

Geitlerinema sp., Leptolyngbya sp., Microcystis sp. e Phormidium sp. (Fig. 1a-g). O gênero

Chroococcus, é unicelular e colonial. Poucas células mais ou menos esféricas de colônias

microscópicas foram verificadas, são amplamente distribuídas em água doce, principalmente

em metafíton. Geitlerinema foi identificada por possuir células com grânulos nas paredes,

tricomas carentes de bainha e células terminais curvadas. O gênero Leptolyngbya é filamentoso,

apresentando filamentos longos e enrolados em grupos, bainhas incolores unidas aos tricomas.

São muito comuns em perifíton e metafíton de ambientes de água doce. Microcystis é um gênero
 14

unicelular e colonial. Colônias densamente aglomeradas foram identificadas com mucilagem

incolor e células com números aerótopos. São observados flutuando livremente em plâncton de

reservatórios de água doce, relativamente eutrofizados. Por fim, o gênero Phormidium foi

identificado por possuir filamentos não ramificados, com bainhas firmes, incolores e unidas aos

tricomas retos. Suas células terminais são arredondadas e atenuadas, ocorrendo em águas

estagnadas (Komárek & Anagnostidis 1998; Komárek & Anagnostidis 2005).

Cepas que obtiveram resultado do isolamento e cultivo bem sucedido foram analisadas

para identificação específica: uma cepa da espécie Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing,

três cepas de Geitlerinema amphibium (Agardh ex Gomont) Anagnostidis, e quatro cepas de

Leptolyngbya tenerrima (Kützing ex Hansgirg) Komárek. Não obtivemos sucesso com o

isolamento dos gêneros Chroococcus e Phormidium.

Microcystis aeruginosa (Chroococcales) apresentou colônias com células esféricas,

agregadas e imersas em mucilagem incolor, como descrito por Komárek & Anagnostidis (1998)

para esta espécie. Células medindo 2 -5 µm de diâmetro, com presença de inúmeros aerótopos.

De acordo com Bicudo et al. (2005), em ambientes eutrofizados é comum a formação de

floração pelo gênero Microcystis e a produção da hepatotoxina microcistina.

Geitlerinema amphibium (Oscillatoriales) apresentou tricomas com células entre 1 –

2,06 µm de diâmetro e 2,76 – 4,69 µm de comprimento, retos, raramente curvados, não

constritos, sem bainha, com célula apical arredondada, e geralmente com grânulos solitários

nas paredes transversais. Esta espécie é comumente encontrada em corpos de água doce

estagnados com plantas aquáticas (Komárek & Anagnostidis 2005; Silva et al. 2009).

Leptolyngbya tenerrima (Synechococcales) apresentou tricomas com células entre 1,35

– 2,17 µm de diâmetro e 1,15 – 2,7 µm de comprimento. Os filamentos apresentam-se

aglomerados, com tricomas constritos e bainhas inconspícuas. De acordo com Komárek &
 15

Anagnostidis (2005), é uma espécie encontrada em locais com muita matéria orgânica, como

áreas mesotróficas.

Detecção dos genes codificadores de cianotoxinas

As análises dos agrupamentos gênicos das três espécies de cianobactérias mantidas em

cultivo, possibilitou que fossem detectados genótipos com potencial para produção de

cianotoxina em duas delas (Tab. 1). Leptolyngbya tenerrima apresentou amplificação para duas

regiões gênicas relacionadas à biossíntese da microcistina, mcyE e mcyG, corroborando os

resultados de Pineda-Mendoza et al. (2012), que avaliaram a referida espécie coletada em um

lago urbano do México em eutrofização utilizando as regiões mcyA-Cd e confirmaram a

presença de agrupamentos gênicos codificadores de microcistina.

Outra espécie que demostrou potencial genético para produção de microcistina foi

Geitlerinema amphibium, apresentando amplificação para mcyG. Dogo (2010), em testes com

camundongos, identificou que G. amphibium causou sinais diferentes de intoxicação

promovidos por cianotoxinas, indicando que a espécie possui substâncias tóxicas desconhecidas

produzidas por outros metabólitos secundários. Sendo assim, há necessidade de maiores estudos

sobre a toxicidade da referida espécie, pois sua frequência é constante em corpos d’água

destinados ao abastecimento público.

As cepas de Microcystis aeruginosa analisadas não demostrarem a presença dos

conjuntos gênicos testados. No entanto, há estudos que demonstram a produção de microcistina

na espécie (Bittencourt-Oliveira et al. 2001; Lorenzi 2004; Carneiro 2005; Sant’Anna et al.

2010). Bittencourt-Oliveira et al. (2001) também confirmaram que a toxidade de M. aeruginosa

é uma característica intra-populacional, demostrando que isolados da espécie de uma mesma

população apresentaram genótipos diferenciados quanto à presença ou ausência do gene que

codifica para a microcistina sintetase.

 16

As microcistinas são heptapeptídeos cíclicos, com várias isoformas, sendo classificadas

como hepatotoxinas, cujo mecanismo de ação é a inibição específica das proteínas fosfatases

da família serina/treonina de células eucarióticas. Danos severos são causados ao fígado dos

animais vertebrados devido à concentração da toxina no órgão como uma tentativa de degradá-

la, causando sua morte por choque hemorrágico (Calijuri et al. 2006; Fiore et al. 2011).

Apesar da contagem da densidade celular não ter sido realizada para corroborar

quantitativamente a floração do Dique do Tororó, o grande adensamento celular de

cianobactérias ocorrente nas suas águas apresentaram sinais visíveis de floração, como aspecto

esverdeado, formação de massas espessas e forte odor, o que acarretou grande desconforto na

população local.

Florações de cianobactérias são fenômenos que ocorrem por causas naturais, mas

também são recorrentes em ambientes eutrofizados decorrente da ação antrópica. Esse evento

altera as condições da água, pode ocasionar um desagradável odor além do risco de intoxicação

por cianotoxinas.

A técnica de prospecção gênica empregada neste trabalho auxilia na detecção precoce

de uma possível floração tóxicas de cianobactérias, pois verifica se as cepas presentes no local

são potencialmente produtoras de cianotoxinas antes que ocorra o aumento da sua densidade.

Outras técnicas, como bioensaios com mamíferos, análises imunoenzimáticas específicas e

detecção de toxinas através de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) só podem

ser realizadas após a ocorrência do fenômeno (Bittencourt-Oliveira et al. 2001), acarretando em

desvantagem.

Sendo assim, a presença de cepas potencialmente produtoras da toxina no corpo d’água

em estudo serve de alerta para os riscos de intoxicação e morte por ingestão da água pelos

animais e pela população local que não são orientadas sobre o uso correto da água no local.
 17

É importante ressaltar que os resultados apresentados aqui não são conclusivos para

inferir a presença da toxina no ambiente, pois indicam apenas a presença dos genes responsáveis

pela codificação da microcistina. Faz-se necessário sequenciar os produtos da PCR e análises

químicas são recomendadas para confirmar se os genes amplificados estão sendo expressos no

ambiente, pois esta cianotoxina causa graves problemas de saúde pública e desequilíbrios

ambientais.

Conclusão

Este trabalho demostrou a diversidade de cianobactérias presentes em um evento de

grande adensamento celular em um corpo d’água urbano, sendo identificados os gêneros

Chroococcus, Geitlerinema, Leptolyngbya, Microcystis e Phormidium. As análises de

prospecção gênica, permitiu identificar a presença de cepas potencialmente produtoras de

microcistina no local. Este estudo mostra a importância de se implantar projetos que visam a

mitigação de impactos antrópicos, com a finalidade de manter o equilíbrio ecológico do Dique

do Tororó . Novos estudos quanto à toxicidade dessas espécies devem ser realizados, assim

como a implantação de programas de monitoramento de cianobactérias, cianotoxinas, de modo

a evitar que novos eventos de proliferação ocorram no local.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Eduardo Mendes da Silva, à Drª Suzana da Cunha Lima, à Dra.

Alessandra Selbach Schnadelbach pelo uso de suas instalações laboratoriais. Agradecemos

também ao Dr. Doriedson Ferreira Gomes pela realização da coleta e à Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado da Bahia (Projeto de Pesquisa em Redes –RED 006/2012). JMCN agradece

ao CNPq pela Bolsa Produtividade (Processo no. 307368/2015-7).

 18

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 22

Tabela 1. Avaliação do potencial gênico para produção de microcistina, saxitoxina e

cilindrospermopsina em cianobactérias coletadas no Dique do Tororó, Salvador, Bahia.

Table 1. Evaluation of genetic potential for production of microcystin, saxitoxin and

cylindrospermopsin in strains collected on Dique do Tororó, Salvador, Bahia

Biotoxinas e seus respectivos primers

Microcistina Saxitoxina Cylindrospermopsina

Espécies
mcyD mcyE mcyG sxtA sxtI OCT Cynsulf

Microcystis aeruginosa
- - - - - - -
(ALCB 132752)

Leptolyngbya tenerrima
- + + ? - - -
(ALCB 132751)

Geitlerinema amphibium
- - + - - - -
(ALCB132750)

Geitlerinema amphibium
- - - - - - -
(ALCB132749)

Total 0 1 2 ? 0 0 0

+ Resultado positivo; - Resultado negativo; ? Resultado não conclusivo.

 23

Figura

Figura 1 – Cianobactérias ocorrentes na floração do Dique do Tororó, Salvador-Ba – a.

Chroococcus sp. (não mantida em cultivo). b. Phormidium sp. (não mantida em cultivo). c-d.

Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing. c. Aspecto geral da colônia. d. Detalhe das células

contendo aerótopos. e-f. Geitlerinema amphibium (Agardh ex Gomont) Anagnostidis. e.

Aspecto dos filamentos. f. células com grânulos. g-h. Leptolyngbya tenerrima (Hansgirg)
 24

Komárek. g. Aspecto dos filamentos. h. Célula apical ligeiramente estreita e arredondada.

Barras de escalas: a,b,d,e,f,g,h = 10µm; c = 30µm.

Figure 1 – Cyanobacteria present in the bloom of the Dique do Tororó, Salvador-Ba– a.

Chroococcus sp. (not isolated) b. Phormidium sp. (not isolated). c-d. Microcystis aeruginosa

(Kützing) Kützing. c. Aspect general of the colony. d. Detail of cells containing aerotopes. e-f.

Geitlerinema amphibium (Agardh ex Gomont) Anagnostidis, e. Aspect of the filaments. f. Cells

with granules g-h. Leptolyngbya tenerrima (Hansgirg) Komárek. g. Aspect of the filaments. h.

Apical cell slightly narrow and rounded. Scale bars: a,b,d,e,f,g,h = 10 µm; c = 30µm.
 25

6. CONCLUSÕES

 O presente trabalho constatou a presença dos seguintes táxons: Chroococcus sp., Phormidium
sp., Geitlerinema amphibium, Leptolyngbya tenerrima e Microcystis aeruginosa em um
evento de grande proliferação de cianobactérias ocorrida no Dique do Tororó, Salvador,
Bahia;
 Geitlerinema amphibium e Leptolyngbya tenerrima apresentaram resultados positivos quanto
ao potencial genético tóxico, apresentando amplificação para as regiões mcyE e mcyG,
responsáveis pela síntese de microcistina;
 Para as cepas que apresentaram resultados negativos quanto à sua toxicidade, recomenda-se
uma reavaliação, pois a amplificação das regiões específicas é influenciada pela qualidade e
quantidade do DNA extraído para análise;
 Novos estudos quanto à toxicidade das cepas analisadas devem ser realizados, incluindo a
análise química da água, além da implantação de programas de monitoramento de
cianotoxinas e mitigação de impactos antrópicos, de modo a evitar que novos eventos de
proliferação de cianobactérias potencialmente tóxica ocorram neste local de importância
histórica e de uso recreativo.
 26

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 28

ANEXO
 29

ANEXO A

Norma de formatação da revista

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

Escopo

A Rodriguésia é uma publicação trimestral do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do

Rio de Janeiro, que publica artigos e notas científicas, em Português, Espanhol ou Inglês em todas as
áreas da Biologia Vegetal, bem como em História da Botânica e atividades ligadas a Jardins
Botânicos.

Encaminhamento dos manuscritos

Os manuscritos devem ser enviados em 3 vias impressas e em CD-ROM à: Revista

Rodriguésia Rua Pacheco Leão 915 Rio de Janeiro - RJ CEP: 22460-030 Brasil e-mail:
[email protected]

Os artigos devem ter no máximo 30 páginas digitadas, aqueles que ultrapassem este limite
poderão ser publicados após avaliação do Corpo Editorial. O aceite dos trabalhos depende da decisão
do Corpo Editorial.

Todos os artigos serão submetidos a 2 consultores ad hoc. Aos autores será solicitado,
quando necessário, modificações de forma a adequar o trabalho às sugestões dos revisores e editores.
Artigos que não estiverem nas normas descritas serão devolvidos.

Serão enviadas aos autores as provas de página, que deverão ser devolvidas ao Corpo
Editorial em no máximo 5 dias úteis a partir da data do recebimento. Os trabalhos, após a publicação,
ficarão disponíveis em formato digital (PDF, AdobeAcrobat) no site do Instituto de Pesquisas Jardim
Botânico do Rio de Janeiro (http://rodriguesia.jbrj.gov.br).

Formato dos manuscritos

Os autores devem utilizar o editor do texto Microsoft Word, versão 6.0 ou superior, fonte
Times New Roman, corpo 12, em espaço duplo.

O manuscrito deve ser formatado em tamanho A4, com margens de 2,5 cm e alinhamento
justificado, exceto nos casos indicados abaixo, e impresso em apenas um lado do papel. Todas as
 30

páginas, exceto a do título, devem ser numeradas, consecutivamente, no canto superior direito. Letras
maiúsculas devem ser utilizadas apenas se as palavras exigem iniciais maiúsculas, de acordo com a
respectiva língua do manuscrito. Não serão considerados manuscritos escritos inteiramente em
maiúsculas.

Palavras em latim devem estar em itálico, bem como os nomes científicos genéricos e
infragenéricos. Utilizar nomes científicos completos (gênero, espécie e autor) na primeira menção,
abreviando o nome genérico subseqüentemente, exceto onde referência a outros gêneros cause
confusão. Os nomes dos autores de táxons devem ser citados segundo Brummitt & Powell (1992), na
obra “Authors of Plant Names”.

Primeira página − deve incluir o título, autores, instituições, apoio financeiro, autor e
endereço para correspondência e título abreviado. O título deverá ser conciso e objetivo, expressando
a idéia geral do conteúdo do trabalho. Deve ser escrito em negrito com letras maiúsculas utilizadas
apenas onde as letras e as palavras devam ser publicadas em maiúsculas.

Segunda página − deve conter Resumo (incluindo título em português ou espanhol),

Abstract (incluindo título em inglês) e palavras-chave (até 5, em português ou espanhol e inglês).
Resumos e abstracts devem conter até 200 palavras cada. O Corpo Editorial pode redigir o Resumo
a partir da tradução do Abstract em trabalhos de autores não fluentes em português.

Texto – Iniciar em nova página de acordo com seqüência apresentada a seguir: Introdução,
Material e Métodos, Resultados, Discussão, Agradecimentos e Referências Bibliográficas. Estes itens
podem ser omitidos em trabalhos sobre a descrição de novos táxons, mudanças nomenclaturais ou
similares. O item Resultados pode ser agrupado com Discussão quando mais adequado. Os títulos
(Introdução, Material e Métodos etc.) e subtítulos deverão ser em negrito. Enumere as figuras e
tabelas em arábico de acordo com a seqüência em que as mesmas aparecem no texto. As citações de
referências no texto devem seguir os seguintes exemplos: Miller (1993), Miller & Maier (1994),
Baker et al. (1996) para três ou mais autores ou (Miller 1993), (Miller & Maier 1994), (Baker et al.
1996).

Referência a dados ainda não publicados ou trabalhos submetidos deve ser citada
conforme o exemplo: (R.C. Vieira, dados não publicados). Cite resumos de trabalhos apresentados
em Congressos, Encontros e Simpósios se estritamente necessário.
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O material examinado nos trabalhos taxonômicos deve ser citado obedecendo a seguinte
ordem: local e data de coleta, fl., fr., bot. (para as fases fenológicas), nome e número do coletor
(utilizando et al. quando houver mais de dois) e sigla(s) do(s) herbário(s) entre parêntesis, segundo o
Index Herbariorum. Quando não houver número de coletor, o número de registro do espécime,
juntamente com a sigla do herbário,deverá ser citado. Os nomes dos países e dos estados/províncias
deverão ser citados por extenso, em letras maiúsculas e em ordem alfabética, seguidos dos respectivos
materiais estudados. Exemplo: BRASIL. BAHIA: Ilhéus, Reserva da CEPEC, 15.XII.1996, fl. e fr.,
R. C. Vieira et al. 10987 (MBM, RB, SP). Para números decimais, use vírgula nos artigos em
Português e Espanhol (exemplo: 10,5 m) e ponto em artigos em Inglês (exemplo: 10.5 m). Separe as
unidades dos valores por um espaço (exceto em porcentagens, graus, minutos e segundos).

Use abreviações para unidades métricas do Systeme Internacional d´Unités (SI) e

símbolos químicos amplamente aceitos. Demais abreviações podem ser utilizadas, devendo ser
precedidas de seu significado por extenso na primeira menção.

Referências Bibliográficas − Todas as referências citadas no texto devem estar listadas

neste item. As referências bibliográficas devem ser relacionadas em ordem alfabética, pelo
sobrenome do primeiro autor, com apenas a primeira letra em caixa alta, seguido de todos os demais
autores. Quando houver repetição do(s) mesmo(s) autor(es), o nome do mesmo deverá ser substituído
por um travessão; quando o mesmo autor publicar vários trabalhos num mesmo ano, deverão ser
acrescentadas letras alfabéticas após a data. Os títulos de periódicos não devem ser abreviados.
Exemplos: Tolbert, R. J. & Johnson, M. A. 1966. A survey of the vegetative shoot apices in the family
Malvaceae. American Journal of Botany 53(10): 961-970. Engler, H. G. A. 1878. Araceae. In:
Martius, C. F. P. von; Eichler, A. W. & Urban, I. Flora brasiliensis. Munchen, Wien, Leipzig, 3(2):
26-223. _____. 1930. Liliaceae. In: Engler, H. G. A. & Plantl, K. A. E. Die Naturlichen
Pflanzenfamilien. 2. Aufl. Leipzig (Wilhelm Engelmann). 15: 227-386. Sass, J. E. 1951. Botanical
microtechnique. 2ed. Iowa State College Press, Iowa, 228p.

Cite teses e dissertações se estritamente necessário, isto é, quando as informações

requeridas para o bom entendimento do texto ainda não foram publicadas em artigos científicos.

Tabelas - devem ser apresentadas em preto e branco, no formato Word for Windows. No
texto as tabelas devem ser sempre citadas de acordo com os exemplos abaixo: “Apenas algumas
espécies apresentam indumento (Tab. 1)...” “Os resultados das análises fitoquímicas são apresentados
na Tabela 2...”
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Figuras - não devem ser inseridas no arquivo de texto. Submeter originais em preto e
branco e três cópias de alta resolução para fotos e ilustrações, que também podem ser enviadas em
formato eletrônico, com alta resolução, desde que estejam em formato TIF ou compatível com
CorelDraw, versão 10 ou superior. Ilustrações de baixa qualidade resultarão na devolução do
manuscrito. No caso do envio das cópias impressas a numeração das figuras, bem como textos nelas
inseridos, devem ser assinalados com Letraset ou similar em papel transparente (tipo manteiga),
colado na parte superior da prancha, de maneira a sobrepor o papel transparente à prancha, permitindo
que os detalhes apareçam nos locais desejados pelo autor. Os gráficos devem ser em preto e branco,
possuir bom contraste e estar gravados em arquivos separados em disquete (formato TIF ou outro
compatível com CorelDraw 10). As pranchas devem possuir no máximo 15 cm larg. x 22 cm comp.
(também serão aceitas figuras que caibam em uma coluna, ou seja, 7,2 cm larg.x 22 cm comp.). As
figuras que excederem mais de duas vezes estas medidas serão recusadas. As imagens digitalizadas
devem ter pelo menos 600 dpi de resolução. No texto as figuras devem ser sempre citadas de acordo
com os exemplos abaixo: “Evidencia-se pela análise das Figuras 25 e 26....” “Lindman (Fig. 3)
destacou as seguintes características para as espécies...”

Após feitas as correções sugeridas pelos assessores e aceito para a publicação, o autor
deve enviar a versão final do manuscrito em duas vias impressas e em uma eletrônica.
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