UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS

CARLOS AUGUSTO DA SILVA SANTANA

TESE DE DOUTORADO

PRODUÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EM BIORREATOR

UTILIZANDO RESÍDUO AGROINDUSTRIAL

João Pessoa - PB
2022
 CARLOS AUGUSTO DA SILVA SANTANA

PRODUÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EM BIORREATOR UTILIZANDO

RESÍDUO AGROINDUSTRIAL

João Pessoa - PB
2022
 CARLOS AUGUSTO DA SILVA SANTANA

PRODUÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EM BIORREATOR UTILIZANDO

RESÍDUO AGROINDUSTRIAL

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos, Centro de Tecnologia, Universidade
Federal da Paraíba, em cumprimento aos
requisitos para obtenção do título de Doutor em
Ciência e Tecnologia de Alimentos.

Orientador: Prof. Dr. Flávio Luiz Honorato da Silva

Coorientadora: Profa. Dra. Andrea Lopes de Oliveira Ferreira

João Pessoa - PB
2022
 Catalogação na publicação
Seção de Catalogação e Classificação

S232p Santana, Carlos Augusto da Silva.

Produção de compostos bioativos em biorreator
utilizando resíduo agroindustrial / Carlos Augusto da
Silva Santana. - João Pessoa, 2022.
81 f. : il.

Orientação: Flávio Luiz Honorato da Silva.

Coorientação: Andrea Lopes de Oliveira Ferreira.
Tese (Doutorado) - UFPB/de Tecnologia.

1. Tecnologia de alimentos. 2. Carotenoides. 3.

Biorreator. 4. Biotecnologia. I. Silva, Flávio Luiz
Honorato da. II. Ferreira, Andrea Lopes de Oliveira.
III. Título.

UFPB/BC CDU 664(043)

Elaborado por Gracilene Barbosa Figueiredo - CRB-15/794

 CARLOS AUGUSTO DA SILVA SANTANA

AMPLIAÇÃO DE ESCALA DA PRODUÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS

UTILIANDO RESÍDUO AGROINDUSTRIAL
BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Flávio Luiz Honorato da Silva

DEQ/CT/UFPB
Orientador

Prof.ª Drª. Andrea Lopes de Oliveira Ferreira

DEQ/CT/UFPB
Coorientadora

Prof. Dr. José Evangelista Santos Ribeiro

DEA/CT/UFPB
Examinador externo

Prof. Dr. Josevan da Silva

DEA/CT/UFPB
Examinador externo

Prof. Dr. Luciano Fernandes. Monteiro

UFS - Departamento de Engenharia de Produção (DEPRO)
Examinador externo
 10

À minha família, principalmente aos meus

pais Antônio Carlos Santana e Maria José
Ribeiro da Silva, dedico.
 11

AGRADECIMENTOS
A Deus.

A minha mãe, Maria José Ribeiro da Silva e o meu pai Antonio Carlos Santana por todo
apoio, compreensão, amor e atenção nas horas em que mais precisei podendo contar sempre
com sua amizade, amor e cuidado;

Agradeço também aos meus orientadores, o professor Flávio Luiz Honorato da Silva
que mesmo sem me conhecer direito, aceitou me orientar e dividiu comigo o seu
companheirismo, sua paciência, sua amizade e estive comigo esses quatro anos sempre com
muita atenção e cuidado, a professora Andrea Ferreira e o professor Giovanilton de Oliveira
por terem me dado essa chance de trabalharmos juntos nesse doutorado, por terem confiado em
mim mais uma vez e por ter me dado todo apoio que precisei, não mediram esforços para me
ajudar, que Deus possa recompensá-los;

Aos meus Amigos que fiz durante esses quatro anos na UFPB: Josevan, José
Evangelista, Valdenice, Renata, Tatiana, Debora, Rian, Lorena, Leanderson, Bruno, sem me
esquecer da Fernanda (secretária do PPGCTA) e da sua simpatia;

Aos amigos do Laboratório de Bioengenharia/DEQ/UFPB;

Aos professores que participaram da minha banca de qualificação e defesa, Professora

Drª Elizama Aguiar, Professor Dr José Evangelista, Professora Drª Lorena Lucena, Professor
Dr Luciano Monteiro e o Professor Dr Josevan da Silva.

A professora Drª Rita de Cassia Queiroga (in memoriam) que no início do meu
doutorado me ajudou e me deu muita força para que eu pudesse estudar.

A minha amiga Ana Flávia que juntos formamos a dupla Pink e Cérebro, fizemos o
mestrado juntos na UFBA e agora encontra-se mais perto de Deus.

Aos meus amigos da turma do doutorado e os professores do programa de Ciência e

Tecnologia de Alimentos que passamos por tantos momentos juntos durante as aulas.

A Universidade Federal da Paraíba (UFPB) por ter me dado a oportunidade de realizar

o meu doutoramento e me desenvolver não só como aluno e cientista, mas também como pessoa
e como ser humano.
 12

O início da sabedoria é a admissão da

própria ignorância.

Sócrates
 13

RESUMO

Os nutracêuticos são moléculas bioativas que podem ser utilizadas para suprir as necessidades
nutricionais do organismo, ao passo que auxiliam na saúde como um todo. Muitos esforços têm
sido empregados com objetivo de desenvolver tecnologias que otimizem a produção destas
biomoléculas por microrganismos, e neste sentido, várias metodologias são inteligentemente
empregadas como é o caso do uso dos biorreatores integrados. Atualmente, têm-se concedido
especial atenção aos processos biotecnológicos como alternativa às rotas químicas devido aos
baixos custos de produção. O uso de resíduos é bastante conveniente tanto do ponto de vista da
sustentabilidade quanto econômico quando são utilizados como substrato para o
desenvolvimento de microrganismos e, consequentemente, na produção de um composto de
alto valor agregado como exemplo as biomoléculas. O trabalho teve por objetivo estudar a
produção de carotenoides, lipídeos e biomassa em Biorreator integrado utilizando as leveduras
Rhodothorula glutinis e Paffia rhodozyma como agentes produtores e avaliar a viabilidade do
uso da manipueira, como substrato para essa produção. Foram feitas análises da biomassa,
lipídeos e carotenoides produzidos. As análises físico-químicas da manipueira foram realizadas
e foram encontrados 93,54% de umidade, 32,24 g/L de açúcares redutores, 47,18 g/L de
açúcares totais, 1,58% de proteínas, 1% de cinzas, 7,3 °Brix de sólidos solúveis totais e pH de
5,3. Os melhores resultados encontrados durante os cultivos individuais das leveduras em
biorreator: 8,57 g/L e 9,85 g/L de biomassa, 0,81 g/L e 4,19 g/L de lipídeos e 1,3 mg/L e 1,1
mg/L de carotenoides totais para R. glutinis e P. rhodozyma, respectivamente. Ao passo que
durante o cultivo misto foram produzidos 7,15 g/L de biomassa e as maiores quantidades de
lipídeos (6,04 g/L) e de carotenoides totais (1,51mg/L) quando comparados com os cultivos
individuais. Os microrganismos utilizados neste estudo apresentaram crescimento importante
quando cultivados em biorreator em meio contendo manipueira como fonte de carbono e,
portanto, estes resultados apoiam a viabilidade da utilização da manipueira como substrato a
ser utilizado em um processo biotecnológico com o objetivo de produção de carotenoides e
lipídeos e biomassa microbiana.

Palavras chave: Carotenoides; Biorreator; Biotecnologia.

 14

ABSTRACT

Nutraceuticals are bioactive molecules that can be used to meet the nutritional needs of the
body, while helping with health as a whole. Many efforts have been used to develop
technologies that optimize the production of these biomolecules by microorganisms, and in this
sense, several methodologies are intelligently employed, such as the use of integrated
bioreactors. Currently, special attention has been given to biotechnological processes as an
alternative to chemical routes due to low production costs. The use of residues is quite
convenient both from the point of view of sustainability and economics when they are used as
a substrate for the development of microorganisms and, consequently, in the production of a
compound of high added value such as biomolecules. The objective of this work was to study
the production of carotenoids, lipids and biomass in an integrated Bioreactor using the yeasts
Rhodothorula glutinis and Paffia rhodozyma as producing agents and to evaluate the feasibility
of using cassava as a substrate for this production. Biomass, lipids and carotenoids produced
were analyzed. The physicochemical analyzes of the manipueira were carried out and found
93.54% of moisture, 32.24 g/L of reducing sugars, 47.18 g/L of total sugars, 1.58% of proteins,
1% of ash, 7.3 °Brix of total soluble solids and pH of 5.3. The best results found during
individual yeast cultures in bioreactor: 8.57 g/L and 9.85 g/L of biomass, 0.81 g/L and 4.19 g/L
of lipids and 1.3 mg/L and 1.1 mg/L of total carotenoids for R. glutinis and P. rhodozyma,
respectively. Whereas during the mixed culture, 7.15 g/L of biomass and the highest amounts
of lipids (6.04 g/L) and total carotenoids (1.51 mg/L) were produced when compared to the
individual cultures. The microorganisms used in this study showed significant growth when
cultivated in a bioreactor in a medium containing manipueira as a carbon source and, therefore,
these results support the feasibility of using manipueira as a substrate to be used in a
biotechnological process with the objective of producing carotenoids and lipids and microbial
biomass.

Keywords: Carotenoids; Bioreactor; Biotechnology.

 15

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Número de publicações nos últimos dez anos para o termo agroindustrial waste. .. 25
Figura 2. Estrutura molecular dos carotenoides ...................................................................... 28
Figura 3. Estimativa de participação de carotenoides no mercado mundial em 2021 ............ 29
Figura 4. Produção, coleta e envase da manipueira................................................................. 37
Figura 5. Preparo do inóculo em meio YM ............................................................................. 41
Figura 6. Biorreator utilizado nos ensaios de produção de carotenoides. ............................... 42
Figura 7. Cultivo misto com os mocrorganismos Rhodotorula glutinis e Paffia rhodozyma após
cultivo em biorreator, com aumento de 100×. .......................................................................... 45

FIGURAS DO ARTIGO 1
Figure 1: Growth curve for R. glutinis in the described bioreactor over 84 hours. Bars
represent the deviation for triplicates……………………………………………………… 62
Figure 2: Values of reducing sugar over 84 hours of cultivation………………………… 63
Figure 3: Production of carotenoids by R. glutinis over 84 hours of cultivation…………. 64

FIGURAS DO ARTIGO 2
Figure 1: Biomass concentration throughout the process of single and mixed culture…... 77
Figure 2: Values of reducing sugars throughout the fermentation process (84 h) ………. 81
Figure 3: Production of carotenoids by mixed culture of Rhodotorula glutinis and Paffia
rhodozyma throughout the cultivation period. Data are expressed as duplicate means and
standard deviation................................................................................................................. 82
 16

LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1
Table 1: Composition of cassava wastewater used in this work........................................... 61
Table 2: Composition of fatty acids produced during each fermentation............................. 66
Table 3: Productivity of experiments in bioreactor using cassava water as a carbon source. 66

ARTIGO 2
Table 1: Composition of cassava wastewater used in this work…………………………… 77
Table 2: Composição dos ácidos graxos produzidos durante cada fermentação................... 77
Table 3: Productivity of experiments in bioreactor using cassava water as a carbon source.. 78
 17

SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 19

2. OBJETIVOS........................................................................................................... 22

2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 22

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................... 22

3. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 23

3.1 RESIDUOS AGROINDUSTRIAIS E PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS ........ 23

3.2 PRODUÇÃO DE MANDIOCA .............................................................................. 25

3.3 USO DE LEVEDURAS VERELHAS EM PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS . 27

3.4 CAROTENOIDES.................................................................................................... 28

3.4.1 β-caroteno................................................................................................ 29

3.4.2 Astaxantina.............................................................................................. 30

3.5 OBTENÇÃO DE CAROTENOIDES A PARTIR DE MICRORGANISMOS ........ 31

3.5.1 Rhodotorula glutinis................................................................................ 32

3.5.2 Paffia Rhodozyma (Xantofilomices dendrohous) ................................... 33

3.6 EXTRAÇÃO E RECUPARAÇÃO DOS CAROTENOIDES .................................. 34

4. METODOLOGIA .................................................................................................. 37

4.1 MATÉRIA-PRIMA ............................................................................................... 377

4.2 ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DA MANIPUEIRA................................................ 37

4.3 MICRORGANISMOS ............................................................................................. 40

4.4 PREPARO DO INÓCULO ...................................................................................... 41

4.5 CULTIVO EM BIORREATOR .............................................................................. 42

4.6 MÉTODOS ANAITICOS PARA AVALIAÇÃO DA CINÉTICA MICROBIANA 43

4.6.1 Consumo de substrato (AR) .................................................................. 433

4.6.2 Determinação de Biomassa ..................................................................... 43

4.6.3 Extração e quantificação de lipídeos ....................................................... 43

4.6.4 Analise dos Ácidos graxos.......................................................................44

4.6.5 Extração e quantificação de carotenoides totais...................................... 44
 18

REFERÊNCIAS............................................................................................................ 46

ARTIGO 1: PRODUCTION OF BIOMOLECULES THROUGH THE MICRO-

ORGANISM Rhodotorula glutinis IN A BIOREACTOR USING CASSAVA WATER AS A
CARBON SOURCE ................................................................................................................. 54

ARTIGO 2: PRODUCTION OF LIPIDS AND CAROTENOIDS IN BIOREACTOR

WITH Rhodotorula glutinis AND Paffia rhodozyma USING CASSAVA WATER AS
CARBON SOURCE ................................................................................................................. 70
 19

1. INTRODUÇÃO

Há uma preocupação por parte da população a respeito da influência da alimentação na

saúde e isso tem aumentado o interesse por ingredientes alimentares de origem natural
(VALDUGA et al., 2009) e que, portanto, além de nutrir trazem benefícios adicionais à saúde
(SIRO et al., 2008). Diante deste cenário, a indústria de alimentos tem buscado alternativas para
a substituição de aditivos artificiais, tais como alguns corantes e conservantes, por aqueles
obtidos a partir de fontes naturais (MARTINS et al., 2016).
Os carotenoides são importantes pigmentos naturais, produzidos por uma grande
variedade de microrganismos e plantas, sendo em sua maioria C40 terpenoides (MAROVA et
al., 2012; PARK et al., 2005). Devido as suas propriedades como agentes antioxidantes,
anticancerígenos, estimulantes de resposta imune, nutracêuticos e corantes, os carotenoides são
amplamente utilizados na medicina e na indústria química, farmacêutica, de cosméticos, de
alimentos e de rações (BHOSALE; GADRE, 2001; CUTZU et al., 2013). A descoberta da
importância dos carotenoides na prevenção do câncer de próstata e doenças cardiovasculares
em humanos tem ganhado atenção global.
Do ponto de vista nutricional, fisiológico e bioquímico, o interesse pelos carotenoides
concentra-se principalmente na atividade pró-vitamina A de alguns deles, mas os carotenoides
também possuem outras funções biológicas que podem ter efeitos benéficos no tratamento de
doenças crônicas. São importantes para o bom funcionamento bioquímico do corpo humano e
não podem ser sintetizados pelo organismo naturalmente, embora possam ser modificados
parcialmente. Devido essa importância para a saúde há um crescente interesse por parte da
indústria por novas tecnologias que permitam uma melhora na sua produção.
Os lipídios microbianos entre muitas outras possibilidades, podem ser utilizados como
aditivos alimentares ou mesmo como substituto de óleos vegetais, por exemplo, manteiga de
cacau e óleo de palma em várias aplicações industriais. Esses Os lipídios obtidos a partir de
microrganismos têm algumas vantagens sobre os lipídios obtidos de fontes vegetais, como ciclo
de produção curto, menos mão de obra, o rendimento não é afetado por mudanças sazonais e é
relativamente fácil de expandir a escala de produção (Wang; Yang; Wang, 2014).
A utilização de sistemas que empregam leveduras para a produção de moléculas
bioativas é uma área emergente e que apresenta um grande potencial para aplicações industriais
(MATA-GÓMEZ et al., 2014; WICHUK; BRYNJÓLFSSON; FU, 2014). Diversos processos
biotecnológicos têm demonstrado o potencial destes microrganismos para as indústrias de
19
 20

alimentos e rações, visando à produção de carotenoides (RODRIGUES et al., 2014).

Dois grandes problemas encontrados pela indústria são o alto valor econômico
necessário para produção química desse grupo de moléculas e a geração de resíduos resultantes
das etapas químicas durante sua produção. Portanto, são importantes as pesquisas que propõem
reduzir os custos de produção e contribuir para a preservação do meio ambiente.
O descarte industrial tem se tornado uma das principais causas da poluição ambiental e
consequentemente tem sido um dos maiores problemas do mundo moderno, promovido pela
enorme formação de resíduos. A gestão dos resíduos gerados após a produção tem sido um
problema comum enfrentado pela indústria (MAZURCZAK et al., 2017).
Uma forma de solucionar esse problema é utilizar esses resíduos como fonte de carbono
para produção biotecnológica por serem geralmente ricos em sua composição. Um exemplo
desse tipo de resíduo são as águas residuais da mandioca, conhecidas como manipueira, que
são extraídas a partir da prensa da mandioca durante a produção de farinha (SUMAN et al.
2011).
Neste sentido, diversos pesquisadores têm procurado reaproveitar esse resíduo como
fonte de carbono para cultivo microbiano e foram observados resultados interessantes como a
biossíntese de lipídeos e carotenoides pelas leveduras vermelhas. Dentre essas leveduras
existem duas que estão entre as principais que são a Rhodotorula glutinis e a
Xanthophyllomyces dendrorhous (SILVA et al., 2018). Várias leveduras do gênero
Rhodotorula foram classificadas como oleaginosas, pois possuem a característica de acumular
entre 40-70% (massa/massa) de lipídeos intracelulares (Viñarta et al., 2016).
Leveduras são microrganismos que pertencem à classe dos fungos, são unicelulares,
desempenha um papel semelhante ao das bactérias e geralmente consomem matéria orgânica.
A levedura Paffia rhodozyma possui destaque na produção de carotenoides devido a sua
característica de utilizar diferentes fontes de carbono como substrato para o seu
desenvolvimento, possuir um metabolismo rápido, uma taxa de crescimento rápida, facilidade
de suas colônias atingirem alta densidade populacional e também por ter recebido o título de
GRAS (Generally Recognized as Safe), ou seja, é reconhecido como seguro e pode ser utilizado
pela indústria de alimentos com segurança.
Uma alternativa bastante utilizada atualmente na produção de carotenoides e lipídeos é
o cultivo em biorreator integrado, principalmente pela sua capacidade de otimizar o processo,
seu poder de controle das variáveis e pela sua segurança. Este trabalho investigou a produção
de lipídeos, carotenoides e biomassa utilizando as leveduras oleaginosas R. glutinis e P.

20
 21

rhodozyma, cultivadas individualmente e em consórcio em um biorreator e utilizando a

manipueira como fonte de carbono.

21
 22

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Estudar a cinética de produção em biorreator de moléculas bioativas por

Rhodotorula glutinis e Xanthophyllomyces dendrorhous como agentes do metabolismo
do bioprocesso, utilizando a manipueira como substrato.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Realizar a caracterização físico-química da manipueira;

• Investigar a viabilidade da ampliação de escala de bioprodução de carotenóides
utilizando a manipueira como substrato
• Estudar a cinética fermentativa da produção de carotenoides, lipídeos em escala
aumentada (aumento de 15 vezes), utilizando individualmente e em co-cultivo as duas
leveduras.
• Estudar a produção de biomassa;
• Separar e quantificar os lipídios e carotenoides produzidos;
• Calcular os parâmetros cinéticos da fermentação da produção de carotenoides
(YX/S, YP/S, Yp/x, QX, QP e FC).

22
 23

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1 RESIDUOS AGROINDUSTRIAIS E PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS

Os resíduos caracterizam-se como as sobras de um processo que não possuem valor

comercial e não são utilizadas em aplicações posteriores na planta industrial, portanto, são
tratados e descartados pela indústria (BIFF; SILVA, 2016). Por outro lado, subprodutos
caracterizam-se como as sobras do processo que são aproveitadas para a elaboração de outros
produtos e sendo assim apresentam um valor comercial baixo, no entanto, bem definido
(JUNIOR et al., 2016). As definições de resíduos e subprodutos dependem de fatores
socioeconômicos, visto que a depender da região, um resíduo pode passar a ser considerado um
subproduto, como ocorre com a manipueira que é utilizada no estado do Pará para a elaboração
do tucupi, mas é descartada na região Nordeste.
No Brasil, o maior agronegócio está nos ramos de aves, suínos e bovinos, açúcar e
álcool, fumo, têxtil, couro, frutas, algodão e grãos, madeira e celulose, óleo, farinha e conservas
(EXAME, 2017). O processamento das matérias-primas dessas agroindústrias geram uma
grande quantidade de resíduos sólidos e líquidos, que geralmente são descartados sem nenhuma
orientação técnica (SERNA-LOAIZA et al., 2018). Diversos problemas de poluição ambiental
e de saúde pública estão relacionados ao descarte inadequado desses resíduos (PÉREZ et al.,
2015) .
Se forem descartados sem tratamento prévio, incompleto ou ineficiente, os resíduos
líquidos gerados durante o processamento de matérias-primas agrícolas, também podem se
tornar uma fonte de poluição. Esses efluentes podem conter nutrientes em excesso, sedimentos,
matéria orgânica, pesticidas, patógenos, metais pesados e outros diversos contaminantes. Uma
vez descarregado em um corpo d'água, afetará a qualidade do abastecimento de água doce (e,
portanto, a quantidade de água disponível). O destino dos descartes em rios e lagos geralmente
é o oceano, o que tem um impacto negativo para o meio marinho (RYDER, 2017).
Por esse motivo, a comunidade científica tem explorado amplamente a possibilidade de
reaproveitar os resíduos e recuperar os compostos de interesse neles presentes. Diversas
trabalhos buscam resolver o problema de reaproveitamento de águas residuais agrícolas e
industriais utilizando para irrigação (LIONETTO et al., 2016; OLIVEIRA et al., 2017), como
fertilizantes (DANTAS et al., 2017; TADDEO et al., 2018), produção de biogás
(HANSUPALAK et al., 2016; MORENO et al., 2017) biodiesel (NEVES et al., 2016;

23
 24

TSOLCHA et al., 2018), produção de hidrogênio (ARANTES et al., 2017; PACHIEGA et al.,
2019; TORQUATO et al., 2017), biosurfactantes (YAÑEZ-OCAMPO et al., 2017), produção
de biomoléculas (RIBEIRO et al., 2019; SILVA et al., 2020) entre outras aplicações.
Petrik et al. (2014) observaram que 6 milhões de toneladas de borra de café são
produzidas no mundo todos os anos. Portanto foi desenvolvida uma pesquisa onde o subproduto
foi pré-tratado com ácido e, em seguida, submetido a hidrólise enzimática. O meio preparado
continha 150 g/L de subprodutos e alguns sais ((NH4) 2SO4; KH2PO4; MgSO4) ao final da
fermentação pode-se obter 3,68 mg/L de carotenoides e 4,28 g/L de biomassa para a levedura
R. Mucilaginosa.
Kot et al. (2015) constataram que, além de utilizar subprodutos para produção biológica,
as leveduras do gênero Rhodotorula também podem reduzir sua carga orgânica. Eles usaram a
levedura R. glutinis para verificar a biodegradabilidade de água residuária de batata
desproteinizada (fonte de nitrogênio) com glicerol (fonte de carbono), e obtiveram 77% de
redução da DQO (demanda química de oxigênio) e assimilação de 70% de glicerol e 20,34 g/L
de biomassa, quando usando 50 g/L de glicerol e 5% da água residual.
Resíduos líquidos agroindustriais geralmente não possuem valor econômico
significativo, por isso são considerados inconvenientes pela fonte de geração (BHARATHI;
RAMESH, 2013). A destinação correta e a destinação final desses resíduos representam
atualmente apenas o custo da indústria em que são produzidos. Aproximadamente 5 bilhões de
toneladas de resíduos agrícolas são gerados globalmente todos os anos (KUNG; KONG; CHOI,
2015). A maioria deles não é reaproveitada ou beneficiada, apenas é destinado à decomposição
natural, levando ao seu acúmulo, gerando problemas ambientais (DE MORAES et al., 2017).
A possibilidade de aproveitamento desses excedentes da agroindústria tem grande
importância ambiental e econômica. Eles representam a fonte de matérias-primas utilizadas
para criar novos produtos, (REBECCHI et al., 2013). Nos últimos anos, o tema tem crescido
nas pesquisas científicas, e opções viáveis de reutilização estão sendo estudadas para minimizar
o impacto ambiental de resíduos agrícolas e industriais. Ao buscar o termo “resíduos
agroindustriais” nos campos de Título, Resumo e Palavra-chave na base de dados de literatura
da Scopus, tem havido cada vez mais trabalhos sobre o tema nos últimos anos, conforme
mostrado na Figura 1.

24
 25

Figura 1. Número de publicações nos últimos dez anos para o termo agroindustrial waste.

1600

1400 1357
1243
1200 1148
Número de publicações

1005 1006
1000 907
863
799
800 754
656
559
600

400

200

0
2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020

Ano

Fonte: SCOPUS, (2021) Acessado em 09 Ago. 2021.

Vários resíduos de origem vegetal possuem na sua estrutura lignocelulose, rica em

açúcar, que pode ser convertida em açúcares fermentáveis, fonte de energia para a fermentação
microbiana. A partir desta transformação, os resíduos são convertidos em produtos de elevado
valor agregado, como lipídeos, betacaroteno, astaxantina biofertilizantes e biocombustíveis
(CHATZIPAVLIDIS et al., 2013).
A escolha correta do substrato é fundamental para qualquer tipo de cultivo
microbiológico. O substrato pode ser escolhido de forma natural ou produzido sinteticamente,
dependendo do processo que se deseja realizar, da facilidade de obtenção da matéria-prima ou
do resultado que se deseja alcançar. Neste sentido, devido ao baixo ou nenhum valor comercial,
o uso de resíduos agroindustriais é justificado.

3.2 PRODUÇÃO DE MANDIOCA

As regiões Norte e Nordeste do Brasil são as principais produtoras de mandioca

(Manihot esculenta Crantz), possuindo milhares de casas de farinha destinadas à pequenas
produções (ENBRAPA, 2018), sendo a parte que possui maior importância econômica na planta
de mandioca a sua raiz, onde há o acúmulo do amido, que pode ser transformado em farinha.
Esses processos, no entanto, geram em média 300 litros de manipueira por tonelada de raiz de
25
 26

mandioca (CHUZEL, 2001).

A mandioca é uma planta perene, arbustiva, pertencente à família das Euforbiáceas,
possui um sistema radicular tuberoso responsável pelo armazenamento das suas reservas de
amido, ela é cultivada e consumida principalmente nos continentes da África, Asia e América
do Sul. Possui um sistema radicular tuberoso responsável pelo armazenamento das suas
reservas de amido, ela é cultivada e consumida principalmente nos continentes da África, Asia
e América do Sul. A produção de mandioca no Brasil em 2020 foi estimada em cerca de 19
milhões de toneladas (IBGE, 2021). As regiões Norte e Nordeste do Brasil são as principais
produtoras de mandioca, possuindo milhares de casas de farinha destinadas à pequenas
produções (EMBRAPA, 2019), considerando que o processamento da mandioca à farinha
produz, em média, 300 litros de manipueira por tonelada de raiz (CHUZEL, 2001).
Do processamento das raízes de mandioca para fazer farinha e amido, dois resíduos são
gerados: sólidos, que consistem na parte lenhosa das raízes, a parte da fibra retida na peneira e
bagaço de mandioca; e líquidos, incluindo a água resultante da prensa da mandioca. Este último
é comumente referido como manipueira (INOUE et al., 2011). Manipueira é um líquido residual
produzido na prensagem dos pedaços de mandioca triturados, utilizado para a produção da
farinha de mandioca, sendo altamente tóxico ao meio ambiente, principalmente pelas elevadas
concentrações de ácido cianídrico, altas concentrações de potássio, magnésio, cálcio e fósforo
(PINTO; CAMILI; CABELLO, 2010), além de conter 5% a 7% de amido, glicose e outras
substâncias orgânicas (carboidratos, proteínas e lipídios) e nutrientes minerais (DA SILVA
JÚNIOR et al., 2012).
Leonel e Cereda (1995) relataram em seu trabalho que é possível a utilização com
sucesso da manipueira para a produção de produtos biológicos. Jesus et al. (2016) usaram a
manipueira como fonte alternativa de carbono para produzir lipase. Os autores relataram que o
Bacillus subtilis pode produzir lipase por fermentação submersa, utilizando como fonte de
carbono a manipueira tratada sem adição de indutor enzimático. A manipueira pode ser utilizada
como matéria-prima para processos industriais por conter em sua composição, altas
concentrações de carboidratos, nitrogênio e sais minerais (CORDEIRO, 2006).
A composição da manipueira possibilita o crescimento de microrganismos anaeróbios,
pois são resistentes a substratos que contêm cianeto. Já os microrganismos aeróbios são
sensíveis ao cianeto por interferir na sua respiração impedindo a formação do trifosfato de
adenosina (ATP), que através da citocromo oxidase inibe a transferência de elétrons, agindo
assim na fosforilação oxidativa (CEREDA et al., 2000).

26
 27

As características da raiz podem interferir na natureza da manipueira extraída dela.

Segundo Correia e Del Bianchi (2008), vários são os agentes que interferem na composição da
mandioca, incluindo estação, a natureza do solo, a temperatura, a altitude, a umidade e a
variedade da mandioca cultivada.

3.3 USO DE LEVEDURAS VERMELHAS EM PROCESSOS

BIOTECNOLÓGICOS

A bioprospecção microbiana (ou screening) é um dos itens mais importantes quando o

assunto é microbiologia industrial, ajudando a entender a biodiversidade, ecologia,
metabolismo. Além disso, torna possível a descoberta de microrganismos com grande potencial
para a formação de produtos de interesse na indústria farmacêutica, agrícola, alimentícia e
química. Microrganismos são bons produtores de biomoléculas e essa produção possui grandes
vantagens para a indústria pela possibilidade de produção em curto período de tempo, em
qualquer época do ano, em pequeno espaço, usando substratos de baixo custo, além de permitir
o controle das condições de cultivo (VALDUGA et al., 2014).
Leveduras são microrganismos que pertencem à classe dos fungos, são unicelulares,
desempenha um papel semelhante ao das bactérias e geralmente consomem matéria orgânica.
No entanto, eles são diferentes em termos de tamanho e características morfológicas (REED;
PEPPIER, 1973). As leveduras oleaginosas, principalmente as vermelhas, podem produzir
lipídeos com ácidos graxos semelhantes aos óleos vegetais, com ácidos graxos saturados e
monoinsaturados, e a cadeia formada principalmente por 16 a 18 átomos de carbono
(PAPANIKOLAOU; AGGELIS, 2011). Várias leveduras podem ser classificadas como
oleaginosas, para isso, elas devem possuir a capacidade de produzir e acumular mais de 20%
de ácidos graxos, em seu interior (MENG et al., 2009; RATLEDGE; WYNN, 2002)
Segundo Beopoulos et al., (2009), os gêneros Candida, Cryptococcus, Rhodotorula e
Yarrowia são as leveduras oleaginosas mais conhecidas e são capazes de acumular cerca de
40% de lipídeos (em relação à sua biomassa) em inclusões lipídicas intracelulares, ao passo que
em condições de estresse, este acúmulo pode chegar a 70%.
Dentre os microrganismos de interesse industrial, a levedura é o microrganismo mais
utilizado. Eles são cultivados para a obtenção das próprias células, componentes celulares e
produtos finais durante o processo de fermentação, que constituem os principais grupos
microbianos utilizados na fermentação de alimentos e bebidas (SICARD; LEGRAS, 2011).

27
 28

3.4 CAROTENOIDES

Os carotenoides (Figura 2), são os responsáveis pelas cores amarelo, laranja e vermelho
em vegetais, possuem cadeias de 40 carbonos e sua principal característica química é a presença
de um polieno de cadeia longa (onde a presença de duplas ligações varia de três até quinze) que
é responsável pela cor percebida pelo olho humano (KRINSKY; JOHNSON, 2005). Para as
indústrias farmacêutica, cosmética, química e de alimentos, os carotenoides representam um
grupo de moléculas valiosas, não só por agirem como percussores da vitamina A, mas também
por suas ações como antioxidantes, corantes e melhoradores da resposta imune, levando a
prevenção de doenças e a proteção contra infecções por bactérias e fungos (AKSU; EREN,
2007; MALDONADE; SCAMPARINI; RODRIGUEZ-AMAYA, 2007).

Figura 2. Estrutura molecular dos principais carotenoides

Fonte: Adaptada (HERNÁNDEZ-ALMANZA et al., 2014a)

Em 2015, a receita global de carotenoides atingiu 432,2 milhões de dólares americanos,

dos quais as algas representaram 35% (HU, 2019). Em 2018, a receita de β-caroteno sintético

28
 29

do mercado global foi de US $ 223,9 milhões, e estima-se que, em 2027, a taxa composta de
crescimento anual de β-caroteno será de 3,5% (MARKET, 2018). Já em 2019, a receita geral
de β-caroteno chegou a US $ 532 milhões (HU, 2019). A perspectiva para 2021 da participação
de carotenoides, separados por cada tipo, no mercado global está na Figura 3 onde existe uma
importante estimativa de participação do betacaroteno e da astaxantina segundo Rammuni et
al. (2019). Portanto, existe um interesse no desenvolvimento de processos visando uma
produção eficiente destes compostos (MANNAZZU et al., 2015).

Figura 3. Estimativa de participação de carotenoides no mercado mundial em 2021

30%
26%
25%
25%

20% 18%

15%
15%

10%
10%
6%
5%

0%

Fonte: Rammuni et al. (2019).

Assim, diversas alternativas têm sido estudadas para a obtenção de carotenoides com
custos mais reduzidos, podendo-se destacar a produção por via microbiana utilizando-se
microalgas, bactérias e fungos (VALDUGA et al., 2009).

3.4.1 β-caroteno

O β-caroteno é responsável pela característica alaranjada nos alimentos, comumente

encontrado em plantas e em tecidos de animais. Segundo Malisorn e Suntornsuk (2009) o β-
caroteno é considerado um nutriente essencial devido as suas funções biológicas e ao seu papel

29
 30

como percussor da vitamina A e de hormônios. A vitamina A é importante para o corpo

humano, auxiliando o sistema imunológico e consequentemente prevenindo algumas doenças
como alguns tipos de câncer e doenças nos olhos e na pele (AGARWAL; RAO, 2000). O β-
caroteno possui no organismo humano atividade antioxidante e assim ajuda a reduzir os efeitos
dos radicais livres, evitando o envelhecimento precoce (TÖRNWALL et al., 2004). Devido as
suas propriedades antioxidante e sua função como corante o β-caroteno é amplamente utilizado
na indústria de alimentos e na indústria farmacêutica em cosméticos e fármacos (MALISORN;
SUNTORNSUK, 2009).

3.4.2 Astaxantina

Este carotenoide de coloração vermelha é encontrado em alguns pescados, como

camarão, lagosta e salmão, sendo responsável pela coloração vermelho-rosada destes animais,
além de poder ser biossintetizado por microalgas, representando o primeiro nível de produção
no ambiente aquático, (CHEN et al., 2009). A astaxantina é um carotenoide pertencente à
família das xantofilas que pode ser encontrado em grande quantidade na microalga
Haematococcus pluvialis e em microalgas do gênero Chlorella (PARK; LEE, 2001). Apesar de
poder ser sintetizada por plantas, bactérias e alguns fungos, a microalga H. pluvialis possui a
maior capacidade para o acúmulo de astaxantina na célula, podendo-se obter de 4 a 5% em
relação a sua biomassa seca (YUAN et al., 2011). A astaxantina possui atividade antioxidante
e diversos estudos têm demostrado os efeitos positivos da astaxantina para a prevenção e
tratamento de várias doenças como, câncer, doenças crônicas inflamatórias, síndromes
metabólicas, diabetes, doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas e doenças nos
olhos e na pele (RAO et al., 2013). O interesse pelo uso da astaxantina como corante natural na
indústria de alimentos e como aditivo em rações para a aquicultura tem crescido nos ultimos
anos. Sua molécula apresenta dois grupos carbonila, dois grupos hidroxila e onze duplas
ligações etilênicas conjugadas (Figura 2). Este sistema polieno confere a astaxantina a sua
capacidade de absorção da luz (IP; CHEN, 2005). A astaxantina pode agir como um forte
antioxidante através da doação de elétrons para radicais livres tornando-os produtos mais
estáveis, bloqueando a reação em cadeia destes radicais em uma ampla variedade de organismos
vivos (YUAN et al., 2011).

30
 31

3.5 OBTENÇÃO DE CAROTENOIDES A PARTIR DE MICRORGANISMOS

Por um longo período extratos de plantas estiveram sendo utilizados como fontes de
pigmentos carotenoides, particularmente β-caroteno e xantofilas (WICHUK;
BRYNJÓLFSSON; FU, 2014). Embora plantas ainda sejam importantes fontes de carotenoides
naturais, vários processos microbiológicos têm sido comercialmente explorados para a
obtenção de tais compostos (CAMPENNI et al., 2013). O controle de processos
microbiológicos em reatores é mais fácil e mais eficiente, enquanto a produção de culturas
vegetais é mais propensa a intempéries do ambiente (clima) e de grandes espaços de plantio,
ficando mais difícil de se controlar.
A função mais importante dos carotenoides nas leveduras é a proteção contra a
combinação prejudicial do oxigênio singleto (1O2) com a luz visível ou UV (BERERA et al.,
2010). Sua síntese e armazenamento é intracelular e a ação destas moléculas está em desativar
os radicais livres produzidos durante o metabolismo normal das células, tais como o 1O2, o
radical hidroxila (OH-), peróxidos e outros oxidantes por meio de um processo no qual a energia
é transferida de altos níveis de excitação para uma molécula de carotenoide, a qual pode retornar
ao estado fundamental liberando calor (BERERA et al., 2010). Moliné et al. (2009) estudaram
o papel fotoprotetor dos carotenoides em leveduras através da comparação das respostas à
radiação UV-B de células pigmentadas e albinas naturais. O estudo foi realizado com diferentes
tempos de exposição à radiação UV-B, em vários estágios do crescimento da levedura. Da
mesma forma avaliaram a produção de carotenoides por fotoindução e o efeito da radiação UV-
B na sobrevivência das leveduras. Estes autores observaram que as cepas pigmentadas são mais
tolerantes a radiação do que as cepas albinas e que o aumento no teor de carotenoides durante
a fase de crescimento estacionário beneficiou a sobrevivência das leveduras.
A produção de carotenoides pela levedura R. glutinis cultivada em diferentes
subprodutos agroindustriais vem sendo estudada. Malisorn e Suntornsuk (2009), aplicaram um
planejamento composto central rotacional para otimizar as condições de cultivo para a levedura
R. glutinis DM28, tendo como resposta a produção de β-caroteno. Neste trabalho, os
experimentos foram conduzidos em um tanque reator com agitação e a salmoura de rabanete
fermentado foi utilizada como substrato. Os autores observaram que as condições ótimas para
a produção de β-caroteno (201 μg/L) foi de 30 °C, pH 6 e 80% de oxigênio dissolvido.
O desenvolvimento e otimização dos processos fermentativos para produção de
carotenoides tem a finalidade de aumentar o rendimento e, assim diminuir os custos de

31
 32

produção. Embora a variedade de microrganismos produtores de carotenoides seja grande,

apenas alguns microrganismos são industrialmente interessantes, como as leveduras.
A grande capacidade que as leveduras tem de crescer em vários substratos como
resíduos agroindustriais, tornam-nas microrganismos promissores para a produção de
carotenoides. A descoberta da produção de biomoléculas por meio de leveduras na década de
1960 e a elucidação das estruturas químicas dos pigmentos fizeram com que o interesse em
produzir carotenoides por leveduras aumentasse (MALDONADE; SCAMPARINI;
RODRIGUEZ-AMAYA, 2007).
Segundo Subramaniam et al. (2010), são vários os fatores que interferem no teor de
lipídeos e carotenoides durante a fermentação e são eles: composição do meio, fatores
ambientais incluindo aeração, pH, temperatura, tamanho do inóculo e período de incubação,
sendo que o fator mais determinante na produção dos biocompostos é o microrganismo
utilizado. A este respeito, demonstrou-se que os lipídeos produzidos por Rhodotorula glutinis
podem ser utilizados como matéria-prima na indústria de alimentos e de ração animal, podendo
também ser empregados nutricionalmente como fonte importante de ácidos graxos (Ribeiro et
al, 2019). Até mesmo agentes químicos têm sido utilizados com o simples objetivo de gerar
estresse no momento da fermentação com a finalidade de otimizar a produção de metabólitos
intracelulares. Pupo et al. (2017) usando 4-metilciclohexanometanol bruto induziu o acúmulo
de metabólitos intracelulares, por meio de seus efeitos no metabolismo de aminoácidos.
Parâmetros físicos, nutricionais, concentrações de vitaminas e minerais, pH, luz estresse,
aeração, temperatura, irradiação, radiação e etc., são também estudados pelo fato de
influenciarem o metabolismo das leveduras (BUZZINI, 2000; MALISORN et al., 2008).
Shekhawat et al. (2019) avaliaram o cultivo de Saccharomyces cerevisiae e Lachancea
termotolerans em cultura mista em biorreator onde as fermentações foram feitas em condições
cuidadosamente controladas para reduzir respostas que poderiam ser causadas por outros
fatores além da presença da segunda espécie. A fermentação mista gerou um ambiente mais
competitivo e estressante para as duas leveduras e criou um conjunto diferente de desafios para
o seu crescimento gerando assim uma maior produção de metabolitos celulares.

3.5.1 Rhodotorula glutinis

Rhodotorula glutinis é um microrganismo aeróbico capaz de produzir carotenoides em
suas células, como fruto do seu metabolismo, sintetizando o β-caroteno, o toruleno e a
torularrodina como carotenoides principais (AKSU; EREN, 2007). Esta levedura apresenta alto

32
 33

potencial para ser utilizada na indústria de alimentos por ser uma fonte de moléculas de alto
valor comercial, como: proteínas presentes em sua massa celular, pigmentos naturais e ácidos
graxos insaturados como os ácidos oleico, linoleico e linolênico (SAENGE et al., 2011). Devido
à capacidade natural de produção deste gênero, além da produção de lipídeos, ele também tem
a capacidade de produzir diversos compostos industriais-alvo e, portanto, há pesquisas
aprofundadas sobre este gênero. Não obstante, o gênero Rhodotorula também produz
carotenoides, enzimas e terpenos (Park et al., 2017). O emprego deste microrganismo em
processos biotecnológicos voltados para a obtenção destes compostos tem sido amplamente
estudado e resultados atrativos têm sido obtidos a partir destas investigações. Cutzu et al. (2013)
avaliaram a produção de carotenoides por R. glutinis em meio de cultura contendo glicerol e
obtiveram uma produção máxima de carotenoides 14 mg/L.
Esta espécie pertence ao filo Basidiomycota, classe Urediniomycetes e ordem
esporídica. As células possuem um diâmetro de três a cinco micrômetros, com formato elíptico,
brotação multipolar, produzindo pseudo-hifas e apresentam reprodução sexual com conexão
micelial da braçadeira e teliosporos. Leveduras do gênero Rhodotorula são encontradas no ar,
no solo e em frutas e folhas, podendo ser encontradas também em leite e derivados
(HERNÁNDEZ-ALMANZA et al., 2014b).

3.5.2 Paffia Rhodozyma (Xantofilomices dendrohous)

Esse microrganismo foi isolado no início do ano de 1970 a partir de material expelido
de árvores em regiões montanhosas do Japão e Alaska. Foi originalmente designada
“Rhodozyma montanae”, mas suas características incomuns e a falta de uma descrição em latim
levou a uma mudança deste gênero para Phaffia, em homenagem a Herman Jan Phaff. Desde
então basidiósporos e conjugações foram observados na P. rhodozyma, o novo nome
Xanthophyllomyces dendrorhous foi recentemente proposto (JOHNSON, 2003).
Pertence à classe dos basidiomicetos, possui células isoladas de forma elíptica, podendo
estar isoladas ou aos pares. A composição da sua parede celular é multicamada sendo formada
por polissacarídeos (Miller et al., 1976). A cor da célula intacta da levedura Phaffia rhodozyma
é laranja para vermelho alaranjado devido à presença de carotenoides, principalmente
astaxantina no citoplasma (MACÍAS-SÁNCHEZ et al., 2010). Entre os organismos produtores
de astaxantina, somente a alga verde Haematococcus pluvialis e a levedura Xanthophyllomyces
dendrorhous são atualmente consideradas de interesse industrial.

33
 34

A levedura Xanthophyllomyces dendrorhous produz principalmente o carotenoide

astaxantina, que apresenta bastante interesse no meio científico e industrial por ter capacidade
antioxidante biológica bem mais potente que os outros carotenos. O microrganismo
Xanthophyllomyces dendrorhous, apresenta potencial adequado para o uso como fonte de
produção de carotenoides em razão do seu padrão de crescimento relativamente rápido, seu
metabolismo heterotrófico, habilidade para alcançar alta densidade celular em fermentadores
industriais, qualidade nutricional e segurança como aditivo alimentar (BONFIM, 1999),
possuindo a aprovação como um microrganismo GRAS (Generally Recongized as Safe) nos
Estados Unidos. Portanto, a produção de astaxantina a partir de fontes naturais, como esta
levedura, é uma alternativa em potencial para a substituição da obtida por via sintética (BIFF;
SILVA, 2016).

3.6 EXTRAÇÃO E RECUPERAÇÃO DOS CAROTENOIDES

É importante para a indústria tanto a bioprodução de carotenoides quanto métodos que

promovam a recuperação de alta eficiência e baixo custo, porém, as etapas de recuperação e
extração do produto ainda carecem de tecnologias alternativas, principalmente no processo de
produção de carotenoides intracelulares, visando otimizar a taxa de recuperação, ajudando a
reduzir os custos operacionais (PETRIK et al. 2014)
A parede celular é uma camada relativamente dura encontrada nas células de plantas e
microrganismos, como bactérias, algas, fungos e leveduras. Além de estar relacionado à
sinalização celular, adesão e digestão extracelular, também fornece suporte osmótico e
determina a forma das células (MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS, 2005).
A levedura é envolvida por uma parede celular dura, que representa cerca de 20 - 25%
do peso celular seco. Na maioria das leveduras, a parede celular é composta por 85 - 90% de
polissacarídeos e 10 - 15% de proteínas (NGUYEN; FLEET; ROGERS, 1998). Os carotenoides
produzidos pela maioria dos organismos estão presentes nas células, portanto, para extrair os
carotenoides, esta parede deve ser efetivamente quebrada (MICHELON et al., 2012).
A extração de carotenoides com solventes orgânicos é um dos métodos mais utilizados
(ZAGHDOUDI et al., 2015). Park et al. (2007) mostraram que a extração de carotenoides
presentes nas paredes celulares dos microrganismos depende da habilidade do solvente em
penetrar na parede celular e da solubilidade dos carotenoides com o solvente utilizado. No
entanto, com o aumento das restrições ao uso de solventes, muitas vezes tóxicos, o interesse do

34
 35

consumidor em produtos naturais levou à exploração de outros métodos de extração (SUN;

TEMELLI, 2006).
Michelon et al. (2012) compararam os efeitos de diferentes tecnologias de ruptura
celular (métodos físicos, químicos, enzimáticos e combinados) de extração de carotenoides de
Phaffia rhodozyma. Os melhores resultados (195,35 μg/g) foram obtidos quando a tecnologia
combinada de maceração de biomassa congelada e pérolas de vidro foram usadas em conjunto
com solventes químicos.
Outra tecnologia que pode ser usada para rompimento celular é o sistema de ultrassom,
que inclui um processo que utiliza energia ultrassônica. A frequência de transmissão do
ultrassom é superior à frequência da capacidade auditiva humana (acima de 20 kHz). As ondas
ultrassônicas se propagam pela matéria, produzindo compressão e expansão, fazendo com que
as moléculas se separem e se aproximem (LUENGO et al., 2014; LUQUE-GARCIA; DE
CASTRO, 2003). O ultrassom aumenta a permeabilidade da parede celular e produz cavitação,
levando a um forte estresse dinâmico, aumentando assim o estresse mecânico da célula, também
conhecido como atrito interfacial. O ultrassom destrói a parede celular, aumenta a penetração
do solvente e o contato entre a fase soluto/solvente, promove assim a liberação do extrato
(JACQUES et al., 2007; SHIRSATH; SONAWANE; GOGATE, 2012). Além disso, o
ultrassom pode ser utilizado para aumentar efetivamente a taxa de extração, aumentar a taxa de
transferência de massa e possível ruptura da parede celular, pois a formação de microcavidades
leva a maiores rendimentos, reduzindo o tempo e o consumo de solvente (SHIRSATH;
SONAWANE; GOGATE, 2012).
No estudo da extração de carotenoides de X. dendrorhous, Urnau et al. (2018),
observaram que o nível máximo de recuperação de 697 µg/g foi obtido em um meio de produção
biológica usando um sistema ultrassônico para ruptura celular (40 KHz, 56 minutos e 22 °C) e
extração com acetona: metanol (7:3, v/v). Silva et al. (2009) utilizaram dimetilsulfóxido
(DMSO) e homogeneização em vórtice para avaliar a ruptura celular da levedura P. rhodozyma,
e obteveram um nível máximo de recuperação de 538 µg/g de um carotenoide específico.
Depois que as células são quebradas, os carotenoides devem ser extraídos das células
microbianas. Como os carotenoides são lipossolúveis, geralmente são extraídos com solventes
orgânicos, como acetona, éter de petróleo, hexano e etanol (MENDES-PINTO et al., 2010). A
escolha do solvente é muito importante para a obtenção de extratos de alta qualidade, e deve
ser não-inflamável, não-tóxico e não-volátil. Porém, é difícil encontrar solventes que atendam
a todas essas características (SANCHEZ CAMARGO, 2010). Monks et al. (2012) avaliaram a

35
 36

mistura de acetona: metanol (7:3 v/v), etanol: diclorometano (1:3 v/v) e etanol: acetato de etila
(1:3 v/v), obtendo melhores resultados nos experimentos com acetona: metanol, com um
conteúdo de carotenoides de 2875,23 μg/L.

36
 37

4. METODOLOGIA

4.1 MATÉRIA-PRIMA

Todos os experimentos foram realizados no Laboratório de Bioengenharia da

Universidade Federal da Paraíba (UFPB) em João Pessoa, Paraíba. A manipueira utilizada para
a pesquisa foi fornecida pela casa de farinha "Folha Verde" localizada em Sobrado, Paraíba
(07º 08 '43 "S, 35º 14' 11" W). A manipueira foi coletada imediatamente após a prensa (Figura
4) da mandioca durante a produção da farinha, foi envasada em frascos e congelada a -5 ºC.

Figura 1. Produção, coleta e envase da manipueira.

Fonte: Autor (2020)

Antes da utilização da manipueira nos experimentos, com o intuito e clarificar o resíduo,

foi realizado um pré-tratamento, onde a amostra foi aquecida a 100 °C por 20 minutos, resfriada
e centrifugada a 3248 g por 5 minutos, coletando-se o sobrenadante e descartando o resíduo
sólido remanescente. Em seguida, foi diluída com água destilada até atingir a concentração de
açúcares redutores padrão (g/L) para o início de todos os experimentos, de acordo com Ribeiro
et al. (2018), que determinou 10 g/L como a concentração de açúcar redutor ótima para diluição
da manipueira para o cultivo.

4.2 ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DA MANIPUEIRA

4.2.1 AÇÚCARES REDUTORES, NÃO REDUTORES E TOTAIS

Para determinação dos açúcares redutores e não redutores, utilizou-se uma modificação
do método do DNS, que foi proposto por Miller (1959).
37
 38

Preparo das soluções utilizadas:

Para a solução de NaOH 2 mol/L foi utilizado um Bécker de 250 mL e foram pesados 8
g de NaOH PA e dissolvidos com 50 mL de água destilada em banho com água fria. A solução
foi transferida para balão volumétrico de 100 mL e aferida com água destilada.
Para o preparo da solução de DNS, foram pesados 5 g de DNS (ácido 3,5 – dinitro-
salicílico) e adicionados 100 mL de NaOH 2 mol/L, em Becker de 250 mL. Em um Bécker de
500 mL foram pesados 150 g de tartarato duplo de sódio e potássio e dissolvidos em 250 mL
de água destilada. A solução foi levada para aquecimento até dissolver completamente e a ela
foi adicionado à solução de DNS sob aquecimento até dissolver completamente. Deixou-se
esfriar, e aferiu-se em balão de 500 mL com água destilada. A solução foi armazenada em frasco
escuro sob condições mínimas de luz.
Para confecção da curva padrão do reagente foram pesados 100 mg (0,1 g) de glicose e
dissolvidos em 100 mL de água destilada em balão volumétrico. Após agitação vigorosa para
homogeneizar, transferiu-se 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 mL da solução-mãe para tubos de ensaio e o
volume foi completado para 10 mL com água destilada. Os tubos foram homogeneizados e de
cada tubo transferiu-se 1 mL para tubos com 1 mL de DNS (em duplicata). Os tubos foram
aquecidos a 100 °C por 5 min, tendo-se o cuidado de não colocar os tubos antes de aquecimento
vigoroso do banho e então resfriados em banho com água à temperatura ambiente por 3 min. A
cada tubo foram adicionados 8 mL de água destilada, e após homogeneizado, a absorbância foi
lida a 540 nm. Com os valores de absorbância, foi construída a curva de absorbância versus
concentração.
Durante a análise das amostras, inicialmente transferiu-se 1 mL para tubos de ensaio
contendo 1 mL de solução DNS. A seguir, os tubos foram levados para banho de água fervente
por exatos 5 min. Após este intervalo, os tubos foram retirados do banho de água quente e
colocados em banho de água fria por 3 min, até completo resfriamento. Em cada tubo foi
adicionado 8 mL de água destilada e feita a leitura imediatamente a 540 nm. A curva padrão foi
usada para transformar a leitura de absorbância em miligramas de açúcares redutores por
mililitro de solução. Efetuaram-se os cálculos para expressar os resultados em gramas de
açúcares redutores por litro de amostra inicial. Quando a amostra tem sacarose em sua
composição é necessário fazer a inversão da sacarose, para análise dos Açúcares Totais. Para
tal, foram misturados 1 mL da amostra com 1 mL de solução de ácido clorídrico 2 mol/L (16,8

38
 39

mL de ácido concentrado por 100 mL), em seguida os tubos foram colocados em banho com
água fervente por 5 min e resfriados em banho de água gelada. Depois de esfriar foram
adicionados 2 mL de hidróxido de sódio 2 mol/L. Homogeneizou-se bem e seguiu-se o
procedimento idêntico à determinação de açúcares redutores a partir do item 5 da curva padrão.
Neste caso multiplicou-se o resultado por 4 (diluição) para obter o valor de açúcares redutores
totais (g/L). As análises foram feitas em triplicata.

4.2.2 UMIDADE

Para quantificação do percentual de umidade foi utilizado o método de secagem em

estufa comum (AOAC, 1990). Foram pesados 5 g da manipueira totalmente líquida, bem
homogeneizada, em cápsulas de alumínio codificadas, previamente secas e taradas, anotando-
se a massa das cápsulas e da amostra, e logo em seguida as cápsulas foram levadas para a estufa
a 105 °C. Após 24 h, as cápsulas foram retiradas da estufa e colocadas em dessecador durante
20 min para esfriar, em seguida pesadas e anotou-se a massa final para efetuar-se os cálculos.
As análises foram realizadas em triplicata.

4.2.3 CINZAS

Cadinhos de porcelana vazios foram colocados em mufla e deixados a 550 °C, durante
15 min, em seguida foram deixados em dessecador até atingir a temperatura ambiente. Foram
pesados vazios e com 5 g da amostra, anotando-se ambas as leituras. Logo após a pesagem, os
cadinhos foram levados à mufla durante aproximadamente 6 h, a 550 ºC, ou até o clareamento
da cinza. Logo após os cadinhos foram retirados da mufla e colocados diretamente no
dessecador para que atingissem a temperatura ambiente, novamente pesados, anotando-se as
leituras finais para efetivação do percentual de cinzas na amostra (AOAC, 1990) e as análises
foram feitas em triplicata.

4.2.4 DETERMINAÇÃO DE PROTEINAS

A concentração de proteínas foi realizada pelo método de Bradford, onde as leituras

foram feitas a 595 nm (BRADFORD, 1976). Neste método ocorre ligação do corante azul de
Cromassie BG-250 com grupos funcionais básicos ou aromáticos das proteínas. Para isto

39
 40

ocorrer, a proteína deve ter estrutura macromolecular complexa, ou seja, de 8 - 9 ligações

peptídicas no mínimo. A ligação ocorre em dois minutos, e essa dura aproximadamente duas
horas (Bradford, 1976). As análises foram feitas em triplicata.

4.2.5 DETERMINAÇÃO DO pH

Para o ajuste do pH da manipueira, utilizou-se um pHmetro digital (DIGIMED DMPH-

2). Foi tomado o cuidado de realizar a calibração do eletrodo em solução tampão dentro do
prazo de validade, com pH 7,0 e 4,0 e só então foi realizada a leitura

4.2.6 SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS (ºBRIX),

A concentração de sólidos solúveis totais foi medida em ºBrix. Adicionou-se 1 mL da

amostra a 9 mL de água destilada e, após homogeneização, foi realizada a leitura em
refratômetro. O resultado foi multiplicado por dez, devido à diluição, a fim de determinar o teor
de sólidos solúveis do resíduo (AOAC 1990).

4.2.7 MASSA ESPECÍFICA

A determinação da massa específica da manipueira foi realizada pela medição da massa

e do volume ocupado pela mesma (Equação 1). Foi colocado manipueira em uma proveta de
100 mL, e pesou em balança. Ao completar os 100 mL a massa foi anotada. O cálculo da
densidade é obtido pela Equação 1.

𝑚
𝜌= (eq: 1)
𝑉
Onde:
𝑚 = massa (g);
𝑉 = volume (mL);

4.3 MICRORGANISMOS

As leveduras Rhodotorula glutinis e Paffia rhodozyma, foram adquiridas da coleção da

Fundação André Tosello (Campinas, São Paulo, Brasil) e foram armazenadas no Laboratório
de Processos Biotecnológicos do Centro de Tecnologia (CT) da Universidade Federal da
40
 41

Paraíba (UFPB).
As leveduras foram obtidas na forma liofilizada, hidratadas por 10 dias, a uma
temperatura de 30 °C, em meio YM, contendo: 3 g/L de extrato de levedura, 3 g/L de extrato
de malte, 5 g/L de peptona e 10,0 g/L de glicose. Depois deste período as células foram
transferidas com uma alça esterilizada para placas de Petri contendo o meio YM com 2% de
ágar bacteriológico (meio YMA). As placas foram incubadas de forma invertida a 30 °C por 48
horas e armazenadas em refrigeração a 5 °C até o momento dos experimentos (RIBEIRO,
2018).

4.4 PREPARO DO INÓCULO

Inicialmente cada microrganismo foi cultivado em frascos Erlenmeyer de 300 mL

(Figura 5) contendo 100 mL de meio de cultura sintético (meio YM): glicose (10 g/L), peptona
(5 g/L), extrato de levedura (3 g/L) e extrato de malte (3 g/L). Esses frascos foram incubados a
30 °C, foram agitados a 3 g durante 24 h. Posteriormente, foram coletadas as células de levedura
por centrifugação a 1182 g durante 5 min. As células foram suspensas em água estéril destilada
para fazer uma concentração celular final de aproximadamente 10 9 células/mL. A câmara
Neubauer foi utilizada para determinação da concentração de células desta suspensão. Durante
a realização do cultivo misto o inóculo foi composto por 50% de células do microrganismo
Paffia rhodozyma e 50% de células de Rhodotorula glutinis.

Figura 2. Preparo do inóculo em meio YM

Fonte: Autor (2020)

41
 42

4.5 CULTIVO EM BIORREATOR

Ribeiro (2018) estudou o processo de produção de biomassa e carotenoides utilizando o

microrganismo Rhodotorula glutinis em Erlenmeyer de 200 mL e a manipueira como substrato.
Esta proposta teve como finalidade estudar a ampliação de escala experimentalmente de 0,2 L
para 3 L (15 vezes) e, portanto, foi utilizado o biorreator Tecnal Tec-Bio-V 4,5L (Figura 6). Os
parâmetros estudados por Ribeiro (2018) foram usados como padrão. O biorreator previamente
esterilizado foi acionado e se manteve durante toda a fermentação em 30 ºC e 150 rpm. Com o
objetivo de aumentar a concentração de nitrogênio foi feita uma suplementação com Sulfato de
Amônia (NH4)2SO4 na concentração de 5 g/L no início da fermentação (RIBEIRO, 2018). Os
cultivos foram realizados em duplicata.

Figura 3. Biorreator utilizado nos ensaios de produção de carotenoides.

Fonte: Autor (2020)

Os experimentos foram realizados em duplicata e antes da inoculação do microrganismo

no biorreator, foi tomado o cuidado de autoclavar o biorreator a 121 ºC por 15 minutos e após
o seu resfriamento as células foram inoculadas ao meio para que a fermentação fosse iniciada
com uma concentração celular de 107 células por mL.

42
 43

4.6 MÉTODOS ANALITICOS PARA AVALIAÇÃO DA CINÉTICA

MICROBIANA

4.6.1 Consumo de substrato (AR)

Para analisar o consumo do substrato durante a fermentação foi utilizado uma

modificação do método DNS originalmente proposto por Miller (1959). As análises foram
feitas a cada 12 h (0, 12, 24, 36, 48, 72, 84 e 96 horas) e para isso utilizou-se alíquotas de 0,5
mL da amostra e 0,5 mL de solução de ácido 3,5-dinitrosalisílico (DNS), incubado por 5
minutos a 100 ºC. A mistura foi resfriada com um banho de gelo e a leitura da absorbância foi
feita após a diluição com água destilada utilizando um espectrofotômetro a 540 nm.

4.6.2 Determinação de Biomassa

Foram retiradas amostras do cultivo (alíquotas de 2 mL) para análise de concentração

de células (g/L) e cinética microbiana durante os intervalos de tempo de 0, 12, 24, 36, 48, 72,
84 e 96 horas. Cada amostra foi centrifugada a 11200 g por 3 min, onde o crescimento analisado
por meio da análise da turbidez do meio em espectrofotômetro modelo U2M Quimis no
comprimento de onda de 600 nm. O meio sem as células, e na mesma diluição das amostras,
foi utilizado como branco (RIBEIRO, 2018). Para a quantificação da concentração de biomassa
no meio foi utilizada uma curva padrão com os valores de densidade ótica em função da
concentração de biomassa seca e todas as amostras foram analisadas em triplicata.

4.6.3 Extração e quantificação de lipídeos

Os lipídeos totais foram analisados após o termino do cultivo (84 h após o inóculo) e
para isso utilizou-se o método de Bligh; Dyer (1959), as células passaram por centrifugação a
1182 g por 5 min, foram secas em estufa a 105 ºC por 24 h sendo na sequência maceradas em
um almofariz para se obter um pó fino. A ruptura celular foi realizada por meio de hidrólise
ácida e, portanto 5 mL de HCl 2 N foram adicionados à 200 mg da amostra seca e incubados
em um banho-maria a 80 ºC (modelo 105 Di-F, Dellta) pelo tempo de 1 h. Os lipídios foram
extraídos com 11,6 mL de uma mistura com a proporção 1:1:0,9 de clorofórmio: metanol: água
destilada.

43
 44

4.6.4 Analise de Ácidos graxos

A transesterificação dos lipídeos em FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos) foi realizada
de acordo com a metodologia proposta por por Hartman e Lago (1973). Os FAMEs foram analisados
usando um GC-FID (Trace™ 1310, Thermo Fisher Scientific, EUA) equipado com uma coluna capilar
SP™-2380 (60 m x 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 μm de espessura de filme). Diferentes picos
foram identificados por comparação com um padrão FAME (Supelco® Component FAME Mix, EUA),
quantificados e normalizados de acordo com suas respectivas áreas de pico.

4.6.5 Extração e quantificação de carotenoides totais

As determinações dos carotenoides totais foram feitas a cada 12 h após o inóculo através
da análise de 5 mL da amostra, coletada e transferida em seguida para um tubo Falcon de 50
mL. Logo após realizou-se a centrifugação, foi descartado o sobrenadante. A Figura 7 mostra
as células após o cultivo misto onde pode ser observado os metabolitos em forma de um ponto
brilhante no meio intracelular. Com a finalidade de romper a membrana celular foram
adicionados 2 mL de dimetilsulfóxido a 60 °C e 0,5 g de pérolas de vidro. Posteriormente, o
conjunto foi agitado em vórtex por 2 min. Em seguida, foi realizado a incubação do sistema a
60 °C por 15 min. Após esse momento de incubação, foram adicionados 2 mL de éter de
petróleo e mais uma agitação de 2 min foi realizada. Para finalizar, foram adicionados 2 mL de
solução de NaCl 20% (m/v) e agitado em vórtex por 1 min. O conjunto foi então centrifugado
a 1452 g por 10 min e então foram retiradas 3 ml do sobrenadante e procedeu-se à leitura em
espectrofotômetro (450 nm). Neste momento a absorbância foi então convertida em
concentração através da Equação 2.

Carotenoides totais = (A × V × 104) / (a × m) (2)

Em que:
[Carotenoides totais]: concentração de carotenoides totais em μg/g de célula;
A: absorbância a 450 nm;
V: volume de extrato da amostra (L);
m: massa de amostra (kg);
a: absortividade molar da espécie química (carotenoides em geral = 2592
(RODRIGUEZ-AMAYA; KIMURA, 2004) e astaxantina = 2100 (SEDMAK,
44
 45

WEERASINGHE &JOLLY, 1990).

Figura 4. Cultivo misto com os microrganismos Rhodotorula glutinis e Paffia rhodozyma

após cultivo em biorreator, com aumento de 100×.

Fonte: Autor (2020)

45
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53
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ARTIGO 1: PRODUCTION OF BIOMOLECULES THROUGH THE MICRO-

ORGANISM Rhodotorula glutinis IN A BIOREACTOR USING CASSAVA
WATER AS A CARBON SOURCE

ABSTRACT

Cassava wastewater is the residue from the production of cassava flour, improperly discarded
it causes damage to the environment. Despite its toxicity, cassava wastewater has interesting
physicochemical properties for the cultivation of microorganisms and production of different
bioproducts such as betacarotene, which has antioxidant activities in addition to serving as a
natural colorant. The biotechnological production of carotenoids is interesting due to the current
concern with use of chemical additives in foods and cosmetics. Among betacarotene-producing
microorganisms, the yeast Rhodotorula glutinis has advantages of having a high growth rate
and producing significant amounts of carotenoids. The aim of this work was to evaluate the
viability of using the cassava wastewater as substrate for the production of carotenoids, lipids
and biomass in an integrated bioreactor. R. glutinis cells were initially cultivated in YMA
medium and inoculated in a bioreactor containing 3 L of cassava wastewater diluted in
autoclaved distilled water with 5 g/L of ammonium sulfate. The cultures were carried out in an
integrated bioreactor programmed to maintain temperature at 25 °C under constant agitation of
for 84 h; samples were collected for analysis of biomass, lipids and carotenoids. Regarding the
results of cultivation in bioreactor, the maximum biomass produced was 8.81 g/L, 72 h after
the inoculum, 0.81 g/L of lipids and 1.41 mg/L of carotenoids. The yeast Rhodothorula glutinis
showed important growth when cultivated in a bioreactor in medium containing cassava
wastewater as carbon source, producing important intracellular metabolites. These results
support the feasibility of cassava wastewater as substrate used in biotechnological process with
the aim of producing carotenoids and lipids.

Key-word: Carotenoids; Agro-industrial-waste; Biotechnology.

1 INTRODUCTION

54
 55

Industrial waste disposal has become one of the reasons of environmental pollution and,
as a result it has been one of the largest problems in the modern world, promoted by huge
formation of waste. The management of that waste after its production has been a common
problem that industry must deal with (Mazurczak et al., 2017). Biotechnology has presented
many advances that offer several possibilities of use, including economic reasons, for agro-
industrial residues, thus avoiding their accumulation and, therefore, helping to preservation of
rivers, groundwater and soils (Stroparo, Beitel, Resende & Knob, 2012).
One way to solve this problem is to use these residues as a carbon source for
biotechnological production, since they are generally rich in their composition. An example of
this type of waste is the water from cassava pressing during the flour production (Suman et al.
2011).
Cassava (Manihot esculenta Crantz) has a tuberous root system responsible for storing
its starch reserves. It is grown and consumed mainly on Africa, Asia and South America.
Cassava production in Brazil in 2020 was estimated at around 19 million tons (IBGE 2021).
The North and Northeast regions of Brazil are the main producers of cassava. These regions
have thousands of flour houses destined to small productions (EMBRAPA, 2019). Considering
the cassava has an average of 300 liters of cassava wastewater per ton of root (Chuzel, 2001),
this residue cannot be neglected. Silva et al. (2018) used this residue as carbon source for
microbial cultivation and interesting results were observed, such as the biosynthesis of lipids
and carotenoids by the genus Rhodotorula.
Rhodotorula is a genus of unicellular yeasts, part of the phylum Basidiomycota, family
Cryptococcaceae, subfamily Rhodotorulodae and has reddish pigmentation (Tang et al., 2019).
It can be found in different sources, such as fruits, soil and in the sea (Kurtzmanet al., 2011).
Nowadays, due to natural production capacity of this genus, in addition to the production of
lipids, it also has ability to produce several industrial target components and, therefore, there
are many researches on this genus. Nevertheless, the genus Rhodotorula also produces
carotenoids, enzymes and terpenes (Park et al., 2017). Several yeasts of Rhodotorula genus
have been classified as oilseeds, as they can accumulate between 40-70% (w/w) of intracellular
lipids (Viñarta et al., 2016). There are many factors that have effect on the amount of lipids and
carotenoids produced during fermentation, such as: composition of the medium, environmental
factors including aeration, pH, temperature, size of the inoculum and incubation period. The
most determining factor in production of biomolecules is the used microorganism

55
 56

(Subramaniam et al., 2010).

It was observed that produced lipids by Rhodotorula glutinis can be used like raw matter
in food industry and in animal feed industry. They can also be used as important source of fatty
acids (Ribeiro et al, 2019). The yeast R. glutinis has been extensively studied because of its
great production capacity for both b-carotene and lipids. In addition, this yeast has a high
growth rate and is well adapted to using various low-cost agricultural raw materials as a carbon
source, thus demonstrating great potential for industrial applications. Carotenoids are natural
dyes and have an important role as antioxidants, thus acting in health promotion and, for this
reason, there is a growing interest in methods of obtaining these compounds.
An alternative currently used in the production of carotenoids and lipids is cultivation
in an integrated bioreactor, mainly due to its ability to optimize the process, its power to control
variables and its safety. Since these compounds can be used in different areas, such as food,
cosmetics, pharmaceuticals and feed.

2. Material and methods

2.1. Treatment and characterization of substrate
The assays were carried out in Bioengineering Laboratory at Federal University of
Paraíba (UFPB), in the city of João Pessoa. Cassava wastewater used in this research was
collected from the flour mill called “Folha Verde”, at city of Sobrado (07º 08’ 43” S, 35º 14’
11” O) Paraíba, Brazil. Cassava wastewater was collected, in loco, in the processing of
production of cassava flour, right after pressing the crushed cassava.
The use of cassava wastewater, in the assays, was preceded by a pre-treatment being
heated at 100 °C for 20 min, after cooled and centrifuged at 1182 g for 5 min. Then, the
supernatant was collected and the solid residue remaining was discarded. Finally, supernatant
was then diluted with distilled water until reaching the concentration of reducing sugars 10 g/L
standard to start all the assays (RIBEIRO et al., 2019)).

2.2. Microrganism
The yeast Rhodotorula glutinis (CCT 2182), was obtained from culture collection of the
André Tosello Foundation (Campinas, São Paulo, Brazil) and was stored in the
Biotechnological Processes Laboratory of the Technology Center (CT) of the Federal
University of Paraíba (UFPB). The cells of R. glutinis, obtained in lyophilized form, were
hydrated for 10 days at 30 °C, in YM medium, containing: 3 g/L of yeast extract, 3 g/L of malt

56
 57

extract, 5 g/L of peptone and 10.0 g/L of glucose. After, cells were transferred with a sterile
loop to Petri dishes containing YM medium with 2% bacteriological agar (YMA medium). The
plates were incubated upside down at 30 °C for 48 hours and stored in refrigeration at 5 °C
(RIBEIRO et al., 2019).

2.3. Inoculum
Pre-cultures were transferred to 300 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL of culture
medium (YM medium): glucose (10 g/L), peptone (5 g/L), yeast extract (3 g/L) and malt extract
(3 g/L). The cells were incubated at 30 °C on an orbital shaker at 3 g for 24h. Subsequently,
yeast cells were collected by centrifugation at 1182 g for 5 min. Cells were suspended in sterile
distilled water until cell concentration of 10 9 cells/ml. The cell quantitation was determined
using a Neubauer with 1% mm deep counting chamber under the light microscope field.

2.4. Scale up in Bioreactor

Based on the work of Ribeiro et al. (2019) in bench scale using 200 mL Erlenmeyer, the
scale-up was studied experimentally from 0.2 L to 3 L (15 times). For this study, Tecnal Tec-
Bio-V 4.5L bioreactor (maximum volume) was used. To seek optimization of the scale-up
process, the parameters studied by Ribeiro et al. (2019) were used as a standard (central point)
and extended to higher and lower values of these parameters, using the factorial planning
methodology and response surface. Supplementation with (NH4)2SO4 as nitrogen source at a
concentration of 5 g/L at the beginning of fermentation, temperature 25 ºC, pH 7.0 and stirring
speed of 3 g were performed. Cultivations were performed in triplicate.

2.5. Analytical methods for evaluating microbial kineticss

Biomass
Microbial kinetics were analyzed using 2 mL aliquots and collected during time
intervals of 0, 12, 24, 36, 48, 72, 84 and 96 hours. The samples were centrifuged at 11200 g for
3 min, cell concentration was determined spectrophotometrically (U2M Quimis model
spectrophotometer) at wavelength of 600 nm. To quantify cell concentration in the medium, a
standard curve with optical density values as a function of dry biomass concentration was used.
The medium without the cells, and at the same dilution as the medium samples.

Reducing sugars (RS)

57
 58

A modification of DNS method (Miller, 1959) was used. 0.5 mL of the sample and 0.5
ml of 3,5-dinitrosallylic acid (DNS) solution were used, and it was incubated for 5 minutes at
100 ºC. The reaction was cooled with an ice bath and concentration was determined
spectrophotometrically at 540 nm.

Extraction and quantification of carotenoids

Extraction and quantification of carotenoids were performed 96 h after inoculation.
Samples of 5 mL were collected, then the aliquot was transferred to a 50 mL Falcon tube. After,
the solution was centrifugated and the supernatant was discarded, then 2 ml of dimethylsufoxide
at 60 °C and 0.5 g of glass beads were added. The solution was vortexed for 2 min. Then, the
system was incubated at 60 °C for 15 min. After this incubation period, 2 mL of petroleum
ether and 2 mL of Acetone were added and another shaking was performed for 2 min. Finally,
2 mL of 20% NaCl solution (w/v) were added and vortexed for 1 min. The final solution was
then centrifuged at 1452 g for 10 min. 3 mL of the supernatant were removed and read in a
spectrophotometer (450 nm). The absorbance was then converted into concentration using Eq.
1 (RODRIGUEZ-AMAYA; KIMURA, 2004).

A × V × 104
Total Carotenoids = ____________ (Eq1)
a×m

Where:
[Total Carotenoids]: concentration of total carotenoids in μg/g of cell;
A: absorbance at 450 nm;

58
 59

V: sample extract volume;

a: molar absorptivity of the chemical species (carotenoids = 2592);
m: sample mass.

Total Lipids
Determination of total lipids was performed according to the Bligh method; Dyer
(1959). The cells were centrifuged 1182 g for 5 min, dried in an oven at 105 ºC for 24 h, and
then crushed and ground in a mortar to obtain a fine powder. Cell disruption was performed by
acid hydrolysis and, therefore, 5 mL of 2N HCl was added to 200 mg of the dry sample and
incubated in a water bath at 80 ºC (model 105 Di-F, Dellta) for 1 h. The lipids were extracted
with 11.6 ml of a mixture of chloroform: methanol: distilled water (1:1:0.9). Transesterification
into FAMEs (fatty acid methyl esters) was performed according to the methodology proposed
by Hartman and Lago (1973). FAMEs were analyzed using a GC-FID (Trace™ 1310, Thermo
Fisher Scientific, USA) equipped with a SP™-2380 capillary column (60 m x 0.25 mm inner
diameter and 0.25 μm film thickness). Different peaks were identified by comparison with a
FAME standard (Supelco® 37 Component FAME Mix, USA), quantified and normalized
according to their respective peak areas.

Yield and productivity

The conversion factors were calculated according to the quantify of carotenoids
produced per unit mass of consumed substrate (Yp/s), the amount of biomass produced per unit
mass of consumed substrate (Yx/s) and the quantify of carotenoids produced per cell dry mass
unit (Yp/x) as well as carbon source (QS), cell productivity (QX) and carotenoids (QP) were
determined in different runs. The total production of lipids (g/L) was found at the end of the
process after 96 hours of cultivation.

3 RESULTS AND DISCUSSION

3.1 Physical Chemical characteristics of cassava wastewater

The data on the composition of substrate used confirm cassava wastewater as an
important carbon source to be used in biotechnological processes. Cassava wastewater has high

59
 60

concentrations of reducing sugars, in addition to 1.58% of protein, which is important for the
development of microorganisms (Table 1). The value of total sugar found (47.18 g/L) is 18.80%
lower than those found by Ribeiro et al. (2019), which was 58.11 g/L, however it was very close
to the value found by Silva et. al. (2018) who found 50.60 g/L and achieved excellent results in
production of carotenoids, lipids and biomass through the yeasts Rhodothorula glutinis and R.
mucilaginosa, respectively. This difference in total sugars was due to the difference in harvest
between cassava and, consequently, in the content of reducing sugars in cassava.
The value found for free cyanide (3.0 mg/L) was low when compared to those
previously reported in literature (Leonel and Cereda, 1995). Furthermore, Souza et al. (2014)
also found considerably low values of free cyanide, ranging from 5.30 to 16.60 mg/L. These
values differ, as the cassava plant used by the authors was collected in cassava flour houses
located in the semiarid region of the state of Alagoas (Northeast, Brazil), a region with a more
arid climate than the climate of the cassava grown and used in our samples. The concentration
of free cyanide in CW depends on the plant genotype, cultivation and processing, storage
conditions and time (Leonel and Cereda, 1995). All values found are far below the limit values
considered for human consumption, of 50 mg/kg of cassava (Bolhuis, 1954) or 36 mg/L of
cassava wastewater (Araújo et al. 2014). Therefore, all our runs were carried out with innocuous
levels of cyanide concentration. Another interesting factor of cassava wastewater was the pH
value of the medium. The pH of the cassava wastewater used in all assays was 7.0, a condition
previously studied by our research group and reported by Zhang et al., 2019. This is an optimal
value for a culture medium intended for the cultivation of yeasts (Aksu and Eren, 2007). The
pH value (5.3) found in cassava wastewater is interesting to keep it in stock, as it inhibits
microbial growth. The pH adjustment (to 7.0) was only carried out later, at the time of
cultivation. This factor is important for future scale-up of the process, since the storage and
transport of the cassava wastewater can be carried out more easily at the initial pH value.

60
 61

Table 1: Composition of cassava wastewater used in this work.

Parameter Value Silva (2018)

Moisture (% w/w) 93.54 ± 0.35 92,38
Proteins (% w/w) 1.58 ± 0.03 1,17
Reducing sugars (g/L) 32.24 ± 0.66 30,20
Non-reducing sugars (g/L) 14.93 ± 1.15 20,40
Total sugars (g/L) 47.18 ± 1.91 50,60
Ashes (% w/w) 1.00 ± 0.30 0,54
Total soluble solids (°Brix) 7.30 ± 0.21 7,0
pH 5.3 ± 0.03 5,26
Especific mass (g/L) 1097.12 ± 0.8 -

3.2 Biomass production

The maximum growth of biomass (8.81 g/L) was reached in the 60th hour after the start
of cultivation (Fig. 1), using the cassava wastewater diluted in distilled water until reaching a
concentration of 10 g/L of RS, pH adjusted to 7.0 and supplementation of 5 g/L of ammonium
sulfate in the bioreactor. Biomass production reached rapid growth in first 24 hours, possibly
due to the availability of sugar throughout the entire cultivation period (Fig. 2). It is noteworthy
that when analyzing the curve, it can be seen that the lag phase was very short (before 12 h)
which confirms the efficiency of the bioreactor for cultivation. The growth of R. glutinis can be
influenced by several factors, such as the quality and quantity of carbon and nitrogen sources,
stress, agitation, minerals, vitamins and temperature (Hernández-Almanza et al., 2014; Yen et
al., 2012). The cassava wastewater used in these assays only needed ammonium sulfate
supplementation in order to maintain suitable C/N ratio, showing how cassava wastewater is a
substrate with potential. As is known, biomass growth of R. glutinis is almost unaffected by
high C/N ratios (Vinarta et al., 2020; Elfeky et al., 2019; Zhang et al., 2019). Thus, ammonium
sulfate supplementation was performed to maintain the intracellular carbon flux within the
studied concentration range.
The biomass data found in this work were very similar to other studies that cultivated
R. glutinis using different culture media. Yen et al. (2015) used crude glycerol and observed a
growth of 11.7 g/L of biomass. Liu et al. (2015) studied the increasing of lipid production using
corn cob hydrolysate, the authors achieved the production of 15.1 g/L of cell biomass. Tinoi et
al. (2016) used pineapple husk residue, obtained 15.2 g/L of biomass. Xueling et al. (2018) used
61
 62

wastewater from ethanol production and achieved a maximum biomass production of 11.31 g/L
and Zhiping et al. (2014) increased biomass production and achieved 10.3 g/L. It is important
to emphasize that all these studies mentioned were carried out using R. glutinis cultivated in a
bioreactor, and therefore, the biomass production found in this work can be considered
satisfactory. Another point to emphasize is the versatility of this yeast in being cultivated using
alternative substrates.

Figure 1: Growth curve for R. glutinis in the described bioreactor over 84 hours.

3.3 Consumption of reducing sugars

The cell growth obtained by fermentation with cassava wastewater showed that this by-
product is efficient in terms of its ability to supply carbon in maintaining the cellular
development of yeasts. Cassava wastewater has a sugar profile reported in the literature of
dextrin (2.6%), maltose (1.4%), sucrose (32.1%), glucose (38.3%) and fructose (25.6%)
(Damasceno et al., 2003). The values of reducing sugars (RS) were adjusted to 10 g/L in all
assays (figure2). This standardization was carried out to always maintain the same initial

62
 63

concentration and ensure that sugar inhibition effects could be neglected. It can be observed
that 24 hours after the beginning of the fermentation process, the reducing sugars suffered a
significant decrease to 4.25 g/L, thus explaining the high growth rate in this period. It was
observed that 85% of the RS was consumed at the end of cultivation

Figure 2: Values of reducing sugar over 84 hours of cultivation.

3.4 Carotenoid production

The transformation of waste such as cassava wastewater into carotenoids by R. glutinis
is important for its treatment and valorization. Carotenoids are widely used in industry, whether
in food, supplementation in diets or in cosmetics and are still important as a raw material for
supplementation in feed for poultry, fish and mollusks (Kot et al., 2018). Microbial production
of carotenoids is intracellular and, like other intracellular bioproducts, after fermentation a
number of processes are important for biomolecule recovery and processing (Cardoso et al.
2017a, 2017b). The quantity of extracted carotenoids and its relationship with the production

63
 64

per unit of biomass and unit of cassava wastewater are shown in Figure 3A highest production
of carotenoids (1.41 mg/L) was achieved at the end of the fermentation process (84 h). It can
also be observed that after 72 hours the concentration of carotenoids remains almost constant.
This production of carotenoids shows the yield of carotenoids for each liter of used cassava
wastewater. Figure 3B, on the other hand, shows an indication of yield of carotenoids in relation
to biomass production achieved in the assays.

Figure 3: Production of carotenoids by R. glutinis over 84 hours of cultivation.

It is possible to state this production of carotenoids in bioreactor using cassava

wastewater with an initial concentration of reducing sugar of 10 g/L is directly linked to the
limitation of nutrients, which in turn causes an oxidative response of yeast cells during
fermentation (Petti et al., 2011). Studies performed by Han et al. (2005) demonstrated that cells
are sensitive to essential amino acid depletion because they cause cellular stress. This lack of
nutrients caused an increase in the load of metabolized carotenoids. In yeasts, the most
important role of carotenoids is to deactivate free radicals that are normally produced by cells
in their metabolism, for example, oxygen singlets (¹O2), hydroxyl radicals (-OH) peroxides and
64
 65

other oxidants (Berera et al., 2010). When fermentation takes place in unfavorable media, as in
this study, the stress suffered by R. glutinis is greater, thus causing a response, increasing the
activity of its enzymes and, therefore, carotenegenesis.

3.4 Fatty acids and Lipids production

Another interesting product to analyze is quantity of lipids produced by R. glutinis under
these conditions studied. Yeast synthesized intracellular lipids, and the lipid content after
cultivation in the bioreactor was 0.81 ± 0.099 g/L. This result was 43% higher than that found
by Silva (2020). In addition, the present study achieved greater production of carotenoids and
this fact is due to the use of operating conditions used in the bioreactor. These conditions were
studied previously by our group. This result of greater amounts of lipids is promising when
there is an interest in using this product as feed, since the amount of lipids is an important factor
for fattening animals. The operating conditions of T 25 ºC, pH 7.0 and stirring speed of 3g
previously tested on a bench scale, were confirmed and the production of biomolecules reached
even higher results when the tests were carried out on a larger scale, in the bioreactor.
It is known that lipid profile of microbial metabolites is directly dependent on the carbon
source used during fermentation (Yen et al., 2012). The yeast R. glutinis is classified as
oleaginous microorganisms, that is, they are defined as those that have capacity to produce and
accumulate more than 20% of lipids in their dry biomass (Ratledge and Cohen 2008). R. glutinis
can be cultivated in cassava wastewater, thus it can be suggested that this waste can be used
efficiently as substrate in cultivation for industry.
The composition of the main fatty acids analyzed is described in Table 2. With values
of 68.85% in the fermentation with R glutinis, oleic acid (C 18:1 n9 cis) was the main fatty acid
found, followed by palmitic acid (C 16:0) where 16.6%, stearic acid (C 18:0) 5.75% and linoleic
acid (C18:2 n6 cis) with the concentration of C18:2 n6 cis were found. According to the
literature (Yen et al., 2012; Kot et al., 2019b), palmitic acid (C16:0), stearic acid (C18:0), oleic
acid (C18:1), linoleic acid (C18:2) and linolenic acid (C18:3) account for more than 80% of the
total fatty acids in R. glutinis lipids.

65
 66

Table 2: Composition of fatty acids produced during each fermentation

Fatty Acida Concentrationb
C14:0 0,75 +- 0,09
C16:0 16,6 +- 0,07
C16:1 n7 1,26 +- 0,06
C17:0 0
C17:1 n10 0
C18:0 5,75 +- 0,28
C18:1 n9 cis 68,85 +- 0,24
C18:2 n6 cis 4,1 +- 0,28
C18:3 n3 0,25 +- 0,01
C20:1 n9 0,34 +- 0,02
C20:4 n6 0
C21:0 0,7 +- 0,08
C22:0 0,37 +- 0,08
C23:0 0
C24:0 1,02 +- 0,01
a
C14:0, myristic acid; C16:0, palmitic acid; C16:1 n7, palmitoleic acid; C17:0, heptadecanoic acid; C17:1 n10, cis 10 heptadecanoic acid;
C18:0, stearic acid; C18:1 n9 cis, oleic acid; C18: 2 n6 cis, linoleic acid; C18:3 n3, linolenic acid ω-3; C20:1 n9, gondoic acid; C20:4 n6,
arachidonic acid; C21:0, heneicosanoic acid; C22:0, behenic acid; C23:0, tricosanoic acid; C24:0, lignoceric acid.
b
Data represent the mean ± standard deviation (n = 3)

The analysis of biomass production per unit of mass of consumed substrate (Yx/s) achieved
0.94 g/g; on the other hand, carotenoid produced per unit of dry mass of cells (Yp/x) was 0.16
mg/g and carotenoid produced per unit of mass of consumed substrate (Yp/s) was 0.15 mg/g.
The carbon source consumption rate (QS) was 0.15 g/L/h; cell productivity (QX) was 0.14 g/L/h
and carotenoid productivity (QP) 0.02 g/L/h. These results proved to be promising when
compared to the values found by Ribeiro et al. (2019), who found values of QS 0.09; QX 0.048
and QP 0.008 g/L/h, respectively. Our values showed the versatility of this yeast when adapting
to the growing conditions with the cassava wastewater inside a bioreactor.

Table 3: Productivity of experiments in bioreactor using cassava water as a carbon source.

Where: (Yx/s) biomass produced per unit weight of substrate consumed; (Yp/x) amount of carotenoids produced per unit dry weight of cells; (Yp/s) amount of

Yx/s Yp/x Yp/s QX QP QS

(g/g) (mg/g) (mg/g) (g/L/h) (g/L/h) (g/L/h)

Productivity 0.89 0.15 0.13 0.12 0.017 0.13

carotenoids produced per unit weight of substrate consumed; (QS) rate of consumption of carbon source; (QX) cell productivity; (QP) productivity of carotenoids.

66
 67

4 Conclusion
R. glutinis showed important growth when cultivated in bioreactor in a medium containing
cassava wastewater as carbon source, producing important intracellular metabolites such as
carotenoids (1.41 mg/L and 181,6 ug/g) and lipids (0.81 g/L and 9.56 g/100g). The operating
conditions of T 25 ºC, and stirring speed of 3 g tested in the bioreactor were confirmed and
showed results even better to those found in bench assays. These results support the feasibility
of using cassava wastewater as a substrate to be used in biotechnological process with the
aiming of producing carotenoids and lipids in bioreactor.

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70
 71

ARTIGO2: PRODUCTION OF LIPIDS AND CAROTENOIDS FROM

Rhodotorula glutinis AND Paffia rhodozyma USING CASSAVA WASTEWATER
AS A CARBON SOURCE

ABSTRACT
Many efforts have been made to develop technologies that optimize the production of
biomolecules by microorganisms, and thus, the use of integrated bioreactors and the use of
waste is also quite convenient. In this study, microorganisms Paffia rhodozyma and
Rhodotorula glutinis were used because they have a high growth rate, producing significant
amounts of intracellular carotenoids. Therefore, this work aimed to compare three fermentation
conditions (two individual cultures and another culture using two yeasts concomitantly) in a
bioreactor, to evaluate the viability of cassava wastewater as a substrate for production of
carotenoids, lipids and biomass. In addition to comparing and determining the effect of stress
caused by mixed fermentation on production of biomolecules. Biomass, lipids and carotenoids
produced were analyzed. The physicochemical analysis of cassava wastewater were carried out
and it were found: 93.54% of moisture; 32.24 g/L of reducing sugars; 47.18 g/L of total sugars;
1.58% protein; 1% ash; total soluble solids of 7.3° Brix and pH 5.3. The best results were found
during consortium cultivation, where 7.74 g/L of biomass, 6.04 g/L of lipids and 1.68 mg/L of
carotenoids were produced. Yeasts showed remarkable growth when cultivated in bioreactor in
medium using cassava wastewater. Therefore, the use of cassava wastewater as substrate in
biotechnological process with purpose of producing carotenoids and lipids proved to be
feasible.

1. INTRODUCTION

Currently, application of microorganisms and biotechnological techniques aiming at the

synthesis of products of scientific interest that help in health and in increasing the quality of life
have been widely studied. Thus, searching for greater technical feasibility that enables large-
scale applicability is of global concern. One of the problems faced by industry has been the
financial cost that often makes this production unfeasible. Therefore, the use of agro-industrial
residues as carbon source for production of biocompounds is welcome (MAZURCZAK et al.,
2017; STROPARO et al., 2012).

Regarding use of microorganisms as bioproducing agents, the main problem is the use of
substrates that have minimum conditions that allow their growth and can thus be used by the
industry (SUMAN et al., 2011). A promising substrate, cassava wastewater is a residue from
the production of flour from processing of cassava wastewater. Often cassava wastewater is
illegally discarded by the flour house in open-air lakes, making it impossible to legalize
production, since the cost of proper disposal of this waste is high for these small producers.
71
 72

Therefore, cassava wastewater has been studied as a culture medium for production of
biomolecules on a small scale, and thus, enable a profitable destination for these producing
communities (RIBEIRO et al., 2019).

The North and Northeast regions in Brazil are the main producers of cassava (Manihot
esculenta Crantz), with thousands of flour houses used for small productions (EMBRAPA,
2018). Cassava has a tuberous root system responsible for the storage of its starch reserves, it
is cultivated and consumed mainly in the continents of Africa, Asia and South America.
Cassava production in Brazil was estimated at around 19 million tons in 2020 (IBGE, 2021).
The greatest economic part in the plant is its root, where starch accumulates, which can be
transformed into flour. These processes, however, generate an average of 300 liters of cassava
wastewater per ton of cassava (CHUZEL, 2001). Thus, several researches investigate the reuse
of this residue as a carbon source for microbial cultivation. Interesting results have already been
obtained, such as the biosynthesis of lipids and carotenoids by red yeasts. Among these yeasts,
there are two that stand out: Rhodotorula glutinis and Paffia rhodozyma (Silva et al. 2018).

The yeast P. rhodozyma is important in production of carotenoids due to its easeness of

using different sources of carbon as a substrate, having fast metabolism, rapid growth rate and
colonies reaching high population density and also for having received the title of GRAS.
(generally recognized as safe), that is, it is recognized as safe and can be used by food industry.
The genus Rhodotorula is currently studied in several biotechnological applications aiming at
production of several industrial compounds. In addition, the genus Rhodotorula also produces
carotenoids, enzymes and terpenes (PARK; NICAUD; RODRIGO, 2018). Several yeasts of
Rhodotorula genus (including glutinis subtype) were classified as oilseeds, as they are able to
accumulate between 40-70% of their weight in intracellular lipids (VIÑARTA et al., 2016).

Both inoculum size and operational factors including temperature, pH, aeration, and
medium composition can interfere with lipid and carotenoid content at the time of fermentation,
however the most determining factor in production of biocompounds is the microorganism
(SUBRAMANIAM et al., 2010). Therefore, yeasts R. glutinis and P. rhodozyma have been
extensively studied because of their great ability to produce betacarotene and astaxanthin, thus
demonstrating great potential for industrial applications.

Microbial consortium is common in natural ecological environments. There is an

increase in enzyme activity and production of carotenoids at a time when cells are growing
under unfavorable conditions. The stress generated through competition for the same substrate
72
 73

is known to promote adequate biochemical responses, increasing bioproduction (SALAR et al.,

2013). Shekhawat et al. (2019) carried out the cultivation of Lachancea thermotolerans and
Saccharomyces cerevisiae in microbial consortium in a bioreactor using grape broth as carbon
source. The authors evaluated the impact of co-cultivation on yeast physiology and metabolic
regulation. Microbial consortium generated a competitive and stressful environment for both
yeasts and created a different set of challenges for their growth, thus causing an increase in the
production of cellular metabolites.

It is important to develop studies involving yeasts able of consuming the same substrate,
thus competing for the same carbon source in order to improve bioproduction. Therefore, other
possibility for production of carotenoids and lipids is the cultivation in integrated bioreactor,
mainly due to its ability to optimize the process, its power to control variables and its safety.
Thus, the aim of this work was to compare isolated fermentations with R. glutinis and P.
rhodozyma with the microbial consortium fermentation carried out in an integrated bioreactor,
using cassava wastewater as a carbon source.

2 Material and methods

2.1 Substrate treatment and characterization

Cassava wastewater was collected during the processing of cassava flour production,
right after pressing the triturated cassava. The cassava wastewater used in the assays was
provided by flour house “Folha Verde”, located in Sobrado (07º 08' 43" S, 35º 14' 11" W), state
of Paraíba, Brazil. It was stored in a refrigerated environment and transported to the laboratory.
All experiments were carried out in the Bioengineering Laboratory of the Federal University of
Paraíba (UFPB).

Pre-treatment was carried out in the cassava wastewater before being used in the assays.
It was heated at 100°C for 20 min, cooled and centrifuged at 1182g for 5 min, collecting the
supernatant and discarding the remaining solid residue. The pre-treated cassava wastewater was
then diluted with distilled water until reaching the value of reducing sugars of 10 g/L, according
to the methodology described by Ribeiro et al. (2019).

73
 74

2.2 Microorganism
Rhodotorula glutinis and Paffia rhodozyma were acquired from the collection of André
Tosello Foundation (Campinas, São Paulo, Brazil) and were stored in Laboratory of
Biotechnological Processes of Technology Center (CT) from Federal University of Paraíba
(UFPB). They were obtained in lyophilized form, hydrated for 10 days, at temperature of 30°C,
in YM medium, containing: 3.0 g/L of yeast extract, 3.0 g/L of malt extract, 5.0 g/L of peptone
and 10.0 g/L glucose. After this, they were transferred to Petri dishes containing YM medium
with 2% bacteriological agar (YMA medium). The culture plates were incubated at 30°C for
48 hours and stored at 5°C (RIBEIRO et al., 2019).

2.3 Pre-inoculum
The microorganisms were transferred to 300 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL
of culture medium (YM medium): glucose (10 g/L), peptone (5 g/L), yeast extract (3 g/L) and
malt (3 g/L). Thereafter, incubated at 30°C, shaken at 150 rpm for 24 h. Then, yeast cells were
collected by centrifugation at 1182g for 5 min. In order to make a final cell concentration of
approximately 109 cells/mL, the cells were suspended in sterile distilled water and the
determination was performed using a Neubauer chamber.

2.4 Fermentation in Bioreactor

Ribeiro et al. (2019) studied the production of biomass and carotenoids using R. glutinis
in a 200 mL Erlenmeyer flask and cassava as a substrate. In this work, these optimized operating
conditions were used to carry out fermentations in a Tecnal Tec-Bio-V-4.5L bioreactor with 3
L of culture medium. A temperature of 30 ºC, agitation of 150 rpm, initial pH 7.0 and a time of
96 h of cultivation were used. In order to increase the nitrogen concentration, supplementation
with ammonium sulfate (5 g/L) was performed. Assays were performed in triplicate.

2.5 Analytical methods for evaluating microbial kinetics Biomass

Aliquots of 2 ml were taken for analysis of cell concentration and microbial kinetics
during the time intervals of 0, 12, 24, 36, 48, 72, 84 and 96 hours of cultivation. Each sample
was centrifuged at 11200g for 3 min, where the biomass growth was analyzed by turbidimetry
of the medium in a model U2M Quimis spectrophotometer at 600 nm. The medium without
cells, and at the same dilution of the samples, was used as a baseline. To quantify the biomass

74
 75

concentration, a standard curve was used with optical density values as function of dry biomass
concentration and all samples were analyzed in triplicate.

Reducing sugars (RS)

The modified DNS method originally proposed by Miller (1959) was used. After
performing the standard curve, 0.5 mL of sample and 0.5 mL of 3,5-dinitrosalisylic acid (DNS)
solution were used, which were incubated for 5 minutes at 100 °C. The reaction was cooled
with an ice bath and sample analysis was performed at 540 nm.

Extraction and quantification of total carotenoids

Total carotenoid determinations were made every 12 h with 5 mL of the sample,
collected and then transferred to Falcon tube. After centrifuging, the supernatant was discarded,
and 2 mL of dimethyl sulfoxide at 60 °C and 0.5 g of glass beads were added. Then, whole set
was vortexed for 2 min. Afterward, the system was incubated at 60 °C for 15 min. Then, 2 ml
of petroleum ether and 2 ml of acetone were added and a further 2 min stirring was performed.
Finally, 2 mL of 20% NaCl solution (w/v) were added and vortexed for 1 min. The whole set
was then centrifuged with 1452g for 10 min and then 3 ml of the supernatant were taken and
read at 450 nm. The absorbance was then converted to concentration using Eq. 1
(RODRIGUEZ-AMAYA; KIMURA, 2004).

A × V × 104
Total Carotenoids = ____________ (Eq1)
a×m

Where:

[Total carotenoids]: concentration of total carotenoids in μg/g of cell;

A: absorbance at 450 nm;

V: volume of sample extract;

a: molar absorptivity of the chemical species (carotenoids in general = 2592);

m: sample weight

75
 76

Total lipids

After assays, the determination of total lipids was performed and, for this, the method
described in Bligh & Dyer (1959) was used. The cells were centrifuged at 1182g for 5 min,
then, they were dried in an oven at 105ºC for 24 h and after ground in a mortar to obtain a fine
powder. Cell wall breakage was performed by acid hydrolysis and therefore 5 mL of 2N HCl
was added to 200 mg of dry sample and placed in a water bath at 80ºC (model 105 Di-F, Dellta)
for 1 h. Afterwards, lipids were extracted with 11.6 ml of a mixture of chloroform: methanol:
distilled water (1:1:0.9).

Yield and productivity

Each conversion factor was calculated according to carotenoids produced per unit
weight of substrate consumed (Yp/s), biomass produced per unit weight of substrate consumed
(Yx/s) and carotenoids produced by cell dry mass unit (Yp/x) as well as the carbon source (TC),
substrate consumption rate (QS) and cell productivity (QX) and carotenoids (QP) were
determined in the different runs. The total production of lipids (g/L) was found at the end of
process.

3 RESULTS AND DISCUSSION

3.1 Physical Chemical characteristics of cassava wastewater

The physicochemical characteristics of substrate used in cultivation affect not only the
biosynthesis activity of biomass but also the growth rate of microorganism. Table 1 presents
data obtained from the analysis of cassava wastewater that are required for the development of
microorganisms during fermentation, among them, high concentrations of reducing sugars
(32.24 g/L) and proteins with 1.58%. The pH of cassava wastewater used was 5.3, which is an
optimal value for a culture medium intended for yeast cultivation, as it inhibits the growth of
other microorganisms during storage (AKSU; EREN, 2007).

76
 77

Table 1. Composition of the pre-treated cassava wastewater used in this work.

Parameter Values

Moisture (%) 93.54 ± 0.35

Protein (Bradford) (%) 1.58 ± 0.03

Reducing sugars (g/L) 32.24 ± 0.66

Non-reducing sugars (g/L) 14.93 ± 1.15

Total sugars (g/L) 47.18 ± 1.91

Ash (%) 1.00 ± 0.30

Total soluble solids (ºBx) 7.30 ± 0.21

pH 5.3 ± 0.03

Specific mass (g/L) 1097.12 ± 0.8

3.2 Biomass production

Figure 1 shows the behavior of microorganisms during biomass production. The highest
growth was observed at the end of fermentation with P. rhodozyma (11.08 g/L), while in the
cultivation with R. glutinis, the biomass produced was 8.81 g/L. During the mixed fermentation
7.74 g/L were produced. In all fermentations, microorganisms had cassava wastewater with
initial concentration of 10 g/L of RS, pH adjusted to 7.0 and supplementation of 5 g/L of
ammonium sulfate.

It can be seen in Figure 1 that biomass growth of individual cultivations was much higher
than that observed in mixed fermentation. The competition for the same substrate made each
microorganism directs its efforts in the maintenance and not in the growth of its biomass. Petti
et al. (2011) demonstrated that yeast survival during starvation showed to be dependent on
nature of the insufficient nutrient and that in general, the search for "natural" nutrients such as
carbon, phosphate, nitrogen or sulfate sources results in low mortality rates.

77
 78

Biomass production in consortium cultivation showed the lowest growth, possibly due to
the adaptation to the medium and the presence of two microorganisms competing in the same
system for the availability of sugar throughout the entire cultivation period (Fig. 2). It is also
important to note that the behavior of profiles in the growth of biomass occurs after a period of
stability, which confirms the period of adaptation of microorganism to the mixed culture. The
growth of red yeasts such as R. glutinis and P. rhodozyma can be influenced by several factors,
such as the quality and quantity of carbon and nitrogen sources, stress, agitation, temperature,
minerals, and vitamins (HERNÁNDEZ-ALMANZA et al., 2014; YEN; YANG; YU, 2012).

Figure 1: Biomass concentration throughout the process of single and mixed cultivation.

3.3 Consumption of reducing sugars

Figure 2 presents the results of reducing sugars converted during the three fermentation
conditions. The profile of reducing sugars during fermentation with cassava wastewater showed
that this residue is efficient, as it was able to provide a carbon source (energy source) in order
to improve yeast growth. The sugar profile of cassava wastewater is widely reported in
78
 79

literature, it has approximately 2.6% of dextrin, 1.4% of maltose, 32.1% of sucrose, 38.3% of
glucose and 25.6% of fructose (Damasceno et al., 2003). The values of reducing sugars were
adjusted to 10 g/L (RIBEIRO et al., 2019) and at the end of the three fermentation processes it
was found 95% (9.5 g/L), 93.1% (9.31 g/L) and 87% (8.7 g/L) of RS available in fermentations
with Rhodotorula glutinis, Paffia rhodozyma and consortium cultivation, respectively.

Figure 2: Values of reducing sugars throughout the fermentation process (84 h).

3.4 Carotenoid production

The microbial production of carotenoids is intracellular, and therefore, series of
processes are important for recovering and processing of this bioproduct (CARDOSO et al.,
2017). Intracellular accumulation (µg/g) and volumetric production of carotenoids (mg/L) were

79
 80

analyzed. The amount of carotenoids extracted and their relationship to production are shown
in Figure 3A and 3B respectively. 1.6 mg/L (181.6 µg/g) were produced in fermentation using
R. glutinis; 1.0 mg/L (102.7 µg/g) when the microorganism used was P. rhodozyma and 1.68
mg/L (232 µg/g) in mixed fermentation. This production of 232 µg of carotenoids per gram of
cells with 60 hours of cultivation is a very promising result, as it confirms the strategy of
consortium cultivation as important in optimizing the production of this bioproduct. Another
noteworthy point is that even with a lower biomass production in the consortium cultivation
compared to the individual cultivation, the production of carotenoids was more effective in the
fermentation with microorganisms in consortium. Han et al. (2005) studied the response of
microorganisms to stress caused by the shortage of essential amino acids and concluded that
the lack of nutrients was the main reason that led to increase in concentration of carotenoids
produced. In yeast, the most important role of carotenoids is inactivate free radicals that are
normally produced by cells in their metabolism, for example oxygen singlets (¹O2), hydroxyl
radicals (-OH) peroxides and other oxidants (BERERA et al., 2010).

Figure 3: Carotenoid production by individual and mixed cultivation of Rhodotorula

glutinis and Paffia rhodozyma.

80
 81

3.4 Fatty acids and Lipids production

The composition of the main fatty acids analyzed is described in Table 2. With values of
68.85% in the fermentation with R glutinis, 67.79% in the fermentation with Paffia and 68.08%
when the strategy used was the consortium between the two microorganisms, oleic acid (C 18:1
n9 cis) was the main fatty acid found, followed by palmitic acid (C 16:0) where 16.6%, 17.94%
and 18.3% were found and stearic acid (C 18:0) 5.75%, 5.75% and 6.28% in fermentations with
R glutinis, Paffia rhodozyma and in the Consortium respectively.
According to the literature (Yen et al., 2012; Kot et al., 2019b), palmitic acid (C16:0),
stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), linoleic acid (C18 :2) and linolenic acid (C18:3) are
responsible for more than 80% of the total fatty acids in R. glutinis lipids. According to
Kikukawa Hiroshi et al., palmitic acid (C16:0), palmitoleic acid (C16:1), stearic acid (C18:0),
oleic acid (C18:1), linoleic acid (C18:2) represent the majority the composition of fatty acids
produced by the red yeast Paffia rhodozyma.

Table 2: Composition of fatty acids produced during each fermentation

Microrganismos produtoresb
a
Ácido graxo Rhodotorula Glutinis Paffia rhodozyma. Consortium
C14:0 0,75 +- 0,09 0,63 +- 0,16 0,98 +- 0,28
C16:0 16,6 +- 0,07 17,94 +- 0,02 18,3 +- 0,24
C16:1 n7 1,26 +- 0,06 1,25 +- 0,01 0
C17:0 0 0,49 +- 0,04 0
C17:1 n10 0 0,35 +-0,12 0
C18:0 5,75 +- 0,28 5,75 +- 0,25 6,28 +- 0,32
C18:1 n9 cis 68,85 +- 0,24 67,79 +- 0,48 68,08 +- 0,9
C18:2 n6 cis 4,1 +- 0,28 2,78 +- 0,31 2,51 +- 0,83
C18:3 n3 0,25 +- 0,01 0,59 +- 0 0,53 +- 0,07
C20:1 n9 0,34 +- 0,02 0,4 +- 0,06 0,29 +- 0,17
C20:4 n6 0 0 0
C21:0 0,7 +- 0,08 0 0,21 +- 0,03
C22:0 0,37 +- 0,08 0,55 +- 0,03 0,39 +- 0,17
C23:0 0 0 0
C24:0 1,02 +- 0,01 1,21 +- 0,03 1,35 +- 0,08
a
C14:0, myristic acid; C16:0, palmitic acid; C16:1 n7, palmitoleic acid; C17:0, heptadecanoic acid; C17:1 n10, cis 10 heptadecanoic acid;
C18:0, stearic acid; C18:1 n9 cis, oleic acid; C18: 2 n6 cis, linoleic acid; C18:3 n3, linolenic acid ω-3; C20:1 n9, gondoic acid; C20:4 n6,
arachidonic acid; C21:0, heneicosanoic acid; C22:0, behenic acid; C23:0, tricosanoic acid; C24:0, lignoceric acid.
b
Data represent the mean ± standard deviation (n = 3)

81
 82

Another important product in order to analyze is the lipids. The amount of lipids shows
the ability of microorganism to generate an energy source from a residue. The amount of lipids
obtained after cultivation in bioreactor under the three experimental conditions was 0.81 g/L
(9.56 g/100 g) with R. glutinis; 4.19 g/L (44.04 g/100 g) with P. rhodozyma and 6.04 g/L (84.29
g/100g) in consortium cultivation. The bioproduction of lipids in the mixed fermentation was
quite significant, demonstrating the importance of this experimental condition for greater
efficiency during fermentation. To confirm this result, the productivity of three cultivation
conditions was calculated and is shown in Table 2. It can be observed that results of consortium
cultivation presented the best values when compared to the other assays. Biomass produced per
unit of substrate (Yx/s) was 0.82 g/g; carotenoids produced per unit of dry cell (Yp/x) was 0.21
mg/g and carotenoids produced per substrate (Yp/s) was 0.17 mg/g. The consumption of carbon
source (QS) was 0.17 g/L/h; cell productivity (QX) was 0.14 g/L/h and carotenoid productivity
(QP) 0.03 g/L/h. These values are highly promising when the aim is scale production of these
biomolecules. It is known that lipid profile of microbial metabolites is directly influenced by
carbon source (YEN; YANG; YU, 2012). In this work, the yeasts were cultivated in cassava
wastewater and it showed its efficient ability as substrate in cultivation of microorganisms.

Table 2: Productivity of bioreactor assays using cassava wastewater as carbon source.

Yx/s Yp/x Yp/s QX QP QS

(g/g) (mg/g) (mg/g) (g/L/h) (g/L/h) (g/L/h)

R. glutinis 0,89 0,15 0,13 0,12 0,017 0,13

P. rhodozyma 1,05 0,11 0,12 0,13 0,14 0,11

Consortium 0,82 0,21 0,17 0,14 0,03 0,17

Where: (Yx/s) biomass produced per unit weight of substrate consumed; (Yp/x) carotenoids produced per unit dry weight of cells; (Yp/s) carotenoids produced per
unit weight of substrate consumed; (QS) rate of consumption of carbon source; (QX) cell productivity and (QP) carotenoid productivity.

4 CONCLUSION

The study of the yeasts Rhodothorula glutinis and Paffia rhodozyma showed greater
efficiency when cultivated in consortium compared to their individual cultivation. Bioreactor
cultivation in medium containing cassava wastewater as carbon source produced a remarkable

82
 83

amount of important intracellular metabolites such as carotenoids (1.68 mg/L) and lipids (6.04
g/L) in addition to supporting the feasibility of using cassava wastewater as substrate to be used
in biotechnological process.

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