UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

unesp “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE RIO CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

(MICROBIOLOGIA APLICADA)

CARACTERIZAÇÃO DE LACASES PRODUZIDAS POR FUNGOS

BASIDIOMICETOS DE ORIGEM MARINHA E TERRESTRE E APLICAÇÃO
BIOTECNOLÓGICA NA DESCOLORAÇÃO DE CORANTE TÊXTIL

BRUNO DE JESUS FONTES

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências,

Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista,
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia
Aplicada).

Orientador: Prof. Dra. Lara Durães Sette

Co-orientador: Prof. Dr. Henrique Ferreira

RIO CLARO
MAIO - 2019
 BRUNO DE JESUS FONTES

CARACTERIZAÇÃO DE LACASES PRODUZIDAS POR FUNGOS

BASIDIOMICETOS DE ORIGEM MARINHA E TERRESTRE E APLICAÇÃO
BIOTECNOLÓGICA NA DESCOLORAÇÃO DE CORANTE TÊXTIL

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências,

Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista,
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia
Aplicada).

Orientador: Prof. Dra. Lara Durães Sette

Co-orientador: Prof. Dr. Henrique Ferreira

RIO CLARO
MAIO - 2019
 Fontes, Bruno de Jesus
F683c Caracterização de lacases produzidas por fungos basidiomicetos de
origem marinha e terrestre e aplicação biotecnológica na descoloração
de corante têxtil / Bruno de Jesus Fontes. -- Rio Claro, 2019
81 p. : il., tabs., fotos

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp),

Instituto de Biociências, Rio Claro
Orientadora: Lara Durães Sette
Coorientador: Henrique Ferreira

1. Lacase. 2. Basidiomicetos. 3. Purificação enzimática. 4.

Biotecnologia ambiental. 5. Corante têxtil. I. Título.

Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de

Biociências, Rio Claro. Dados fornecidos pelo autor(a).

Essa ficha não pode ser modificada.

 DEDICATÓRIA

A Deus, pois tudo vem dEle!

À minha mãe Terezinha, meu irmão Gabriel e ao meu pai João. Vocês me dão força para ir
avante!

Às minhas avós Benita, Vardinha e vô Osvaldo. Pois vocês são minhas relíquias.

À minha namorada Maryana Nogueira e em memória de sua Avó Elza Nogueira. Por que te
amo.

Aos amigos e irmãos da Igreja Adventista do Sétimo dia de Rio Claro - SP e Maracás – Ba.

Aos desbravadores da minha unidade “Tubarões”.

 AGRADECIMENTOS
A Deus pela conclusão desta etapa, que por mim foi tão sonhada. A minha Orientadora,
Professora Dr. Lara Durães Sette, pela orientação, ensino e apoio durante esta etapa, também
ao meu co-orientador Dr. Henrique Ferreira, pela pronta disposição e aprendizado a mim
concedido e por todo apoio técnico, e também ao professor Dr. Adalberto Pessoa Júnior por ter
me recebido e dado todo apoio técnico e teórico durante a estadia em seu laboratório
(Biotecnologia Farmacêutica na USP – SP).
De forma especial eu gostaria de agradecer a minha mãe, por todo amor, carinho e apoio,
por me sustentar em suas orações e por todo esforço disposto a mim, não só neste momento,
mas em toda a minha vida.
Aos meus tios Valdir e Del, minha prima Bia por todo apoio e suporte em minha estadia
em São Paulo, vocês foram fundamentais para eu finalizar esta etapa.
Agradeço também a minha namorada Maryana Nogueira, por todo amor, carinho,
consolo nos momentos difíceis, pelo auxílio nas horas de desespero e por compartilhar comigo
esta fase.
De forma especial agradeço aos meus amigos do grupo de pesquisa do Laboratório de
Micologia Ambiental e Industrial - LAMAI (UNESP – RC) e do Laboratório de Biotecnologia
Farmacéutica - LABIOTEC (USP-SP), os momentos vividos dentro do laboratório com vocês
foram de muita alegria, boas conversas e aprendizado. Cresci muito com vocês, e sem a
orientação de vocês muitas coisas não teriam acontecido e eu ainda seria o mesmo.
Em especial agradeço aos colegas que de forma mais próxima me ajudaram: Igor Otero
(LAMAI); Eduardo Krebs (USP) e Kenny Sato (Laboratório de Genética Bacterina - LGB).
Obrigado também a professora Dr. Eleonora Carmona e a Carmem pelo suporte técnico.
Obrigado a todos do departamento de bioquímica e microbiologia. Obrigado por fazer
este mestrado inesquecível!
À FAPESP pelo financiamento do projeto, processo nº 2016/07957-7, Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
À CAPES, pois, o presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento
001.
 RESUMO
As lacases têm sido alvo de investigação devido à capacidade de oxidar compostos aromáticos
fenólicos e não fenólicos com a concomitante redução do oxigênio à agua. Embora possam ser
sintetizadas por diversos organismos, sua produção se destaca em fungos de podridão branca.
As lacases tem sido amplamente aplicada no campo industrial e ambiental. A fim de comparar
o potencial catalítico das lacases dos fungos de ambiente marinho e terrestre, no presente estudo
as lacases produzidas pelos basidiomicetos de origem marinha (Peniophora sp. CBMAI 1063
e Marasmiellus sp. CBMAI 1062) e terrestre (Peniophora cinerea CCIBt 2541 e
Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388) foram parcialmente purificadas (ultrafiltração e
cromatografia de troca iônica) e caracterizadas bioquimicamente. Para a quantificação das
laccases foram utilizados os substratos enzimáticos 2,2’-azino-bis (3- etilbenzotiazolina-6-
sulfónico) (ABTS) e siringaldazina (SYG). Os fungos analisados apresentaram produção de
lacases no meio utilizado, o qual foi previamente otimizado para a produção de lacases para o
Peniophora sp. CBMAI 1063. Nestas condições de cultivo, as enzimas ligninoliticas Manganês
Peroxidase (MnP) e Lignina Peroxidase (LiP) não foram produzidas. Com relação ao processo
de purificação, a cada passo houve perda no rendimento, em proporções diferentes para o
conjunto enzimático de cada fungo, com melhor recuperação para as lacases produzidas pelos
fungos do gênero Marasmiellus. O zimograma revelou que Peniophora sp. CBMAI 1063
produz duas isoenzimas de lacases, P. cinerea CCIBt 2541 cinco, Marasmiellus sp. CBMAI
1062 duas e M. colocasiae CCIBt 3388 uma. O conjunto enzimático foi caracterizado de modo
aparente. O pH ótimo (4,0 para ABTS e 5,5 para SYG) e temperatura ótima (55 °C) foram
iguais para os dois fungos do gênero Peniophora. Para os fungos do gênero Marasmiellus o pH
ótimo foi o mesmo (5,0 para ABTS e 6,5 para SYG) porém a temperatura ótima foi diferente
(55 °C para Marasmiellus sp. CBMAI 1062 e 50 °C para M. colocasiae CCIBt 3388). As
lacases de todas as espécies estudadas não apresentarem atividade na presença de EDTA e L-
cisteína, evidenciando a importância do Cu2+ e do aminoácido cisteína no sítio ativo. Diferentes
íons metálicos ativam as atividades das lacases. De modo geral, a caracterização do conjunto
enzimático do P. cinerea CCIBt 2541 apresentou melhores resultados que o do Peniophora sp.
CBMAI 1063. No conjunto enzimatico M. colocasiase CCIBt 3388 íons Mn2+ aumentou a
atividade (117%), entretanto Marasmiellus sp. CBMAI 1062 apresentou estabilidade maior
frente a todos os íons testados, apresentando aumento da atividade na presença de Al3+ (126%).
Quanto à salinidade, o I50 para NaCl foi mais eficiente para as lacases do P. cinerea CCIBt
2541, enquanto que Marasmiellus sp. CBMAI 1062 apresentou maior resistência a 1000 mM
de NaCl. De acordo com os valores de KM e Vmax há uma maior afinidade das lacases dos
fungos de origem terrestres pelos substratos ABTS e SYG. As lacases parcialmente purificadas
apresentaram as seguintes porcentagens de descoloração do corante têxtil marinho reativo (MR)
(40 mg/L) após sete dias de incubação: P. cinerea CCIBt 2541 67%, Peniophora sp. CBMAI
1063 61% e M. colocasiae CCIBt 3388 27%. A descoloração do MR pelas lacases dos fungos
do gênero Peniophora foi similar à obtida para a lacase industrial de Trametes versicolor (66%).
Devido à quantidade insuficiente de lacases do Marasmiellus sp. CBMAI 1062 o teste de
descoloração não foi realizado. Testes de toxicidade mostraram que as lacases de P. cinerea
CCIBt 2541 deixa praticamente inalterada a toxicidade no tratamento. Entretanto o conjunto de
lacases do Peniophora sp. CBMAI 1063 e M. colocasiae CCIBt 3388 apresentam um leve
aumento de toxicidade após o período de reação. A lacase pura de T. versicolor não alterou a
toxicidade inicial. Os resultados do presente estudo ampliam o conhecimento sobre as lacases
produzidas por fungos de origem marinha e abrem novas perspectivas de estudos na área da
biotecnologia ambiental.

Palavras-chave: Lacase; Basidiomicetos; Purificação enzimática; Biotecnologia ambiental

 ABSTRACT
Laccases have been under investigation due to their capacity to oxidize phenolic and non-
phenolic aromatic compounds with concomitant reducing of oxygen to water. Although
laccases can be synthetized by several organisms; their production is notable in white rot fungi.
Laccases have been wide applied in industrial and environmental fields. Aiming to compare the
catalytic potential of laccases in fungi from marine and terrestrial environments, in the present
work laccases produced by marine basidiomycetes (Peniophora sp. CBMAI 1063 and
Marasmiellus sp. CBMAI 1062) and the terrestrial (Peniophora cinerea CCIBt 2541 and
Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388) were partially purified (ultrafiltration and ionic
chromatography) and biochemically characterized. For the laccases quantification were used
2,2’-azino-bis (3- ethilbenzotiazolina-6-sulphnic) (ABTS) and syringaldazine (SYG) as
substrates. All studied fungi showed satisfactory laccases productions in the utilized medium,
which was previously optimized to laccases production by Peniophora sp. CBMAI 1063. In
these culture conditions ligninolytic enzymes Manganese Peroxidase (MnP) and Lignin
Peroxidase (LiP) were not produced. Regarding the purification process, there was yield loss in
each step, in different proportions to the enzymatic pool for each fungi, with better yielded the
laccases produced by the fungi from Marasmiellus genus. Zymogram revealed that Peniophora
sp. CBMAI 1063 has two laccase isoforms, P. cinerea CCIBt 2541 has five, Marasmiellus sp.
CBMAI 1062 has two and M. colocasiae CCIBt 3388 has one. The enzymatic pools were
apparently characterized. The optimum pH (4.0 to ABTS and 5.5 to SYG) and optimum
temperature (55 °C) were the same to both Peniophora fungi. The fungi from the genus
Marasmiellus had the same optimum pH (5.0 to ABTS and 6.5 to SYG), however, the optimum
temperature was distinct, 55 °C to the Marasmiellus sp. CBMAI 1062 and 50 °C to the M.
colocasiae CCIBt 3388). EDTA and L-cysteine completely inhibit all enzymatic pools,
showing the importance of Cu2+ and the cysteine aminoacid in the active site of laccases.
Different metallic ions acted empowering the laccase activities. The enzymatic pool obtained
with the fungus P. cinerea CCIBt 2541 showed better results in comparison with Peniophora
sp. CBMAI 1063. In the enzymatic pool of M. colocasiase CCIBt 3388 Mn2+ ions enhanced
laccase activity (117%), but the pool of Marasmiellus sp. CBMAI 1062 showed better stability
with all tested ions, enhancing its activity in the presence of Zn2+ (102%) and Al3+ (126%).
Regarding salinity, the I50 of NaCl was most efficient to the laccases of P. cinerea CCIBt 2541,
while laccases from Marasmiellus sp. CBMAI 1062 were more resistant to 1000 mM of NaCl.
According to the KM e Vmax values, there is a better affinity with laccases from terrestrial fungi
to the substrates ABTS and SYG. The partially purified laccases exhibited the following
percentage of the Marine Reactive (MR) (40 mg/L) textile dye decolorization after seven days
of incubation: P. cinerea CCIBt 2541 67%, Peniophora sp. CBMAI 1063 61% and M.
colocasiae CCIBt 3388 27%. Decolorization of MR by Peniophora fungal laccases was similar
to the pure industrial laccase from Trametes versicolor (66%). Due to the little amount of
laccases of Marasmiellus sp. CBMAI 1062 discoloration test was not carried out. Toxicity tests
revealed that laccases from P. cinerea CCIBt 2541 did not change the dye toxicity during the
treatment. However, the pool of Peniophora sp. CBMAI 1063 and M. colocasiae CCIBt 3388
slightly increased the toxicity after the treatment. T. versicolor pure laccase did not change the
initial toxicity. Results from the present work increase the knowledge about the laccases
produced by fungi from marine origin and open new perspectives of studies in the area of
environmental biotechnology.

Keywords: Laccase; Basidiomycetes; Enzymatic purification; Environmental biotechnology

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Modelo representativo da estrutura da lignina (Fonte: GIAZERA; NIKAIDO, 2007)

Figura 2. Diagrama esquemático da degradação da lignina (Fonte: SETTE; BONUGLI-

SANTOS, 2015, adaptado de DASHTBAN et al. 2010).

Figura 3. Representação esquemática do sítio ativo de lacases. X - aminoácido variável; Cu1 -

cobre T1; Cu4 - cobre T2; Cu 2 e 3 - par de cobres T3. (Fonte: OTERO, 2016 adaptado de
CLAUS, 2004).

Figura 4. Estrutura da lacase do fungo Trametes versicolor evidenciando os dos 3 domínios

cupredoxin D1 - domínio 1; D2 - domínio 2; D3 - domínio 3 (Fonte: OTERO, 2016 adaptada
de DWIVEDI et al., 2011).

Figura 5. Alinhamento de lacases fúngicas e genes de lacase de Peniophora sp. CBMAI 1063
transcritos. Os retângulos vermelhos representam as regiões conservadas L1, L2, L3 e L4 (F
onte: OTERO, 2016).

Figura 6. Estrutura química de diferentes grupos de corante têxtis: (A) corante azo; (B) c
orante sulfuroso; (C) corante ácido; (D) corante disperso; (E) corante básico; (F) corante direto;
(G) corante antraquinona; (H) corante indigóides; (I) corante reativo.

Figura 7. Esquema de uma via geral de degradação de corante azo em reação com lacase (LC)
na presença de oxigênio molecular (fonte: ZUCCA et al., 2015).

Figura 8. Peniophora sp. CBMAI 1063 (Fonte: autor).

Figura 9. Marasmiellus sp. CBMAI 1062 (Fonte: autor).

Figura 10. Peniophora cinerea CCIBt 2541(Fonte: autor).

Figura 11. Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 (Fonte: autor).

Figura 12. Cromatograma da troca aniônica (DEAE-Sepharose FF) de 1,5 mL do caldo bruto
ultrafiltrado concentrado Peniophora cinerea CCIBt 2541 (A); Peniophora sp. CBMAI 1063
(B); Marasmiellus sp. CBMAI 1062 (C); Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 (D).

Figura 13. Gel SDS-PAGE do perfil proteico dos fungos: (A) Marasmiellus sp. CBMAI 1062,
Peniophora sp. CBMAI 1063, Marasmiellus colocasiae CCIBt3388 e Peniophora cinerea
CCIBt 2541, das amostras: ultrafiltrada concentrada (U.C.) e troca iônica 3X concentrada (T.I.).
(B) Gel SDS-PAGE: amostras de Peniophora cinerea CCIBt 2541, 1 – ultrafiltrado, 2-troca
iônica 6X concentrada.
Figura 14 – Zimograma de lacases por atividades em SYG para as amostras do conjunto
enzimático do Peniophora sp. CBMAI 1063 (CBMAI 1063) e Peniophora cinerea CCIBt 2541
(CCIBt 2541); atividade em ABTS para as amostras do conjunto enzimático do Marasmiellus
sp. CBMAI 1062 (CBMAI 1062) e Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 (CCIBt 3388).

Figura 15. Caracterização do pH ótimo aparente das lacases dos fungos marinhos e terrestres
do gênero: (A) Peniophora para ABTS, (B) Peniophora para SYG, (C) Marasmiellus para
ABTS, (D) Marasmiellus para SYG; e temperatura ótima aparente das lacases dos fungos
marinhos e terrestre do gênero: (E) Peniophora, (F)Marasmiellus.

Figura 16 – Estabilidade dos conjuntos enzimáticos de lacases para os fungos (A) Peniophora
e (B) Marasmiellus em temperatura ótima.

Figura 17 – E feito de íons metálicos, agente quelante (EDTA) e aminoácido (L-cisteína) na

atividade enzimática dos conjuntos de lacases dos fungos do gênero em estudo: (A) Peniophora
e (B) Marasmiellus.

Figura 18. Efeito das concentrações de NaCl na atividade dos conjuntos enzimático de lacases:
(A) fungos marinho e terrestre Peniophora sp. CBMAI 1063 e Peniophora cinerea CCIBt 2541,
(B) Fungos marinho e terrestre Marasmiellus sp. CBMAI 1063 e Marasmiellus colocasiae
CCIBt 3388 e (C) lacase comercial pura do fungo terrestre Trametes versicolor.

Figura 19 – Corante têxtil marinho reativo, estrutura química associada (Fonte: SIGMA-
ALDRICH).

Figura 20 – Descoloração do corante têxtil marinho reativo pelo conjunto enzimático de lacases
dos fungos marinho e terrestre do gênero Peniophora, do fungo terrestre Marasmiellus
colocasiae CCIBt 3388 e da lacase pura comercial de Trametes versicolor.
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação das faixas de toxicidade aguda segundo Bulich (1992).

Tabela 2. Etapas do processo de purificação da lacase referente aos fungos marinhos e terrestres
dos gêneros Peniophora e Marasmiellus.

Tabela 3. Cinética enzimática aparente em reação com diferentes substratos.

Tabela 4. Constante de Michaelis-Menten de lacases em diferentes basidiomicetos utilizando

ABTS como substrato.

Tabela 5. Concentração efetiva (EC50 ) de A. fischeri, após 15 min de exposição do conjunto

enzimático das lacases com o corante marinho reativo (40 mg L-1).
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABTS - 2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid).

ASW – Água do mar artificial (Artificial Sea Water)
BSA – Albumina de soro bovino
CBMAI - Coleção Brasileira de Microrganismos do Ambiente e Indústria
CCIBT - Coleção de Culturas de Algas, Cianobactérias e Fungos do Instituto de Botânica
CRM - UNESP – Centro de Rescursos Microbianos da Universidade Estadual Paulista
DEAE – Dietilaminoetil
DTT – Ditiotreitol
EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético
FPLC - (Fast Protein Liquid Chromatography)
LAMAI - Laboratório de Micologia Ambiental e Industrial
H - hora
INPI - Instituto Nacional da Propriedade Industrial
KM - constante de Michaelis-Menten
LAC - Lacase
LiP - Lignina Peroxidase
MnP - Mangaês Peroxidase
MR - Marinho Reativo
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
RB - Preto Reativo
RBBR - Azul Brilhante Remazol R
RC – Rio Claro
SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
SYG – siringaldazina
SP – São Paulo
UNESP – Universidade Estadual Paulista
USP – Universidade de São Paulo
Vmáx - Velocidade máxima
W/V – Peso / volume (Weight / volume)
 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ........................................................................ 13
2. REFERENCIAL TEÓRICO ...................................................................................... 15
2.1 Enzimas ligninolíticas ........................................................................................................15
2.2 Lacases ..............................................................................................................................16
2.2.1 Dinâmica gênica das lacases.......................................................................................18
2.2.2 Organismos produtores de lacases ..............................................................................20
2.2.3 Produção de lacases por fungos de origem marinha ....................................................21
2.2.4 Aplicações das lacases ...............................................................................................22
2.2.4.1 Química sintética e orgânica.......................................................................................22
2.2.4.2 Indústria de papel .......................................................................................................22
2.2.4.3 Indústria de alimentos ................................................................................................23
2.2.4.4 Indústrias farmacêuticas e de cosméticos ....................................................................23
2.2.4.5 Biorremediação ..........................................................................................................23
2.2.4.6 Outras aplicações .......................................................................................................24
2.2.4.7 Aplicação de lacases na indústria têxtil ...................................................................24
3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 29
3.1 Geral .................................................................................................................................29
3.2 Objetivos específicos .........................................................................................................29
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 29
4.1 Microrganismos .................................................................................................................29
4.1.1 Peniophora sp. CBMAI 1063 .....................................................................................29
4.1.3 Peniophora cinerea CCIBt 2541 ................................................................................31
4.1.4 Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 ........................................................................32
4.2 Reativação e cultivo em meio sólido ..................................................................................33
4.3 Cultivo em meio líquido ....................................................................................................33
4.4 Atividade enzimática .........................................................................................................33
4.4.1 Lacase (Lac) ..............................................................................................................33
4.4.2 Atividade enzimática de Manganês Peroxidase (MnP) ................................................34
4.4.3 Atividade enzimática de Lignina Peroxidase (LiP) .....................................................34
4.4.4 Determinação da atividade enzimática ........................................................................34
4.5 Purificação e caracterização bioquímica .............................................................................35
4.5.1 Tratamento do caldo bruto..........................................................................................35
4.5.2 Visualização qualitativa do perfil proteico: SDS- PAGE e revelação de gel nativo ......35
4.5.3 Teor de proteína .........................................................................................................36
4.5.4 Técnicas cromatográficas ...........................................................................................36
4.5.5 Determinação dos parâmetros cinéticos aparente ........................................................36
 4.5.6 Temperatura ótima e estabilidade térmica ...................................................................36
4.5.7 pH ótimo....................................................................................................................37
4.5.8 Estabilidade em NaCl e efeito de íons e outros agentes na atividade de lacases ...........37
4.6 Tratamento de corantes têxteis ...........................................................................................37
4.6.1 Descoloração de corantes têxteis ................................................................................37
4.6.2 Teste de toxicidade: Microtox ....................................................................................38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 39
5.1 Atividade de lacases ..........................................................................................................39
5.2 Purificação de lacases ........................................................................................................39
5.3 Caracterização aparente das lacases parcialmente purificadas .............................................45
5.3.1 Cinética enzimática aparente ......................................................................................46
5.3.2 Temperatura e pH ótimos ...........................................................................................47
5.3.3 Estabilidade Térmica..................................................................................................50
5.3.4 Efeito de íons, de um aminoácido e um agente quelante sobre a atividades de lacases .51
5.3.5 Efeito do NaCl nas lacases ........................................................................................53
5.4 Descoloração e destoxificação do corante têxtil marinho reativo ........................................55
6. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 59
7. REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 60
APÊNDICE ........................................................................................................................ 77
 13

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
As lacases (benzenediol: oxigênio oxi-redutase) [EC 1.10.3.2] são glicoproteínas
pertencente ao grupo de enzimas multicobre oxidases, contendo em sua estrutura quatro íons
de cobre. Estas enzimas oxidam um grande número de reações de compostos aromáticos
fenólicos e não fenólicos, reduzindo oxigênio à agua, sem necessidade de coenzima
(LEONOWICZ, et al., 2001; DURÁN et al., 2002).
Lacase foi inicialmente isolada da planta Rhus vernicifera (Toxicodendron vericifluum)
(YOSHIDA, 1883). A produção de lacases por fungos foi observada por volta de 1896, e
posteriormente, essas enzimas foram detectadas também em bactérias, corais, pepinos do mar,
insetos e algas (THURSTON, 1994; THEERACHAT; GUIEYSSE, 2018; OTTO;
SCHLOSSER, 2014). Os fungos basidiomicetos são os principais produtores de lacases, com
destaque para os fungos de podridão branca (GIARDINA et al., 2010).
Geneticamente estas enzimas possuem uma grande variabilidade, inclusive entre
espécies e em um mesmo indivíduo, sendo este fenômeno principalmente observado em fungos,
os principais produtores. Diferentes isoformas são expressas dependendo do tipo de indutor,
das características físico-químicas e cinética dos nutrientes e do grau de polimorfismo entre as
espécies (BLAICH; ESSER, 1975). Os genes das lacases possuem 4 regiões altamente
conservadas sem presença de gaps, onde são expressos aminoácidos fundamentais para ligações
com os íons cobre, dando funcionalidade à enzima, formando assim, o sítio ativo. Estas regiões
são denominadas L1, L2, L3 e L4 (KUMAR et al., 2003). Mais de 100 isoformas da enzima já
foram relatadas (BALDRIAN, 2006).
Aplicações bem-sucedidas de lacases as evidenciam como uma ótima alternativa para
processos biotecnológicos. A enzima pode ser utilizada na forma nativa ou imobilizada, em
ambientes aquosos, na presença de solventes orgânicos, oferecendo aplicabilidade em
diferentes campos industriais, e na área ambiental são aplicadas de forma sustentável e
ecologicamente amigável em processos de biorremediação (LEONOWICZ, et al., 2001;
POLIZELI; RAI, 2014; MINUSSI; PASTORE; DURÁN, 2002).
Embora existam inúmeras perspectivas em distintos campos de atuação e promissoras
aplicações industriais, ainda há poucas aplicações de lacases no mercado. Isso é devido,
principalmente, ao alto custo da produção somada à baixa produtividade enzimática pelos
organismos naturais ou recombinantes (POLIZELI; RAI, 2014). A fim de reverter essa situação,
estratégias e ensaios para o melhoramento da obtenção de lacases vêm sendo empregados,
incluindo a procura por novos produtores, mutagênese e recombinação gênica (GIESE et al.,
2004; SHANKAR; SHIKHA, 2012).
 14

Uma das áreas de aplicação mais promissora das lacases é a descoloração de corantes
têxteis em efluentes industriais (GONÇALVES; SILVA; CAVACO-PAULO, 2015). Estes
resíduos causam grandes problemas ambientais, pois bloqueiam a passagem da luz para os
ecossistemas aquáticos mais profundos, diminuem o processo de fotossíntese, e ocasionam
condições anaeróbicas (RAGHUKUMAR; D’SOUZA-TICLO; VERMA, 2008). Tais
compostos, em sua maioria, são aromáticos, incluindo fenóis e aminas. Por agirem sobre estes
substratos, as lacases têm apresentado resultados satisfatórios no processo de descoloração
deste tipo de poluente (SHRADDHA et al., 2011).
Efluentes da indústria têxtil, apresentam alta concentração de sais (MOREIRA;
MILAGRES; MUSSATTO, 2014). Partindo deste pressuposto, a fim de tratá-los,
biocatalizadores estáveis e/ou organismos tolerantes aos sais são requeridos. Neste contexto, os
fungos marinhos e os catalizadores por eles sintetizados, apresentam-se como recursos
genéticos promissores devido às suas adaptações fisiológicas, as quais incluem a tolerância à
salinidade, pressão, baixa temperatura, condições oligotróficas, pH extremos, disparidades nas
concentrações de minerais disponíveis, entre outras (BONUGLI-SANTOS et al., 2015).
Neste sentido, o grupo de pesquisa coordenado pela professora Dra. Lara Durães Sette,
há mais de uma década vem concentrando esforços em pesquisas relacionadas com o
isolamento de fungos de ambiente marinho, visando produção, caracterização e aplicação de
lacases em processos biotecnológicos. Assim, os fungos basidiomicetos de origem marinha
Peniophora sp. CBMAI 1063, Marasmiellus sp. CBMAI 1062, têm sido estudados quanto à
produção de enzimas e aplicação na área ambiental no tocante a degradação de corantes têxteis
e hidrocarbonetos (BONUGLI-SANTOS et al., 2010a, 2010b; MAGRINI, 2012; BONUGLI-
SANTOS et al., 2012; MAINARDI et al., 2018; OTERO et al., 2017; PAIVA, 2016;
BONUGLI-SANTOS et al., 2016).
Levando-se em consideração a capacidade de produção de lacases pelos fungos
marinhos acima mencionados e o potencial que elas podem apresentar na degradação de
poluentes ambientais em condições salinas, faz-se necessária a sua caracterização, tendo em
vista a identificação de isoformas com melhor potencial de ação no ambiente alvo. Em adição,
considerando que os diferentes fungos de origem marinha, destacados neste trabalho, possuem
homólogos terrestres, a comparação da eficiência físico-químicas das lacases produzidas por
eles podem fornecer conhecimentos significativos para melhor aplicabilidade na área da
biotecnologia ambiental.
 15

2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Enzimas ligninolíticas
A lignina é um polímero complexo composto por hidroxifenil-propano (Figura 1), atua
como uma cola natural nas lamelas intermédias nos tecidos vegetais, bem como matriz nas
paredes secundárias das células da madeira e como ligante entre celulose e cadeias de
hemicelulose, dando força às plantas e auxiliando na proteção contra a perda de água e
organismos invasores (RIVA, 2006; HAO; MOHNEN, 2014).

Figura 1. Modelo representativo da estrutura da lignina (Fonte: GLAZERA; NIKAIDO, 2007)

As fontes de carbono disponíveis nos tecidos vegetais podem ser utilizadas por
microrganismos, os quais secretam enzimas oxidativas a fim de degradar a lignina e obtê-las.
As principais enzimas do sistema ligninolítico estão apresentadas na Figura 2, sendo as lacases
(Lac), manganês peroxidase (MnP), e lignina peroxidase (LiP) as enzimas mais utilizadas neste
processo. A degradação da lignina é um processo multi enzimático, por reação não especifica,
com transferência de átomos de hidrogênio a um receptor final (LEONOWICZ et al., 2001).
As peroxidases ligninolíticas são hemeproteínas de ação catalítica apenas na presença
de peróxido de hidrogênio, para onde são transferindo os íons hidrogênio do substrato, a fim de
produzir água. A lignina peroxidase age clivando ligações carbono alfa e beta, abrindo anéis
aromáticos e gerando radicais hábeis para reagir sobre o substrato. A manganês peroxidase
oxida íons manganês, tornando-os capazes de reagir com ácidos orgânicos, os quais podem
 16

oxidar substratos secundários (GAJERA et al., 2015; CHRISTIAN et al., 2005; SINGH;
SINGH; SINGH, 2015). As enzimas ligninolíticas de modo geral agem sobre uma diversidade
de compostos formados por anéis aromáticos, fenólicos e não fenólicos, tornando-as
promissoras em processos biotecnológicos (GHOSH; DASTIDAR; SREEKRISHNAN, 2016).

Figura 2. Diagrama esquemático da degradação da lignina (Fonte: SETTE; BONUGLI-SANTOS,

2013, adaptado de DASHTBAN et al. 2010).

Degradação enzimática da lignina

Fenol oxidase Heme peroxidases Acessórios enzimáticos

Radicais livres Radicais

intermediários Mn (III) quelados

Mediadores
Secundários

Radicais reativos
Mediadores

Lignina
Lignina

Degradação da lignina

Lac = Lacase; LiP = Lignina peroxidase, MnP = Manganês peroxidase; VP = Versátil oxidase; AAO =
Aril-álcool oxidase; GLOX = Glioxal oxidase; LMS = Sistema lacase-mediador; H2O2-GO = H2O2-generating
oxidases; AAD = Aril-alcool desidrogenases; QR = Quinona redutase .

2.2 Lacases
As lacases pertencem ao grupo das enzimas multicobre oxidase (benzenediol: oxigênio
oxi-redutase) [EC 1.10.3.2]: compostas por um sitio ativo com quatro íons de cobre dispostas
em uma estrutura geométrica e eletrônica (Figura 3), o qual é constituído por um centro tipo 1,
onde se encontra o Cu1 (centro azul); o agrupamento trinuclear composto pelo tipo 2, onde se
encontra os Cu2 e Cu3 e o centro tipo 3 integrado pelo Cu4 (DURÁN et al., 2002). A reação
típica de lacases inicia-se no Cu1, sendo este o primeiro aceptor de elétrons. É neste local que
a oxidação de quatro elétrons de quatro moléculas de substrato (fenóis ou aromáticos doadores
de hidrogênio) ocorre. Este centro também é que determina o ritmo da reação, bem como o
potencial redox das lacases, por conta de suas características estruturais, coordenação
 17

geométrica, ligações de hidrogênio e presença ou ausência de grupos hidrofóbicos. Os elétrons

deste centro são transportados por um tripeptídeo altamente conservado nas lacases (His, Cys,
His) até o centro trinuclear onde o O2 é reduzido à moléculas de água. O processo de redução
do O2 a água e oxidação do substrato ocorre de forma concomitante. A oxidação dos substratos
gera radicais fenóis e intermediários quinona, os quais podem formar dímeros ou polímeros
insolúveis em água (GIARDINA et. al, 2010; DURÁN et. al, 2002; LEONOWICZ et. al, 2001;
RIVA, 2006; SOLOMON et. al, 1996).

Figura 3. Representação esquemática do sítio ativo de lacases. X - aminoácido variável; Cu1 - cobre
T1; Cu4 - cobre T2; Cu 2 e 3 - par de cobres T3. (Fonte: OTERO, 2016 adaptado de CLAUS, 2004).

As lacases são glicoproteínas com proporções glicosídicas variadas em diferentes

organismos. Em plantas cerca de 45% da enzima é composta por glicídios e em fungos estes
geralmente correspondem a 15-30% (SHRADDHA et al., 2011). Estudos têm evidenciado que
a porção glicosídica desempenha papel na proteção da enzima contra a proteólise e radicais
livre e para a estabilidade da proteína (GOMES et al., 2007; MOROZOVA et al., 2007).
A massa molecular das lacases está em torno de 50-130 kDa, com uma temperatura de
ação ótima entre 45-70 °C, havendo preferência por temperaturas mais elevadas. Em relação ao
pH, estudos em diferentes fungos apontam melhor ação em meio ácido com pH em torno de 3-
5. Contudo, alguns estudos apontam estabilidade maior em meio mais neutro a alcalino, sendo
diretamente influenciado pelo substrato, o que provoca expressões de diferentes variações da
enzima. Os valores cinéticos de Km e kcat variam para o mesmo substrato (GOMES et al., 2007;
MOROZOVA et al., 2007; SHRADDHA et al., 2011).
 18

2.2.1 Dinâmica gênica das lacases

Uma grande variabilidade de lacases podem ser produzidas pelas diferentes espécies
produtoras. Esta multiplicidade é causada pela diversificação de isoformas de lacases em fungo
por conta da pluralidade de genes, diferenças nas concentrações de nutrientes, agentes
indutores, graus de polimorfismos, características físico-químicas e propriedades cinéticas. Em
fungos basidiomicetos, há várias espécies produtoras de mais de uma isoforma da enzima
(DURÁN et al., 2002; BLAICH; ESSER, 1975). Baldrian (2006) relata mais de 100 lacases
purificadas, sendo a maioria de basidiomicetos de podridão branca, e embora haja outros grupos
de fungos que as produzem em quantidade inferiores, a estrutura tridimensional da enzima exibe
a mesma arquitetura molecular (POLIZELI; RAI, 2014), incluindo os domínios conservados
relacionados aos sítios de ligação ao cobre (Figura 4).

Figura 4. Estrutura da lacase do fungo Trametes versicolor evidenciando os dos 3 domínios cupredoxin
D1 - domínio 1; D2 - domínio 2; D3 - domínio 3 (Fonte: OTERO, 2016 adaptada de DWIVEDI et al.,
2011).

Diversos fungos possuem mais de um gene em um mesmo cromossomo e essas

sequências gênicas têm mostrado alta conservação em quatro regiões denominadas L1, L2, L3
e L4 (Figura 5). Os transcritos dessas regiões, na estrutura proteica, interagem de forma
especifica com as quatro íons de cobre, formando o sítio ativo, e a simetria natural da
arquitetura, evidencia o fenômeno da duplicação gênica no processo evolutivo para manutenção
desta molécula (KUMAR et al., 2003).
Em trabalho prévio realizado com o fungo Peniophora sp. CBMAI 1063, foram
encontrados no transcriptoma do mesmo (após cultivo nas condições otimizadas), dez
diferentes lacases com peptídeos variando entre 482 a 588 aa de comprimento e massas
 19

moleculares de 53,5 a 64,4 kDa (OTERO et al., 2016). Em adição, Kilaru, Hoegger e Kues,
(2006) encontraram 17 genes para lacases em Coprinopsis cinerea, destas pelo menos nove
produzem isoformas funcionais. A identificação de distintos genes para lacase está diretamente
relacionada ao crescente número de sequenciamento genômico de fungos. Tal diversificação
ainda não é bem compreendida, mas possivelmente a variedade de funções fisiológicas durante
o ciclo de vida celular fúngica pode ser uma explicação (GIARDINA et al., 2010; POLIZELI;
RAI, 2014).

Figura 5. Alinhamento de lacases fúngicas e genes de lacase de Peniophora sp. CBMAI 1063
transcritos. Os retângulos vermelhos representam as regiões conservadas L1, L2, L3 e L4 (Fonte:
OTERO, 2016).

Com relação à abundância de genes que codificam para lacases, diversos componentes
têm se apresentado como indutores. Ensaios têm evidenciado que a presença e proporção de
carbono e nitrogênio influenciam na regulação da expressão gênica (D'AGOSTINI et al., 2011).
Agentes químicos como tween, álcool veratrílico, ácido nicotínico e ácido L-aspártico, podem
induzir a produção destes biocatalizadores em fungos (GIESE et al., 2004; SHANKAR;
SHIKHA, 2012). Outros componentes reguladores são os íons metais Cu+2, Cd+2, Ag+, Mn+2.
Os compostos aromáticos de igual forma também têm sido reportados como indutores,
incluindo a presença de pequenas quantidades de corantes, possivelmente sendo esse fato
relacionado à defesa contra o estresse causado pelas substâncias fenólicas (GIARDINA et al.,
2010; THURSTON, 1994; YAVER et al., 1996; POLIZELI; RAI, 2014; COLLINS; DOBSON,
1997; VAITHANOMSAT et al., 2010).
 20

2.2.2 Organismos produtores de lacases

A enzima lacase foi isolada pela primeira vez em 1883 da árvore japonesa da família do
caju, Rhus vernicifera (Toxicodendron vericifluum) (Yoshida, 1883). Entretanto, atualmente,
sabe-se que lacases são amplamente distribuídas na natureza, podendo ser encontradas em
representantes dos três domínios: archaea (Haloferax volcanii), procariotos (bactérias e
cianobactérias) e eucariotos (fungos, algas, insetos, corais, pepino do mar e plantas)
(UTHANDI et al., 2010; THEERACHAT; GUIEYSSE, 2018; POLIZELI; RAI, 2014;
MOROZOVA et al., 2007; HUTTERMANN; MAI; KHADAZIPOUR, 2001).
Distintas funções biológicas têm sido associadas às lacases. Em plantas, acredita-se que
a enzima desempenha um papel na síntese de lignina e catálise da polimerização radicular de
unidades estruturais de álcoois p-cumarilico, coniferilico e sinapilico (BAO et al., 1993;
POLIZELI; RAI, 2014, MOROZOVA et al., 2007). Em bactérias, atua na morfogênese,
biossíntese do pigmento marrom de esporos, na proteção contra raios UV e peróxido de
hidrogênio, e na homeostasia do cobre (SHARMA; GOEL; CAPALASH, 2007). Em insetos,
auxilia na esclerotização da cutícula epidérmica (DITTMER et al., 2004). Em invertebrados
como pepino do mar e corais, ainda não está bem solucionada a função desta enzima, porém,
acredita-se que esteja relacionada à proteção contra agentes biológicos, por estar presente na
via de melanização, ou assim como nos insetos, estar relacionada à esclerotização e regeneração
causada por injúrias (MYDLARZ; PALMER, 2011; JIANG et al., 2014). Em algas, as lacases
parecem agir na detoxificação de componentes fenólicos, desempenhando papel na síntese de
componentes da parede celular e absorção de produtos resultantes da quebra de materiais
ligninolíticos de componentes fenólicos (OTTO; SCHLOSSER, 2014). Em fungos há maior
produção e desempenho, incluindo o auxílio no desenvolvimento do corpo de frutificação,
pigmentação dos esporos, diferenciação sexual, formação do rizomorfo, morfogênese, defesa
contra estresse, ação contra patógenos, detoxificação e, principalmente, ligninólise (quebra das
ligações carbono-carbono ou carbono-oxigênio em polímeros de lignina ou componentes
ligninolíticos) (LEONOWICZ, et al., 2001; GOMES et al., 2007; GIARDINA et al., 2010;
BALDRIAN, 2006; POLIZELI; RAI, 2014).
Devido ao fato dos fungos possuírem habilidades em produzir lacases de forma mais
expressiva, podendo apresentar capacidade oxidativa superior à de outros organismos, esses
organismos são os de maior interesse do ponto de vista biotecnológico (SHRADDHA et al.,
2011). Em adição, as lacases fúngicas exibem alta estabilidade molecular e maior potencial de
redução em comparação com as lacases de outros organismos (RODGERS et al., 2009). Vários
estudos reportam a habilidade de fungos basidiomicetos de origem terrestre para a produção de
 21

lacases (PATEL et al., 2014; TINOCO et al., 2011; SIVAKUMAR et al., 2010; MANAVALAN
et al., 2013; REVANKAR; LELE, 2006; SENTHIVELAN; KANAGARAJ; PANDA, 2016),
porém, os estudos com fungos de origem marinha ainda são escassos.

2.2.3 Produção de lacases por fungos de origem marinha

Os fungos encontrados no ambiente marinho podem ser classificados quanto aos
hábitos: são marinhos obrigatórios aqueles que crescem e esporulam exclusivamente em
ambiente marinho (substratos, estuários, água do mar), ao passo que os facultativos são aqueles
capazes de crescer no ambiente marinho, porém são provenientes da água doce ou de ambiente
terrestre (KOHLMEYER; VOLKMANN-KOHLMEYER 2003). Devido à dificuldade de
classificação dos fungos marinhos, o termo fungos derivados marinhos (marine-derived fungi)
tem sido utilizado para englobar os fungos que foram isolados do ambiente marinho, sem a
necessidade categorizá-los como marinhos obrigatórios ou facultativos (OSTERHAGE, 2001).
De acordo com Jones et al. (2009), há dez anos atrás, a estimativa da biodiversidade dos
fungos marinhos era de 530 espécies, sendo 424 representantes dos ascomicetos, 12 dos
basidiomicetos (sem a inclusão de leveduras) e 94 de fungos anamórficos, exclusos os fungos
verdadeiros zoospóricos. É evidente que estes números não reflete a verdadeira diversidade dos
fungos marinhos, mas demonstram que o mar, sendo um amplo ecossistema, é pouco explorado
na área da micologia.
Estes microrganismos são encontrados em associação com vários organismos (e.g.
algas, corais, tunicados, moluscos, plantas, peixes e esponjas) (SHIN; LEE, 2000) e apresentam
excelente perspectiva para o campo biotecnológico, devido às suas adaptações fisiológicas
relacionadas com a tolerância a elevadas concentrações de sais, alta pressão, baixa temperatura,
condições oligotróficas, pH extremos, disparidades nas concentrações de minerais, além das
condições de pouca incidência de raios de luz (BONUGLI-SANTOS et al., 2015). De acordo
com Passarini e colaboradores (2011) uma vasta fração de fungos marinhos ainda não foram
catalogados os quais podem apresentar capacidade de produzir enzimas ligninolíticas e
degradar poluentes, tais como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Em adição,
Bounugli-Santos e colaboradores (2015) reportaram haver um amplo mercado para enzimas
produzidas por fungos marinhos, incluindo as lacases.
Alguns fungos derivados de ambiente marinho foram reportados em literatura como
produtores de enzimas ligninolíticas. D’Souza et al., (2006) reportaram a produção de uma
quantidade elevada de lacases por um fungo basidiomiceto marinho não identificado. No estudo
de Raghukumar e colaboradores (1994) foram alcançados resultados positivos para a produção
 22

de enzimas ligninolíticas (LiP, MnP e lacase) pelo fungo de degradação branca Flavadon flavus
isolado dos detritos da alga Thalassia hemprichii. Li, Kondo e Sakai (2003a, 2003b) publicaram
dois artigos envolvendo a produção de enzimas ligninolíticas pelo basidiomiceto de
decomposição branca Phlebia sp. lMG-60 em diferentes concentrações de sal. Estudos do nosso
grupo de pesquisa envolvendo a produção de ligninases por fungos derivados-marinhos, bem
como a otimização e expressão de lacases foram também publicados (DA SILVA et al., 2008;
BONUGLI-SANTOS, 2010a, 2010b; PASSARINI et al., 2015; OTERO et al., 2017;
MAINARDI et al., 2018; DUARTE et al., 2018).

2.2.4 Aplicações das lacases

Devido à capacidade de oxidar grande número de compostos aromáticos as lacases são
promissoras em aplicações biotecnológicas. Estas enzimas podem ser utilizadas na forma nativa
ou imobilizada, em ambientes aquosos, na presença de solventes orgânicos, oferecendo
aplicabilidade em diferentes campos industriais e na biorremediação. As vantagens em usar
lacases em processos industrias são extensas, e inclui entre outras, a sua ação como mediadoras
de baixo peso molecular (LEONOWICZ et al., 2001; POLIZELI; RAI, 2014; MINUSSI;
PASTORE; DURÁN, 2002).

2.2.4.1 Química sintética e orgânica

Usada na sínteses de corantes; em procedimentos de polimerização de monômeros de
catecol para a produção de policatecol sintético; na fabricação de polímeros inertes de fenóis,
os quais possuem diversas aplicações, tal como ligações de fibra, laminados, revestimento e
adesivos. Na fabricação de aldeídos aromáticos a partir do teuteno como substrato, síntese de
polímeros de reutina objetivando inibição de adipogênicos e de aminonaftoquinonas com
atividade anticâncer (GONÇALVES; SILVA; CAVACO-PAULO, 2015; POLIZELI; RAI,
2014GIARDINA et al., 2010).

2.2.4.2 Indústria de papel

Lacases agem no branqueamento da polpa e deslignificação, no tratamento de efluente
deste tipo de indústria, no pré-tratamento da madeira, melhoramento a solubilidade da lignina.
A enzima, de modo geral, age sobre substratos presente na matéria prima do papel,
proporcionando modificações na lignina, evitando assim, o uso de cloro ou oxidantes
quimicamente baseado em oxigênio, reduzindo a quantidade requerida de água e energia no
 23

processamento da polpa (GONÇALVES; SILVA; CAVACO-PAULO, 2015; POLIZELI; RAI,

2014; GIARDINA et al., 2010; LEONOWICZ et al., 2001).

2.2.4.3 Indústria de alimentos

Lacases são utilizadas em massas tornando-as mais fortes, estáveis, reduzindo a
viscosidade, aumentando o volume e tornando-as mais macias (geralmente não exigindo a
presença de glúten); garante a estabilização do mosto; utilizada para melhoria da cor e a
qualidade de vinhos e sucos; remoção de polifenóis em cerveja, aumentando assim, o prazo de
validade; eliminação de oxigênio dissolvido em óleos vegetais, evitando a oxidação indesejada,
além disso, é usada no pré-tratamento do cacau para enriquecer o sabor e o gosto do chocolate
(BONUGLI-SANTOS et al., 2015; GONÇALVES; SILVA; CAVACO-PAULO, 2015;
POLIZELI; RAI, 2014; GIARDINA et al., 2010; MINUSSI; PASTORE; DURÁN, 2002;
LEONOWICZ et al., 2001).

2.2.4.4 Indústrias farmacêuticas e de cosméticos

Na indústria farmacêutica lacases podem ser aplicadas tanto para reduzir o número de
passos na síntese de drogas, diminuir toxicidades de alguns reagentes, tornando o processo de
fabricação mais barato, facilitando a fabricação por acoplamentos oxidativos. Além disso, estas
enzimas podem ser aplicadas para modificar ou degradar componentes farmacêuticos, como
agentes não-esteróis e antibióticos a fim de evitar lança-los no ambiente. São aplicadas com
ação antimicrobiana, como desintoxicante; como droga (e.g. actinomicina anticâncer,
antibióticos, sedativos, anti-inflamatórios); aplicadas em produtos para clareamento de pele e
na produção de iodine, um reagente largamente usado como desinfetante (BONUGLI-SANTOS
et al., 2015; GONÇALVES; SILVA; CAVACO-PAULO, 2015; POLIZELI; RAI, 2014).

2.2.4.5 Biorremediação
Componentes tóxicos muitas vezes fazem parte de efluentes industriais, tornando-se um
problema ambiental de difícil tratamento. Neste sentido, microrganismos produtores de lacases
podem ser aplicados na descontaminação, por possuírem capacidade de quebrar moléculas
xenobioticas em estruturas que podem ser menos toxicas, por ligar em nanoparticulas
magnéticas amino-funcionalizadas, corantes têxteis, fármacos aromáticos e outros
(GONÇALVES; SILVA; CAVACO-PAULO, 2015; BONUGLI-SANTOS et al., 2015;
POLIZELI; RAI, 2014; LEONOWICZ et al., 2001).
 24

2.2.4.6 Outras aplicações

Lacases têm mostrado ser útil em aplicações nanobiotecnológicas, devido a capacidade
para catalisar a eletrotransferência sem a necessidade de um cofator. Têm sido aplicadas para
sínteses de vários itens funcionais com propriedades mecânicas, elétrica, ótica ou pesticida; têm
apresentado função importante como biosensores na detecção de fenóis em dejetos aquático ou
na indústria de alimentos, bem como, por meio de reações oxidativas por radicais-mediadores
livres atuar no campo de biocombustíveis (BONUGLI-SANTOS et al., 2015; POLIZELI; RAI,
2014; GIARDINA et al., 2010; MOROZOVA et al., 2007; MINUSSI; PASTORE; DURÁN,
2002).

2.2.4.7 Aplicação de lacases na indústria têxtil

Os corantes são feitos de fontes distintas, podem ser naturais, inorgânicos ou sintéticos,
com maior preocupação para estes últimos, devido ao alto custo e dificuldade em tratá-los
(KARTIKA, 2015; ROSSI et al., 2017). Os corantes naturais de organismos vivos e inorgânicos
provenientes de minerais, embora se apresentem como “amigos do ambiente”, eles têm um lado
negativo por conta dos mordentes utilizados para a fixação no tecido que são majoritariamente
sais metálicos (e.g. alúmen, sulfato de cobre, sulfato ferroso, dicromato de potássio e cloreto
estanoso, entre outros) e podem causar bioacumulação (KUMAR; DAYAL; ONIAL, 2014;
BENKHAYA; HARFI; HARFI, 2017).
Em relação aos corantes sintéticos, eles são classificados com base em sua composição
química ou aplicação. (i) azos: são os mais utilizados, apresentam cromóforo com ligação azo
(–N = N–), são bem aceitos devido à resistência às ações físico-químicas, simplicidade na
reação de acoplamento, variações estruturais e alta extinção molar (Figura 6 A) (ONG et al.,
2010; ARACAGÖK; CİHANGİR, 2013). (ii) sulfurosos: os quais possuem uma estrutura
altamente complexa, feita principalmente pela tionização de vários intermediários aromáticos
(Figura 6 B); (iii) corantes ácidos (pH 3-7): aplicados sob condições acídicas, eles têm uma
variedade de estruturas e complexos metálicos, o arranjo sufonado dá solubilidade em água
(Figura 6 C); (iv) corantes dispersos: são insolúveis em água, aplicados em substratos
hidrofóbicos, exigindo muita água no processo de tingimento (Figura 6 D); (v) corantes básicos:
têm difusão em água quente, produzem cátions para atrair carga negativa ao corante, que vêm
do grupo amônio, entre outros (Figura 6 E); (vi) corantes diretos: são formados por vários
cromóforos, estilbeno, ftalocianina, dioxazina e outras classes químicas menores, como
formazan, antraquinona, quinolona e tiazol (Figura 6 F); (vii) corantes de antraquinona: podem
 25

ser neutros, catiônicos ou aniônicos, contendo funções de hidroxila ou amina, sistema de anel
policondensado e outros (Figura 6 G); (viii) corantes indigóides: a princípio foram extraídos de
plantas, posteriormente sintetizados em laboratório, apresentam baixa solubilidade devido a sua
ligação de hidrogênio intra- e intermolecular (Figura 6 H); (ix) corantes metálicos complexos:
apresentam um átomo de metal, geralmente metais pesados (Cr, Co e Cu), os quais oferecem
cores profundas e ajudam na fixação; (x) corantes reativos: são os terceiros mais presentes no
mercado correspondendo a 16% do total, uma classe de corantes com grupos funcionais
específicos que atuam por ligação covalente com o substrato, de ampla gama de tons estáveis a
luz e resistentes a lavagem em algodão, contudo, apresenta pobre fixação no tecido alvo, sendo
aplicado em tecidos a base de celulose, lã e nylon (Figura 6 I) (BENKHAYA; HARFI; HARFI,
2017; CERRÓN et al, 2015; OLIVEIRA et al., 2016; HUNGER, 2004; GHOSH; DASTIDAR;
SREEKRISHNAN, 2016).
A indústria têxtil libera grande quantidade de efluentes contendo diversos tipos de
corantes, os quais possuem alta salinidade e mordentes (KUMAR; DAYAL; ONIAL, 2014;
BENKHAYA; HARFI; HARFI, 2017). Em razão disso, as suas águas residuais se apresentam
como um grande desafio, devido à dificuldade em tratá-las e aos efeitos adversos nos leitos de
rios. Os metais pesados e a estrutura química dos corantes têxteis podem contribuir para a
mutação, alergias ou desenvolvimento de câncer nos organismos vivos. Também resistem à
agentes biológicos e/ou químicos, podem causar efeitos adversos de toxicidade, bloqueiam a
passagem da luz para os ecossistemas aquáticos mais profundos, diminuindo o processo de
fotossíntese, levando à condições anaeróbicas, o que por consequência leva à morte formas de
vida aquáticas, causando danos ambientais e odor desagradável. Além do mais, os corantes
hidrofóbicos, por não dissolverem em água, exigem grande quantidade de líquido para serem
tratados, e uma porcentagem significativa de corantes permanece na água após o banho
(RAGHUKUMAR; D’SOUZA-TICLO; VERMA, 2008; ROSSI, et al., 2017; CERRON et al.
2015; MALINAUSKIENE et al., 2012; HUNGER, 2004; SCHNEIDER; HAFNER; JAGER,
2004; CORREIA; STEPHENSON; JUDD, 1994; CHUNG; CERNIGLIA, 1992).
Por conta disto, microrganismos com adaptações fisiológicas e capazes de sintetizar
biomoléculas estáveis em situações adversas são almejados na área da biotecnologia ambiental.
Nesse contexto, os fungos marinhos podem, por consequência de suas adaptações, ser efetivos
em tratamentos de efluentes têxteis (RAGHUKUMAR; D’SOUZA-TICLO; VERMA, 2008;
TRINCONE, 2010).
 26

Figura 6. Estrutura química de diferentes grupos de corante têxtis: (A) corante azo; (B) corante
sulfuroso; (C) corante ácido; (D) corante disperso; (E) corante básico; (F) corante direto; (G) corante
antraquinona; (H) corante indigóides; (I) corante reativo.

A - Corante Azo
B - Corante Sulfuroso
(Preto sulfuroso I)

C- Corante Ácido (Azul ácido 25) D- Corante Disperso (Vermelho disperso 8)

F - Corante Direto (Vermelho direto 2)

E- Corante Básico (Azul básico

22)

H - Corante indigóides (Azul ácido

74)

G - Corante Antraquinona I - Corante reativo (Vermelho reativo

(Azul reativo 4) 198)
 27

Compostos com capacidade de despolimerização são ótimos agentes despoluentes, em

consequência do seu método de sequestramento, os quais convertem componentes tóxicos em
não tóxicos, sem a necessidade de removê-los do ambiente. Enzimas ligninolíticas têm
demonstrado resultados satisfatórios nesta abordagem, pois reduzem compostos aromáticos, e
dentre elas as lacases têm demonstrado participação ativa no processo de descoloração de
corantes têxteis (RAGHUKUMAR; D’SOUZA-TICLO; VERMA, 2008; NILADEVI; JACOB;
PREMA, 2008; SHRADDHA et al., 2011; VAITHANOMSAT et al., 2010; BONUGLI-
SANTOS et al., 2016). Lacases degradam corantes têxteis do tipo azo oxidando os grupos
fenólicos, produzindo radicais próximo à ligação azo, permitindo assim, que o carbono fenólico
seja atraído pela molécula de água resultando em sua quebra (Figura 7) (MOJSOV et al., 2016).

Figura 7. Esquema de uma via geral de degradação de corante azo em reação com lacase (LC) na
presença de oxigênio molecular (fonte: ZUCCA et al., 2015).

Degradação não
Outro produto enzimática

Outro produto

Diversos estudos têm evidenciado sucesso de lacases de basidiomicetos na descoloração

de corantes têxtis em distintas condições. Yang e colaboradores (2014) mostraram que lacase
de Cerrena sp. HYB07 foi capaz de descolorir 13 corantes têxteis de diferentes classes em mais
de 50% em 24 horas, utilizando baixa concentração de lacase (0,2 U/mL) em conjunto com
mediadores. Zheng et al., (2017) reportaram mais de 50% de descoloração de seis corante em
 28

48 horas, utilizando 1 U/mL de lacases de Trametes orientalis. O estudo conduzido por Kumari,
Kishor e Guptasarma (2018) com a lacase recombinante de Thermus thermophilus deixa
evidente o papel positivo de mediadores na eficiência da descoloração de corantes têxteis, o
trabalho aponta três corantes descoloridos sem necessidade de mediadores, e outros três, nos
quais somente ocorreu a descoloração na presença dos mediadores.
Estudos também têm revelado o potencial de lacases na descoloração de corantes têxteis
em caldo bruto, onde foram reportadas alta porcentagem de descoloração em curto tempo na
presença e ausência de mediadores (COUTO, 2007; STOILOVA; KRASTANOV;
STANCHEV, 2010). A descoloração de corantes têxteis por lacases é um fato. Entretanto, o
ritmo da descoloração e capacidade para descolorir é dependente de vários fatores, tais como o
potencial redox, concentração da enzima, condições físico-químicas para ação no meio de
cultivo (temperatura, pH e mediadores), e a estrutura do corante (KUMARI; KISHOR;
GUPTASARMA, 2018; BIBI; BHATTI, 2012; MIRZADEH et al., 2014).
Além da ação na descoloração e degradação de corantes, as lacases possuem outras
aplicações na indústria têxtil, as quais fornecem economia de água, de químicos e de energia
(MOJSOV, 2014). Estas enzimas têm sido aplicadas no branqueamento de tecidos têxteis ou
no enriquecimento da tonalidade branca de tecidos a base de algodão ou lã. Podem também
auxiliar no acoplamento de corante, permitindo o desenvolvimento de novas cores, auxiliam na
fixação de corantes em tecidos de lã e algodão, são utilizadas para prevenir o encolhimento de
lãs, podem ser empregadas em conjunto com produtos de limpeza a fim de eliminar odores e
detergentes formados durante o processo de lavagem do tecido. Além disso, lacases podem ser
usadas como enxertos biocatalídicos em tecidos de lã, a fim de auxiliar na ação do componente
fenólico insolúvel lauril galato (MATE; ALCADE, 2017; MOJSOV, 2014; COUTO et al.,
2006).
 29

3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Caracterizar bioquimicamente as lacases de dois fungos basidiomicetos de origem
marinha e gêneros homólogos de origem terrestre a fim de determinar e comparar as
características enzimáticas dos mesmos e avaliar a eficiência das lacases parcialmente
purificadas na descoloração de corantes da indústria têxtil.

3.2 Objetivos específicos

 Produção, purificação, caracterização físico-química e determinação da cinética enzimática
das lacases produzidas pelos fungos basidiomicetos marinhos e terrestres dos gêneros
Peniophora e Marasmiellus;
 Comparação das propriedades bioquímicas de lacases produzidas pelas espécies de origem
marinha e terrestre;
 Avaliação da descoloração e destoxificação de corante têxtil pelas lacases purificadas
produzidas pelos fungos em estudo.

4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Microrganismos
Os fungos de origem marinha utilizados neste trabalho Peniophora sp. CBMAI 1063 e
Marasmiellus sp. CBMAI 1062 foram isolados de esponjas marinhas coletadas no litoral norte
do Estado de São Paulo (MENEZES et al., 2010) e foram identificados por Bonugli-Santos e
colaboradores (2010a). Os fungos de origem terrestre Peniophora cinerea CCIBt 2541 e
Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 foram adquiridos da Coleção de Culturas de Algas,
Cianobactérias e Fungos do Instituto de Botânica, São Paulo (CCIBT). Todos os fungos
estudados estão preservados por dois métodos distintos (criopreservação e Castellani) na
coleção de pesquisa do Laboratório de Micologia Ambiental e Industrial (LAMAI) do Instituto
de Biociências da UNESP campus Rio Claro, a qual é parte da Central de Recursos Microbianos
da UNESP (CRM-UNESP).

4.1.1 Peniophora sp. CBMAI 1063

Representantes do gênero Peniophora são encontrados tanto em ambiente terrestre quanto
marinho e são considerados basidiomicetos de podridão branca (ordem Russulales), com hifas
apresentando septo do tipo doliporo (TANI; FUJII; NAKAJIMA, 2001). Peniophora spp.
 30

podem ser isoladas de ambientes sob decomposição tanto em solo quanto em efluentes
(SHANKAR e SHIKHA, 2012).
O fungo Peniophora sp. CBMAI 1063 (Figura 6) isolado da esponja Amphimedon viridis
(MENEZES et al., 2010) é classificado como marinho facultativo, apresenta capacidade de
produção de lacases em escala de Erlenmeyer e biorreator e tem demonstrando ser uma
linhagem adaptada ao ambiente marinho, devido à produção significativa desta enzima apenas
na presença de salinidade e sulfato de cobre, sendo a mesma estável ao estresse térmico e de
pH (MAINARDI et al., 2018).
Figura 8. Peniophora sp. CBMAI 1063 (Fonte: autor)

Este fungo também tem demostrado capacidade em descolorir corantes têxteis: Preto
Reativo (RB) e Azul Brilhante Remazol R (RBBR) (BONUGLI-SANTOS et al., 2012, 2016).
A condição otimizada para a produção de lacases por esse fungo, bem como o uso das mesmas
foi patenteada (número do registro no Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI):
BR102014008502 – SETTE et al., 2014). Em adição, a avaliação do transcriptoma do
Peniophora sp. CBMAI 1063 após cultivo nas condições otimizadas de produção de lacase,
revelou a presença de ao menos oito genes putativos, os quais podem expressar 10 diferentes
lacases (OTERO et al., 2017).

4.1.2 Marasmiellus sp. CBMAI 1062

Da ordem dos Agaricales o gênero Marasmiellus também possui representantes no
ambiente terrestre e marinho (MENEZES et al., 2010). O fungo Marasmiellus sp. CBMAI 1062
(Figura 7) foi isolado da esponja Amphimedon viridis e classificado como marinho facultativo.
Este fungo demonstrou excelente capacidade para degradar hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos (pireno e benzo[a]pireno) (VIEIRA et al., 2018) além de ser um bom produtor de
 31

enzimas ligninolíticas, incluindo a lacase, e efetiva descoloração do corante têxtil Remazol

Briliant Blue R (BONUGLI-SANTOS et al, 2012). Poucos são os estudos que reportam esse
gênero, sendo ainda mais raros os trabalhos com representantes oriundos do ambiente marinho.

Figura 9. Marasmiellus sp. CBMAI 1062 (Fonte: autor).

4.1.3 Peniophora cinerea CCIBt 2541

P. cinerea é um basidiomiceto de podridão branca corticioide (fungo em crosta),
presente em madeiras mortas e também em limbo de plantas lenhosas. São cosmopolitas, no
Brasil alguns representantes dessa espécie foram isolados da mata costeira sob influência
marinha (CHAMURIS, 1991; SILVÉRIO et al., 2012).
P. cinerea quando mobilizado, apresenta melhor produção de lacases em comparação
como a mesma cepa livre, estudos tem demonstrado que este fungo expressa pelo menos oito
lacases, com massa molecular variando entre 30-70 kDa, com tolerância e estabilidade em meio
salino, capazes de descolorir corantes têxteis como: Azul Reativo 19, efluentes sintéticos com
Vermelho reativo 271 e também efluente natural (MOREIRA-NETO, 2012; SILVÉRIO et al.,
2012).
O fungo P. cinerea CCIBt 2541 (Figura 8) foi isolado de mata de restinga em São
Vicente – SP (informações cedidas pela coleção de culturas de algas, cianobactérias e fungos
do Instituto de Botânica de São Paulo).
 32

Figura 10. Peniophora cinerea CCIBt 2541(Fonte: autor).

4.1.4 Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388

Marasmiellus colocasiae é um típico patógeno da planta Colocasia escluenta (Taro ou
planta do tubérculo inhame), apresenta basidiocarpo de coloração branca. Esta espécie foi
isolada e identificada a partir de plantações de inhame no estado do Espírito Santo. Por conta
da Colocasia escluenta ser exótica, oriunda da Ásia, acredita-se que este fungo também tenha
sido introduzido. Contudo, de maneira geral, existem poucos estudos com fungos do gênero
Marasmiellus, o que impossibilita maiores inferências quanto à sua biologia e distribuição
(CAPELARI et al., 2010) .
O fungo M. colocasiae CCIBt 3388 (Figura 9) foi isolado no estado de São Paulo, porém
dados mais acurados sobre o isolamento não foram disponibilizados.

Figura 11. Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 (Fonte: autor).

 33

4.2 Reativação e cultivo em meio sólido

Os fungos foram reativados e cultivados em meio sólido ágar-malte contendo extrato de
malte 2,0% (w/v) e ágar-ágar 2% (w/v), por 7 dias a 28°C. Após verificação de viabilidade
celular e pureza os mesmos foram utilizados nos experimentos abaixo apresentados.

4.3 Cultivo em meio líquido

Para a produção de lacases pelos fungos estudados foi utilizado o meio de cultura
otimizado por Sette e colaboradores (2014) para a síntese de lacase do fungo de origem marinha
Peniophora sp. CBMAI 1063 (patente depositada junto ao INPI sob o número do registro
BR102014008502). O meio é composto de extrato de levedura 0,20% (w/v), peptona
bacteriológica de caseína 0,27% (w/v), extrato de malte 0,14% (w/v) e glicose 0,27% (w/v). O
meio foi preparado com água do mar artificial (ASW) adaptado de Kester et al. (1967): MgCl2
0,704% (w/v), CaCl2 0,098% (w/v), SrCl2 0,001 (w/v), NaCl 1,555% (w/v), Na2SO4 0,261%
(w/v), KCl 0,044% (w/v), NaHCO3 0,013% (w/v), KBr 0,006% (w/v) e H3BO3 0,002% (w/v),
para os fungos marinhos e com água destilada para os representantes terrestres. Todos os meios
de cultivo foram suplementados com 2 mM de CuSO4.
Os quatro fungos filamentosos foram cultivados por 7 dias em replicatas de 50 ml
(n=10) em erlenmeyer de 125 mL em incubadora shaker com agitação de 140 rpm a 28 ºC. Para
Tanto, foram utilizados 7 cilindros de ágar + micélio (0,9 cm de diâmetro) provenientes do meio
ágar malte como inóculo.

4.4 Atividade enzimática

As atividades enzimáticas foram avaliadas por espectrofotometria UV/VIS usando os
substratos específicos para cada enzima avaliada.

4.4.1 Lacase (Lac)

Os testes de atividade enzimática para lacases foram realizados utilizando o substrato
2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) e Siringaldazina (SYG) a 37 ºC de
acordo com a metodologia descrita por Buswell, Cai e Chang (1995). A mistura continha 0,3
mL de 0,1 M de tampão acetato de sódio (pH 5.0), 0,1 mL de 0,5 mM de solução ABTS ou
SYG e 0,6 mL da solução enzimática (caldo bruto). A oxidação dos substratos foi monitorada
pelo aumento da absorbância a 420 nm (ABTS, ε = 36000 M-1 cm-1) e 525 nm (SYG, ε = 65000
M-1 cm-1), após 10 min de reação.
 34

4.4.2 Atividade enzimática de Manganês Peroxidase (MnP)

Para identificar a atividade de MnP, utilizou-se o método de Wariishi, Valli e Gold
(1992) com a adição de 50 μL de H2O2 (2 mM) em 0,8 mL de tampão malonato de sódio (60
mM; pH 4,5), 50 μL de MnSO4 (10 mM), e 0,1 mL de caldo enzimático. A formação do
complexo Mn+3-malonato foi acompanhada a 270 nm (ε = 11590 M-1 cm-1), após 5 min de
reação.

4.4.3 Atividade enzimática de Lignina Peroxidase (LiP)

A atividade da lignina peroxidase foi avaliada usando o álcool veratrílico como
substrato, a fim de oxidá-lo produzindo do aldeído veratrílico produzido (ε310nm= 9300M-1 cm-
1
). Para tanto, 0,8 mL de tampão tartarato de sódio 125 mM pH 3,0; 0,5 mL de álcool veratrílico
10 mM; 0,5 mL de peróxido de hidrogênio 2 mM e 0,5 mL do caldo enzimático foram
misturados. A reação foi iniciada adicionando o peróxido de hidrogênio e o aparecimento do
aldeído veratrílico foi determinado lendo-se a absorbância a 310 nm, após 10 min de reação
(ARORA; GILL, 2001).

4.4.4 Determinação da atividade enzimática

A atividade enzimática para Lac, MnP e LiP foi calculada conforme a equação 1, sendo
a unidade (U) definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 μmol de substrato
por minuto, expressa em U/L.
U/L = ΔA x V x 106 / ɛ x R x t (Equação 1)
Onde:
ΔA = Diferença entre a absorbância final e a inicial
V = Volume da reação (0,001 L)
106 = Fator de conversão (de ɛ moles para μmoles)
ɛ = Coeficiente de extinção (M-1 cm-1)
R = Quantidade de caldo enzimático (L)
T = Tempo de reação (min)

Os valores obtidos em U/L foram convertidos para a grandeza de U/mL para expressar
a atividade de lacases, devido ao fato da literatura consultada geralmente reportar a atividade
nesta unidade de medida, o que favorece a comparação dos estudos, bem como na facilidade
dos cálculos durante os passos da purificação.
 35

4.5 Purificação e caracterização bioquímica

As etapas de purificação e caracterização foram realizadas no Laboratório de
Biotecnologia Farmacêutica – Faculdade de Ciências Farmacêutica – USP, São Paulo, sob
supervisão do professor Dr. Adalberto Pessoa Junior.

4.5.1 Tratamento do caldo bruto

Os caldos enzimáticos provenientes do cultivo dos quatro fungos em estudo foram
centrifugados (Centrifuga Hettich – Rotina 380R) por 15 min a 4 °C à 10.000 RPM e filtrados
em papel filtro 0,45 μm. Para obtenção de um volume final de 500 mL, tampão acetado de sódio
20 mM (pH 4,5) foi acrescentado ao sobrenadante, os quais foram ultrafiltrados em pelicon
com uma membrana de corte de 10 kDa. Para os fungos marinhos, o processo de ultrafiltração
ocorreu duas vezes, sendo adicionado tampão acetato, trazendo até a marca de 500 mL, a fim
de remover os sais presentes no caldo bruto.

4.5.2 Visualização qualitativa do perfil proteico: SDS- PAGE e revelação de gel nativo
A eletroforese em condição desnaturante foi realizada em poliacrilamida (15%) na
presença de SDS (dodecil sulfato de sódio), a fim de exibir o padrão proteico, tanto do caldo
bruto ultrafiltrado quanto da amostra após cromatografia de troca iônica, sendo conduzido à
temperatura ambiente a 100 V. O gel foi montado em placas de vidro, com espessura de 1 mm.
O tampão Tris/Glicina pH 8,3 com presença de SDS foi utilizado para a corrida do gel. A
amostra foi aplicada à eletroforese com 15 μL do caldo enzimático, 4 μL do tampão de amostra
e 0,5 μL de DTT, usando padrão de 10 proteínas recombinantes 10-250 kDa (Precison plus
protein standards ustained, Bio-Rad). Os géis foram revelados com solução de coloração azul
Coomassie Brilliant.
O gel nativo foi confeccionado com poliacrilamida (10%) na ausência de qualquer
agente desnaturante e submetido a 100 V à 4 °C na presença do tampão Tris/glicina pH 8,3. O
gel foi montado em placas de vidro com espessura de 1,5 mm. A amostra foi aplicada ao gel
com 0,18 mg/mL de proteína, em 15 μL, com tampão de amostra (azul de bromofenol, glicerol,
água). Após a corrida, o gel foi banhado por uma hora em tampão acetato (100 mM) pH 5,
seguido de um banho com tampão acetato (50 mM) pH 5,0 contendo 0,5 mM do substrato
(ABTS e SYG) até revelação das bandas por atividade de lacases.
 36

4.5.3 Teor de proteína

Para a quantificação de proteínas totais o reagente de Bradford (Sigma) foi utilizado.
Para construção da curva foram empregados 20 µL de proteína albumina do soro bovino (BSA)
em concentrações variando de 0 a 0,2 mg/mL (0; 0,01; 0,03; 0,05, 0,1; 0,15 e 0,2) diluídas em
20 mM de tampão acetado de sódio (pH 4,5), reagido com 80 µL do reagente de Bradford. A
leitura foi realizada após o período de 10 min de reação a 595 nm (Apêndice 1).
A fim de determinar o teor de proteínas durante as etapas de purificação dos extratos
fúngicos estudados, 20 µL das amostras e 80 µL do reagente foram utilizados conforme tempo
e comprimento de onda descritos no parágrafo anterior (Apêndices 2-5).

4.5.4 Técnicas cromatográficas

Do total ultrafiltrado concentrado (cerca de 50 mL), 1,5 mL foi submetido à
cromatografia de troca iônica (DEAE - Sepharose Fast Flow GE Healthcare 1 mL). A amostra
ultrafiltrada foi aplicada à coluna cromatográfica externamente ao aparelho, por meio de bomba
peristáltica (Pharmacia LKB P-1) com fluxo de 1 mL/min. A eluição ocorreu pelo acoplamento
da coluna carregada ao equipamento automatizado FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography) ÄKTA START (GE Life Sciences) equipado com detector UV (280 nm) a
um fluxo de 1 mL/min, utilizando 20 mM de tampão acetato de sódio (pH 4,5) em gradiente do
mesmo tampão com 1000 mM de NaCl (0 a 100%), à temperatura ambiente. As frações
correspondentes a um único pico foram reunidas e concentradas em 0,5 mL utilizando Amicon
de 10 kDa, este processo foi repetido cerca de 5 vezes.

4.5.5 Determinação dos parâmetros cinéticos aparente

A constante de Michaelis (KM) e a velocidade máxima (Vmáx) da reação catalisada pelas
lacases foram determinadas com auxílio de gráfico duplo recíproco (Lineweaver–Burk) da
atividade enzimática em função da concentração do substrato ABTS 0,001 – 2 mM e SYG
0,001 – 0,1 mM em tampão acetato de sódio nas condições de pH ótimo à 37 °C.

4.5.6 Temperatura ótima e estabilidade térmica

A temperatura ótima foi determinada incubando a enzima em tampão acetato 100 mM
(pH 5) e o substrato (ABTS) a parte, por 10 min em temperaturas variando de 25 a 75 ºC, com
intervalos de 5 ºC.
 37

Para analisar a estabilidade térmica, a enzima foi incubada por 24hs nos valores
determinados de temperatura ótima em reação com o ABTS. A atividade residual foi mensurada
nos tempos 0 (zero), 1 (uma) e 24 (vinte e quatro) horas, utilizando ABTS como substrato.

4.5.7 pH ótimo
O pH ótimo foi determinado utilizando tampão acetato de sódio 100 mM (pH 3,5 - 5,5),
tampão fosfato 100 mM (pH 6,0-8,0) nas condições de temperatura ótima, incubando-se a
enzima em tampão e o substrato (ABTS) a parte, por 10 min.

4.5.8 Estabilidade em NaCl e efeito de íons e outros agentes na atividade de lacases

De acordo com a temperatura e pH ótimos de cada conjunto enzimático, tendo com
substrato o ABTS, foram realizados ensaios em diferentes concentrações de NaCl (variando de
10 – 1000 mM) em tampão acetato de sódio 100 mM. Também nestas mesmas condições, o
efeito dos íons Fe2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Al3+, e dos agentes L-cisteína e EDTA, a 10
mM, foram testados sobre a atividade enzimática das lacases.

4.6 Tratamento de corantes têxteis

Para o teste de descoloração foi utilizado o corante têxtil Marinho Reativo (MR) cedido
pela empresa Texpal Química (Valinhos, SP). Este corante é recalcitrante e pode causar
problemas de contaminação ambiental.

4.6.1 Descoloração de corantes têxteis

Os testes de descoloração foram realizados com o conjunto enzimático parcialmente
purificado dos fungos do gênero Peniophora e Marasmiellus em estudo, e com a enzima
comercial de Trametes versicolor (sigma) pura. Um alíquota de 0,2 U/mL do conjunto
enzimático de lacases foi adicionado ao corante têxtil marinho reativo (pH 4,8) em concentração
final de 40 mg/L. A solução resultante da mistura (1,5 mL de solução final) foi incubada na
temperatura 37 °C a 100 rpm por 7 dias. O controle negativo foi preparado por adição da enzima
inativada por aquecimento à solução com o corante. Todos os experimentos foram realizados
em triplicata. A porcentagem de descoloração de cada amostra foi mensurada por absorbância
no início e final do tempo de incubação, usando o espectrofotómetro UV-vis a 595 nm. A
porcentagem da descoloração foi calculada com base na equação 2.
 38

Descoloração (%) = Abs inicial – Abs final x 100

Abs inicial

(Equação 2)

4.6.2 Teste de toxicidade: Microtox

A avaliação da destoxificação do corante marinho reativo após sete dia de incubação foi
realizada por meio da análise de toxicidade aguda em Microtox 500. A técnica consiste na
exposição da bactéria Aliivibrio fischeri a uma amostra, a qual acusa por meio do equipamento
Microtox 500 a toxicidade, com base na luminescência das bactérias vivas. Para tanto, uma
suspensão inicial da bactéria liofilizada em tampão de reativação (10 8 células/mL) foi
preparada. Posteriormente, foi feita uma primeira diluição da bactéria, sendo 150 µL
transferidos para 1500 µL de NaCl 2%. A partir dessa diluição, 50 µL foram transferidos para
cubetas e verificada a luminescência da bactéria (T0). Um volume de 1250 µL da amostra foi
misturada com 125 µL de NaCl 22%, e a mistura foi utilizada para a confecção de diluições
seriadas (1:1). Para o controle foi utilizado NaCl 2%. As diluições (450 µL) foram transferidas
para as cubetas contendo 50 µL da suspenção celular do bioindicador. A leitura em luminômetro
foi realizada em tempos de 5 e 15 min. Os valores referente às leituras da luminescência da
bactéria A. fischeri foram avaliados em programa específico do equipamento Microtox 500,
permitindo inferir o EC50 (concentração que inibe em 50 % a luminescência da bactéria).
A classificação de toxicidade foi realizada de acordo com Bulich (1992), com base nos
dados da Tabela 1.

Tabela 1. Classificação das faixas de toxicidade aguda segundo Bulich (1992).

Grau de Toxicidade
EC50 (%) Classificação
<25 Muito tóxica
25 – 50 Tóxica
51 – 75 Moderadamente tóxica
>75 Levemente tóxica
 39

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Atividade de lacases
Atividades de lacases foram detectadas nos caldos enzimáticos dos fungos dos gêneros
Peniophora e Marasmiellus cultivados nas mesmas condições, porém com ausência de
salinidade (ASW) para as espécies terrestres. As diluições para cada caldo bruto foram
estabelecidas de acordo com a atividade enzimática, com limite máximo de leitura de 0,500 de
absorbância. Estas diluições foram mantidas em todas as etapas das análises.
O meio de cultivo otimizado por Sette e colaboradores (2014) para o fungo Peniophora
sp. CBMAI 1063 mostrou-se eficiente para os fungos Peniophora cinerea CCIBt 2541 e
Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388, sendo as quantidades obtidas equivalentes para os
fungos do gênero Peniophora (Tabela 2, Apêndices 6-8). O extrato de malte, um dos
componentes do meio de cultura, tem se mostrado eficiente na produção exclusiva de lacases
(DEDEYAN et al, 2000; TAGGER et al, 1998, ZOUARI-MECHICHI et al, 2006). Para o fungo
marinho Marasmiellus sp. CBMAI 1062 a quantidade de lacase produzida foi detectada
(Apêndice 9), porém, a forte coloração marrom que surgiu em torno do quarto dia de cultivo,
impediu a quantificação acurada da enzima, sendo necessário diluições a níveis detectáveis.
Esta coloração também está presente no M. colocasiae CCIBt 2541, porém em menor
quantidade, causando menor impacto na detecção e quantificação enzimática. Bonugli-Santos
e colaboradores (2010a) reportaram uma atividade maior de lacase (0,97 U/mL) para o fungo
Marasmiellus sp. CBMAI 1062 utilizando o meio malte 2% em água do mar artificial após 21
dias de cultivo, sem CuSO4. O tempo de cultivo aparentemente afeta a produção da enzima,
entretanto os valores obtidos foram suficientes para que as análises ocorressem.
Não foram detectadas atividade paras as enzimas ligninolíticas manganês peroxidade e
lignina peroxidase nos caldos brutos dos quatro fungos estudados.

5.2 Purificação de lacases

Os caldos brutos provenientes dos cultivos dos fungos em estudo foram submetidos à
ultrafiltração, para concentrar, dessalinizar, remover pigmentos e compostos com tamanhos
menores que 10 kDa. Como esperado, após este procedimento houve aumento na concentração
de proteínas totais em todos os caldos brutos ultrafiltrados (Tabela 2).
Este procedimento mostrou-se importante no tratamento dos caldos brutos dos fungos
do gênero Marasmiellus, pois removeu a pigmentação que interferia na determinação da
atividade enzimática de lacases. Por conta disso, os valores da atividade enzimática no caldo
 40

bruto, para os fungos de ambos gêneros em estudo, não foram apresentados na Tabela 2,
considerando, assim, este como o passo inicial.
A ultrafiltração e precipitação por sulfato de amônia têm sido técnicas recorrentes no
processo iniciais de purificação de lacases, ambas permitem alto grau de recuperação,
geralmente recuperando entre 70-100% da atividade inicial, entretanto valores até 50% são
considerados dentro do limite para utilização dessas técnicas (DAÂSSI et al., 2013; PARK;
PARK, 2014; DEDEYAN et al., 2000; MORE et al., 2011; SI; PENG; CUI, 2013; CHEN et
al., 2013).

Tabela 2. Etapas do processo de purificação da lacase referente aos fungos marinhos e terrestres dos
gêneros Peniophora e Marasmiellus. Atividade enzimática com base na reação com ABTS.
Táxon Amostra Volume Atividade Atividade Proteínas Recuperação Atividade Fator de
(mL) (U/mL) total (U) totais (%) específica purificação
(mg/mL) (U/mg)
Peniophora Ultrafiltrado 52,00 10,60 551,20 0,18 100,00 58,80 3,80
sp. CBMAI DEAE 17,30 4,70 81,31 0,13 14,75 36,15 2,30
1063
Peniophora Ultrafiltrado 55,00 6,40 352,00 0,22 100,00 29,00 2,60
cinerea DEAE 18,30 0,64 11,52 0,07 3,30 3,20 0,30
CCIBt 2541
Marasmiellus Ultrafiltrado 46,00 8,10 373,00 0,47 100,00 17,00 2,00
colocasiae DEAE 15,34 15,00 230,00 0,42 62,00 36,00 4,00
CCIBt 3388
Marasmiellus Ultrafiltrado 38,00 0,03 1,30 0,24 100,00 0,13 14,00
sp CBMAI DEAE 12,70 0,08 1,01 0,12 78,40 0,70 70,00
1062

O permeado obtido com a ultrafiltração do caldo bruto de cada fungo, em volume de 1,5
mL, a cada eluição, foi submetido à cromatografia de troca iônica (coluna aniônica DEAE-
sepharose FF, 1 mL), com a finalidade de eliminar proteínas que não apresentassem atividades
para lacase. Após realizadas as etapas de adsorção e eluição, apenas um pico foi identificado
nos cromatogramas A, B e D e dois picos no cromatograma C, conforme apresentado na Figura
12. As frações referentes a esses picos foram submetidas ao teste de atividade enzimática, e
todas foram positivas para atividade de lacase. Posteriormente, as mesmas foram reunidas em
uma única amostra, dessalinizadas e concentradas para 0,5 mL.
Após o processo de purificação por troca aniônica, a atividade específica para os fungos
do gênero Marasmiellus apresentaram recuperação de 62,00% e 78,40% para as lacases dos
fungos de origem terrestre e marinha, respectivamente (Tabela 2). No caso dos fungos do
 41

gênero Peniophora verificou-se baixo rendimento na etapa de troca aniônica (Tabela 2). Uma
das possíveis explicações seria a proximidade do pH do tampão de adsorção com o ponto
isoelétrico das lacases produzidas por estes fungos. Pelo fato de não termos conhecimento do
valor exato do ponto isoelétrico das amostras que estavam sendo injetadas na coluna, o tampão
e o valor do pH (acetato de sódio, pH 4,5) foram definidos com base em dados da literatura
encontrados para lacases fúngicas, ou seja, com valores de ponto isoelétrico entre 3,5 e 4,0
(GIARDINA et. al, 2010; BALDRIAN, 2006; EGGERT et. al, 1998; TIEN; KIRK, 1884).
Outros trabalhos científicos que abordam a purificação de lacases, os quais utilizaram este
tampão na faixa de pH próximo ao relatado também foram tomados como base (GARCIA,
2006; MOREIRA-NETO, 2012; EGGERT et. al, 1995).

Figura 12. Cromatograma da troca aniônica (DEAE-Sepharose FF) de 1,5 mL do caldo bruto
ultrafiltrado concentrado Peniophora cinerea CCIBt 2541 (A); Peniophora sp. CBMAI 1063 (B);
Marasmiellus sp. CBMAI 1062 (C); Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 (D).

A B

C D

Os resultados da cromatografia de troca iônica revelaram baixa recuperação da atividade

enzimática, principalmente para o P. cinerea CCIBt 2541 (3,30%). O perfil proteico dessas
amostras podem ser qualitativamente observados nas Figuras 13 A e 13 B. Onde, para tornar-
 42

se nítida a visualização do perfil proteico deste fungo, seis repetições de cromatografia, com
atividade para lacases foram coletadas e concentradas em 0,5 mL, totalizando 0,42 mg/mL
aplicadas ao gel SDS-Page.
As frações coletadas apresentaram fator de purificação final satisfatório apenas para os
fungos do gênero Marasmiellus, sendo o do Marasmiellus sp. CBMAI 1062 na grandeza de
70,00 (Tabela 2). Entre os fungos do gênero Peniophora, o P. cinera CCIBt 2541 apresentou o
menor fator de purificação, da ordem de 0,30. Porém, todas as amostras parcialmente
purificadas na cromatografia de troca iônica foram satisfatórias para as análises seguintes.
O processo de purificação enzimática requer em cada passo o monitoramento de
proteínas e atividade da enzima de interesse, gerando custo e trabalho (GARCIA, 2006).
Lacases geralmente são enzimas que requerem várias etapas na purificação, para tanto, técnicas
iniciais de filtrações e concentrações (Ultrafiltração e precipitação por sulfato de amônia) são
fundamentais. Devido ao fato das lacases serem enzimas de carga positiva, frequentemente se
inicia a etapa cromatográfica com o método da troca aniônica, sendo as colunas mais utilizadas
DEAE (Celulose ou sepharose), Hitrap QFF, Q-sepharose (ZHENG et al., 2017; MORE et al.,
2011; DAÂSSI et al., 2013; MOREIRA; MILAGRES; MUSSATTO, 2014; SI; PENG; CUI,
2013; OBARA et al., 2005; BAGEWADI; MULLA; NINNEKAR, 2017). Porém, a maioria dos
processos requerem mais de um passo cromatográfico, há trabalhos que utilizam até três a fim
de purificar a enzima (DEDEYAN et al., 2000; ZOUARI-MECHICHI et al., 2006; PARK;
PARK, 2014). O presente trabalho utilizou apenas um passo cromatográfico, sendo assim, o
mesmo se apresenta como uma alternativa à redução tempo e custos em aplicações industriais.
O processo de recuperação, bem como demais valores referentes ao monitoramento da
purificação (atividade específica, fator de purificação, proteínas totais, atividade total) não são
uniformes. Isso pode ser percebido pela análise dos quatro fungos estudados (Tabela 2), bem
como em outros estudos (ZHENG et al., 2017; MORE et al., 2011; MOREIRA; MILAGRES;
MUSSATO, 2014; SI; PENG; CUI, 2013; OBARA et al., 2005; BAGEWADI; MULLA;
NINNEKAR, 2017; DEDEYAN et al., 2000; ZOUARI-MECHICHI et al., 2006). Tal variação
é diretamente influenciada por fatores como: características das demais enzimas presente no
extrato bruto, proximidade do ponto isoelétrico entre as proteínas, o qual deve ser levando em
conta também na escolha da coluna, as condições do ambiente de corrida, pH, composição do
tampão, entre outros. Park e Park (2014) recuperou cerca de 53% da atividade de lacases de
Fomitopsis pinicola após ultrafiltração, e após a troca aniônica (DEAE-Sepharose) a
recuperação caiu para cerca de 43%, nestes processos o fator de purificação aumentou de 1,9
para 7,1, sendo que no passo final havia apenas 9% de rendimento com fator de purificação na
 43

ordem de 60. No entanto, Daâssi e col. (2014) recuperaram 97,5% da atividade de lacase de
Trametes sp. após ultrafiltração e 78,5% após a troca aniônica (Hitrap Q FF), aumentando o
fator de purificação de 1 para 5.
É importante destacar que apesar dos cromatogramas apresentados na Figura 12 (A, B
e D) mostrarem apenas um pico após eluição, a eletroforese das amostras revelou a presença de
várias proteínas (Figura 13 A). A visualização de proteínas que não foram detectadas nos picos
pode ter ocorrido devido ao fato de que foram juntadas amostras dos conjuntos enzimáticos
contendo lacases de três eluições diferentes (1,5 mL cada), as quais foram concentradas em 0,5
mL para os fungos do gênero Marasmiellus e para o Peniophora sp. CBMAI 1063. Para o
fungo Peniophora cinerea CCIBt 2541 seis eluições de 1,5 mL das amostras contendo as
lacases foram concentradas para 0,5 mL (Figura 13 B). Além disso, o pouco volume aplicado
à coluna pode ter resultado em um pico estreito e bem resolvido. Lacases submetidas a troca
iônica utilizando coluna DEAE (Sepharose ou celulose) podem apresentar apenas um pico com
atividade, requerendo um outro passo para a separação das isoformas (PARK; PARK, 2014;
OBARA et al., 2005; MOREIRA; MILAGRES; MUSSATTO, 2014; BAGEWADI; MULLA;
NINNEKAR, 2017; AFREEN et al., 2017; PATEL et al., 2014).

Figura 13. Gel SDS-PAGE do perfil proteico dos fungos: (A) Marasmiellus sp. CBMAI 1062,
Peniophora sp. CBMAI 1063, Marasmiellus colocasiae CCIBt3388 e Peniophora cinerea CCIBt 2541,
das amostras: ultrafiltrada concentrada (U.C.) e troca iônica 3X concentrada (T.I.). (B) Gel SDS-PAGE:
amostras de Peniophora cinerea CCIBt 2541, 1 – ultrafiltrado, 2-troca iônica 6X concentrada.
kDa CBMAI 1062 CBMAI 1063 CCIBt3388 CCIBt 2541 kDa CCIBt 2541 kDa
A 250 U.C. T.I U.C. T.I. U.C. T.I. U.C. T.I.
B UC. T.I
250
150 B
150
100 250
75 100 150
100
75
50 75
50
37 50

25 37 37

25
25
20
15
20
10 20

Sabe-se que lacases se apresentam em diversas isoformas e tamanhos, e o fato de um

microrganismo produzir mais de uma isoforma foi reportado por diversos autores (BLAICH;
ESSER, 1975; BALDRIAN, 2006; GIARDINA et. al, 2010). O maior objetivo ao submeter um
caldo enzimático à purificação é a obtenção apenas das proteínas de interesse. Durante o
 44

processo de purificação o rendimento tende a diminuir, como apresentado na Tabela 2.

Considerando que o caldo bruto é composto por várias isoformas de lacases e que, em função
disto, apresenta maior atividade enzimática total (soma de todas as isoformas de lacases), pode-
se afirmar que este conjunto de diferentes lacases é mais atrativo para o uso industrial quando
comparado com apenas uma das enzimas puras (ZOUARI-MECHICHI et al, 2006; GARCIA,
2006; BRAZKOVA et al, 2016; RAMÍREZ-CAVAZOS, 2014; GOLVEIA, 2016).
Neste contexto, os caldos brutos ultrafiltrados dos fungos compostos por mais de uma
isoforma de lacase foram submetidos a apenas uma etapa cromatográfica, a fim de se obter o
maior número possível de isoformas secretadas. Com o objetivo de avaliar esta proposição, o
conjunto enzimático parcialmente purificado pela troca iônica foi testado em gel de
poliacrilamida, mediante a técnica de zimograma para lacases, utilizando dois substratos
(ABTS e SYG), os resultados estão apresentados da Figura 14 e revelaram atividade de duas
isoformas de lacases para o conjunto enzimático do Peniophora sp. CBMAI 1063, utilizando a
SYG e ABTS. O fungo terrestre P. cinerea CCIBt 2541 aparentemente apresentou cinco bandas
de atividades utilizando SYG, pois em ABTS as bandas reveladas não apresentavam condições
de distinção. De modo semelhante, a espécie marinha Marasmiellus sp. CBMAI 1062, em gel
de atividade, mostrou reação de duas isoformas na presença do ABTS e apenas uma na presença
de SYG, por outro lado, a espécie terrestre M. colocasiae CCIBt 3388 apresentou apenas uma
isoforma, em ambos os substratos, conforme atividade identificada no gel nativo de
poliacrilamida (Figura 14).

Figura 14 – Zimograma de lacases por atividades em SYG para as amostras do conjunto enzimático do
Peniophora sp. CBMAI 1063 (CBMAI 1063) e Peniophora cinerea CCIBt 2541 (CCIBt 2541);
atividade em ABTS para as amostras do conjunto enzimático do Marasmiellus sp. CBMAI 1062
(CBMAI 1062) e Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 (CCIBt 3388).

CBMAI CCIBt CBMAI CCIBt

1063 2541 1062 3388
 45

As lacases produzidas pelo basidiomiceto Peniophora sp. CBMAI 1063 nas mesmas
condições de cultivo do presente trabalho (otimizadas) foram investigadas por Otero et al.,
(2017) e os resultados revelaram a presença de oito genes putativos de lacases no transcriptoma
do fungo. Moreira, Milagres e Mussato (2014) purificaram oito isoformas de lacases do isolado
de P. cinerea (CCIBt 2541), todas com características distintas uma das outras, incluindo o
tamanho.
Portanto, a purificação enzimática foi de modo parcial uma vez que haviam outras
proteínas, sem atividade para lacases, que não se separaram das isoformas de interesse.
Considerando que as lacases não estão puras, a caracterização das enzimas ocorreu de modo
aparente (app.), utilizando amostras eluídas da cromatografia de troca iônica.

5.3 Caracterização aparente das lacases parcialmente purificadas

A caracterização do caldo bruto ou pool enzimático parcialmente purificado para lacases
tem sido reportada (KUMAR et al, 2016; KUMAR et al, 2012; STOILOVA; KRASTANOV;
STANCHEV, 2010; TAGGER et al, 1998), entretanto, a grande maioria caracteriza uma
isoforma, e quando há presença de mais de uma, comparam entre elas. Avaliações de lacases
geralmente mostram diferenças significativas quanto ao pH e temperatura ótima para um
mesmo substrato, ponto isoelétrico, estabilidade térmica, cinética enzimática, variam no grau
de glicolização, peso molecular, disposição dos íons de cobre no sitio ativo, canal que leva ao
agrupamento de cobre T2/T3, potencial de redução no sitio T1, aminoácidos, cristalografia e
sequência gênica (OTERO et al, 2017; MOREIRA-NETO, 2012; SHRADDHA et al., 2011;
MOROZOVA et al., 2007; SHLEEV et al, 2005; XU et al, 1996). Considerando todos estes
fatores, podemos inferir que as lacases são distintas, não apresentam isoenzimas iguais em
microrganismos diferentes, isto torna impreciso comparações de lacases entre espécies,
permitindo apenas analisar a eficiência em detrimento das características que apresentam.
Por conta disso, este trabalho se deteve em analisar as respostas dos conjuntos
enzimáticos das lacases quando submetidas à diferentes temperaturas e valores de pH, análises
da cinética enzimática, influência NaCl, íons e outros compostos. Para isso, os conjuntos
enzimáticos, obtidos após cultivo sob as mesmas condições, foram parcialmente purificados e
utilizados para caracterização a fim de investigar as vantagens, desvantagens e/ou
similaridades, dentro dos parâmetros anteriormente citados.
 46

5.3.1 Cinética enzimática aparente

A cinética enzimática permite entender o mecanismo das enzimas, oferecendo
condições para determinar a velocidade da reação e como ela se modifica em respostas às
mudanças impostas (NELSON; COX, 2014, p. 200-213). A caracterização aparente do
conjunto enzimático dos quatro fungos estudados revelou um KM semelhante a outras lacases,
para o mesmo substrato (Tabelas 3 e 4). Mesmo estando em conjunto com outras enzimas, de
acordo com estas análises comparativas, percebe-se que as demais enzimas presentes podem
não interferir na cinética das lacases, isto pode ser evidenciado quando analisamos a cinética
das lacases do P. cinerea CCIBt 2541 (Km 15,4 μM) com a isoforma pura caracterizada, por
Moreira, Milagres e Mussatto (2014), onde para o mesmo substrato, a isoforma mais abundante
apresentou Km de 15,6 μM, e demais isoformas também com valores próximo a este.

Tabela 3. Cinética enzimática aparente em reação com diferentes substratos

Fungo Substrato
ABTS Siringaldazina
KM app. Vmax app. KM app. Vmax app.
(μM) (μmol/min) (μM) (μmol/min)
Peniophora sp. CBMAI 1063 47,1 0,00017 5,6 0,000061
P. cinerea CCIBt 2541 15,4 0,00011 1,5 0,000038
Marasmiellus sp. CBMAI 1062 70,9 0,00025 1,5 0,000017
M. colocasiae CCIBt 3388 42,7 0,00017 0,9 0,000016
Trametes versicolor* 64,5* 0,00018* 13,9* 0,000016*
* Os valores cinéticos para T. versicolor não são aparentes, representam valores para a enzima pura.

Esta constante diz respeito da concentração do substrato na qual a reação acontece na

metade da velocidade máxima e pode significar uma maior afinidade da enzima pelo substrato,
o que viabiliza o cálculo da concentração do substrato necessário, em determinado tempo, para
saturar todos os sítios ativos da enzima (WILSON; WALKER, 2010, p. 585). Os basidiomicetos
terrestres (P. cinerea CCIBt 2541 e M. colocasiae CCIBt 3388) apresentaram menor KM em
comparação com as espécies de origem marinha (Peniphora sp. CBMAI 1063 e Marasmiellus
sp. CBMAI 1062), conforme demonstrado na Tabela 3.
Em cinética enzimática a velocidade máxima (Vmax) diz respeito à velocidade inicial
quando todos os sítios ativos da enzima estão ocupados, ou seja, quase todas as enzimas estão
no complexo enzima-substrato (ES) (WILSON; WALKER, 2010, p. 584-585). Os resultados
de Vmax demonstraram que as lacases da espécie terrestre do gênero Penhiophora mais
rapidamente se satura na presença do ABTS e SYG. O mesmo ocorre para as lacases dos fungos
 47

do gênero Marasmiellus, a espécie terrestre apresenta menor valor de Vmax, embora o valor da
Vmax em reação com o ABTS sejam praticamente iguais para ambos fungos deste gênero.
Poucos trabalhos relatam a Vmax para as enzimas. Dentre os trabalhos listados na Tabela 4,
apenas o reportado por Stoilova, Krastanov e Stranchev (2010) e Garcia (2006) apresentam esse
dado, sendo que o primeiro assinala um valor, porém não há como se identificar a unidade
utilizada para mensurar, e o segundo aponta 238,4 μmol.min-1 para a Lac 2, uma das isoformas
purificadas.

Tabela 4. Constante de Michaelis-Menten de lacases em diferentes basidiomicetos utilizando ABTS

como substrato.
Fonte de Lacases KM (μM) Referência
ABTS SYG
46,0 14,8 STOILOVA; KRASTANOV;
Trametes versicolor
104,7 17,4 STANCHEV,, 2010
Trametes orientales 333,0 - ZHENG et al, 2017
Pleurotus ostreatus 13,0 5,1 KUMAR et al, 2012
Pleurotos ostreatus 46.510,0 - PATEL et al, 2014
6,0 RAMÍREZ-CAVAZOS et al,
Pycnoporus sanguineus -
12,0 2014
Pycnoporus sanguineus 58,0 8,3 GARCIA, 2006
12,7
MOREIRA; MILAGRES;
Peniophora cinerea 20,0 -
MUSSATO, 2014
15,6

Os valores cinéticos da lacase comercial de T. versicolor são similares aos dos conjuntos
enzimáticos estudados, sendo que os valores cinéticos de KM em SYG são maiores que os dos
demais fungos e o KM superior às lacases dos fungos do gênero Peniophora e M. colocasiae
CCIBt 3388 em reação com o ABTS, conforme Tabela 3. Com exceção de Stoilova, Krastanov
e Stranchev (2010) tabela 4, o Vmax diz respeito apenas a uma isoforma purificada, corroborando
com a hipótese de que a presença de outras enzimas no conjunto enzimático das lacases podem
não interferir na cinética da enzima sobre determinado substrato.

5.3.2 Temperatura e pH ótimos

A temperatura e pH ótimos de atividades para as lacases das espécies marinha e terrestre
do gênero Peniophora foram iguais: 55°C e pH 4 para ABTS e 5,5 para SYG. Isoenzimas de
lacases destas espécie já foram caracterizadas, e assim como demonstrado por Mainardi e
colaboradores (2017) para a principal lacase do Peniophora sp. CBMAI 1063, acima de 60 °C
 48

a proteínas começa a perder a estabilidade, apresentando baixa atividade e perdendo-a

totalmente a 70 °C (Figura 15 A, B e E). Estes pesquisadores determinaram o pH 5 como ótimo
para esta isoenzima, tendo SYG como substrato, entretanto, o testes por eles realizados
utilizaram a variação de 1,0 no valor da grandeza do pH, enquanto que o presente trabalho
realizou a cada 0,5.
É de comum entendimento que os valores de pH ótimos variam conforme o substrato,
disponibilidade de oxigênio e tampão (DESAI; NITYANAND, 2011; TAGGER et al, 1998).
Moreira-Neto (2012) caracterizou oito isoformas de lacases do fungo P. cinerea usando ABTS
como substrato. Apenas duas isoformas apresentaram pH igual a 2,6 e a principal enzima
apresentou pH 4. Para os fungos do gênero Marasmiellus de origem marinha e terrestre, o pH
ótimo foi 5 (ABTS) e 6,5 (SYG), respectivamente. Contudo, a temperatura ótima para a espécie
terrestre foi de 50 °C, enquanto que para a espécie marinha foi de 55 °C (Figura 15 C, D e F).
Os valores de pH e temperatura estão dentro dos valores reportados para lacases fúngicas,
atividades enzimáticas em pH ácidos e temperatura entre 50-70 °C (ZHENG et al., 2017).
Embora haja determinação da temperatura e pH ótimo para lacases e enzimas de modo
geral, nem sempre os valores encontrados são aplicados no ambiente alvo. Isto pode ocorrer
por causa de fatores, tais como: o pH ser variável conforme o substrato, temperatura na qual
permita estabilidade para a enzima, dentre outras variáveis como condições não manipuláveis
do ambiente alvo. A maioria dos trabalhos procura aplicar lacases em condições de pH variando
entre 3,5-5,5 e temperatura aproximadamente de 30-40 °C (YANG et al., 2014; KUMAR et al.,
2012; RAMIREZ-CAVAZOS et al., 2014; MANAVALAN et al., 2013; ZHENG et al., 2017).
Há estudos que aplicam a enzima nas condições ótimas encontradas, contudo, isso vai depender
da estabilidade da mesma (AFREEN et al., 2017; KUMARI; KISHOR; GUPTASARMA,
2018).
 49

Figura 15. Caracterização do pH ótimo aparente das lacases dos fungos marinhos e terrestres do gênero:
(A) Peniophora para ABTS, (B) Peniophora para SYG, (C) Marasmiellus para ABTS, (D)
Marasmiellus para SYG; e temperatura ótima aparente das lacases dos fungos marinhos e terrestre do
gênero: (E) Peniophora, (F)Marasmiellus.
pH ótimo Peniophora ABTS pH ótimo Peniophora SYG
A B
120
140
100 120
Atividade relativa %

80 100

Atividade relativa %
60 80

60
40
40
20
20
0
0

3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 4,5 5 5,5 6 6,5 7

pH pH
Peniophora sp. CBMAI 1063 Peniophora sp. CBMAI 1063
Peniophora cinerea CCIBt 2541 Peniophora cinerea CCIBt 2541

pH ótimo Marasmiellus ABTS pH ótimo Marasmiellus SYG

C D
120 120

100 100
Atividade relativa %

Atividade relativa %

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8

pH pH
Marasmiellus sp. CBMAI 1062 Marasmiellus sp. CBMAI 1062
Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388

Temperatura ótima Peniophora Temperatura ótima Marasmiellus

E F
120 120

100 100
Atividade relativa %
Atividade relativa %

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0

30 35 40 45 50 55 60 65 70 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Temperatura ºC Temperatura
Peniophora sp. CBMAI 1063 Marasmiellus sp. CBMAI 1062
Peniophora cinerea CCIBt 2541 Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388
 50

5.3.3 Estabilidade Térmica

As lacases dos basidiomicetos do gênero Marasmiellus apresentaram tolerância maior
à temperatura, em relação às lacases dos fungos do gênero Peniophora. Aos 75 °C ambos
conjuntos enzimáticos apresentaram atividade, sendo a do fungo terrestre 8,5% em relação à
própria temperatura ótima (Figura 15 F).
A estabilidade térmica dos conjuntos enzimático em análises nas temperaturas ótimas
mostraram auemnto da atividade enzimática após uma hora para os fungos Peniophora, sendo
que P. cinerea CCIBt 2541 alcançou 132%, enquanto que o Peniophora sp. CBMAI 1063
chegou a 114%. Entretanto, após o período de 24 hs a espécie marinha apresentou
aproximadamente 20% da atividade residual, enquanto que para o exemplar terrestre este valor
foi de 10% (Figura 16 A). O mesmo ocorreu para os fungos do gênero Marasmiellus. O
exemplar terrestre M. colocasiae CCIBt 3388 mostrou aumento da atividade, chegando a 121%
após uma hora, e atividade residual de 10% após 24 hs. Para as lacases do Marasmiellus sp.
CBMAI 1062 de origem marinha, o período de um hora é o período da meia vida da atividade
de suas lacases, 50% da atividade foi observada neste tempo e após 24 horas, apresentou apenas
3% da atividade residual (Figura 16 B).

Figura 16 – Estabilidade dos conjuntos enzimáticos de lacases para os fungos (A) Peniophora e (B)
Marasmiellus em temperatura ótima, utilizando ABTS como substrato.

A Estabilidade térmica Peniophora B Estabilidade térmica

140
Marasmiellus
140
Atividade relativa %

Atividade relativa %

120 120
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
-1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 -1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Tempo (horas) Tempo (horas)

Peniophora sp. CBMAI 1063 (55 °C) Marasmiellus sp. CBMAI 1062 (55 °C)
Peniophora cinerea CCIBt 2541 (55 °C) Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 (50 °C)

A estabilidade térmica das lacases está atrelada a vários fatores, tais como: ligações de
hidrogênio e interações hidrofóbicas na estrutura química da molécula, quanto maiores esses
fatores, mais estável será a enzima; resíduos carregados positivamente também confere maior
resistência, bem como o empacotamento da enzima, quanto maior a densidade, maior a
 51

resistência, a presença da prolina também parece dar resistência térmica e um dos fatores mais
influenciável é a porção glicosídica das lacases, quanto maior a porcentagem de carboidratos,
mais estável é a enzima (CLAUS, 2004; ENGUITA et al., 2003).

5.3.4 Efeito de íons, de um aminoácido e um agente quelante sobre a atividades de

lacases
Em todos os conjuntos enzimáticos, não foi observada a atividade em presença de EDTA
e L-cisteina (Figura 17). Este efeito era esperado, uma vez que o EDTA é um agente quelante,
age quelando íons metálicos. Nas amostras de lacases, ele sequestra os íons cobres, o qual é
essencial para a reação enzimática, impedindo a ocorrência da reação, evidenciando assim, que
elas são metaloenzimas e que o Cu2+ é necessário para a reação (GAUR; NARASIMHULU;
PYDISETTY, 2018; FANG et al., 2012). A L-cisteína é um inibidor típico de moléculas de
fenóis oxidases ou semelhantes, é um agente redutor, ocasiona a redução do substrato oxidado
pelas lacases, esta inibição é previsível e evidencia a presença do aminoácido cisteína,
mostrando ser ele essencial no sitio ativo das lacases, isto é inerente a qualquer tipo de lacase
(SHIN e LEE, 2000; GOLVEIA et al., 2016).
Metais pesados são contaminantes comuns dispersos no ambiente. Eles podem afetar a
produção, ação e/ou estabilidade de enzimas, por conta disso, a necessidade de estudá-los a fim
de inferir sobre a habilidade das lacases em suportar a presença deles na forma de íons (ZHENG
et al., 2017). O conjunto enzimático do P. cinerea CCIBt 2541 apresentou melhores resultados
quanto à exposição aos íons estudados, em comparação com o conjunto do Peniophora sp.
CBMAI 1063, houve ativação da atividade para os íons Zn2+ (148%), Mg2+ (145%) e Ca2+ (110
%), estes íons também não causaram inibição expressiva ao conjunto enzimático do Peniophora
sp. CBMAI 1063, sendo atividade verificada em presença dos íons Zn2+ de 93%, Mg2+ de 89%
e Ca2+ de 61%, conforme demonstrado na Figura 17 A. Estes valores são distintos para os
reportados por Christhopher, Yao e Ji, (2014) que afirmam que os íons Zn2+, Mg2+, Ca2+, inibem
a atividade de lacase. Porém, Kumar et al., 2018 também observou o efeito de enriquecimento
da atividade de lacases de Pandoraea sp. ISTKB pelo íon Mg2+ e os mesmos relacionam outros
trabalhos com resultados similares. Chatha, Asgher e Iqbal, (2017) também reporta inibição do
Zn2+ sobre a atividade de lacases e ativação da atividade por Mn2+ e Cu2+, diferentemente do
observado para o conjunto enzimático dos fungos Peniophora.
 52

Figura 17 – Efeito de íons metálicos, agente quelante (EDTA) e do aminoácido (L-cisteína) sobre a
atividade enzimática dos conjuntos de lacases dos fungos do gênero em estudo: (A) Peniophora e (B)
Marasmiellus.

A Ação de íons na atividade de lacases de

Peniophora
160
Atividade Relativa (%)

140
120
100
80
60
40
20
0

Peniophora sp. CBMAI 1063 Peniophora cinerea CCIBt 2541

B Ação de íons na atividade de lacases de

Marasmiellus
160
140
120
Atividade %

100
80
60
40
20
0

Marasmiellus sp. CBMAI 1062 Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388

Análises do conjunto enzimático dos fungos do gênero Marasmiellus revelaram que

para a espécie terrestre M. colocasiase CCIBt 3388 parece seguir as observações apontadas
anteriormente pelos autores, no que diz respeito à inibição das lacases pelos íons Zn2+, Mg2+ e
Ca2+. Por outro lado, para as lacases desse isolado o Mn2+ aumentou a atividade, alcançando
117% de atividade relativa. As lacases da espécie marinha apresentou estabilidade maior frente
a todos os íons testados. Na concentração de 10 mM a atividade relativa ficou em torno dos
90%, havendo aumento da atividade na presença do Al3+ (126%). Ambos conjuntos enzimático
das espécies do gênero Marasmiellus são significativamente diminuídas pelos íons Ca2+
Marasmiellus sp. CBMAI 1062 (46%) e M. colocasiae CCIBt 3388 (44%) (Figura 17 B).
 53

Conforme demonstrado na Figura 17, houve forte inibição pelo íons Fe2+ para ambos conjuntos
enzimáticos dos fungos Peniophora e pouco efeito negativo sobre o conjunto enzimático dos
Marasmiellus. A ação de íons metálicos sobre a atividade de lacases varia para isoformas de
lacases, não podendo ser postulada uma regra de ação (DURAN et al., 2002; NILADEVI;
JACOB; PREMA, 2008; YOUNES; SAYADI, 2011; YANG et al., 2014; JAFARI et al., 2017)

5.3.5 Efeito do NaCl nas lacases

A água do mar tem cerca de 510 mM de NaCl, sal que representa 85% dos sais presente
no mar (CASTRO; HUBER, 2008, p.44). Devido ao fato dos fungos Peniophora sp. CBMAI
1063 e Marasmiellus sp. CBMAI 1062 serem de origem marinha, partimos da hipótese de que
as lacases produzidas pelos mesmos seriam mais resistentes à salinidade. Dessa forma, os
fungos de origem marinha foram cultivados em água do mar artificial, a fim de mimetizar o
ambiente natural destes microrganismos.
Todos os conjuntos enzimáticos analisados mostraram semelhança no perfil de
tolerância à salinidade (Figura 18). Além disso, em comparação com a atividade inicial,
utilizando 0,0015 U/mL de lacases dos fungos do presente estudo, a atividade enzimática ficou
abaixo de 20% na molaridade da água marinha (510 mM). A concentração enzimática pode ser
um fator influente, pois de acordo com Moreira-Neto (2012) a análise da resistência de 0,5
U/mL de lacases do P. cinerea ao NaCl comparada com duas lacases comerciais, revelou que
47% de atividade se mantinha a 1000 mM, frente a 16 e 25% das lacases comerciais.
Percebe-se que a enzima tem maior preferência para agir em meio sem sal, pois na
concentração de 10 mM já há queda da atividade enzimática de todos os conjuntos enzimáticos
analisados (Figura 18). Dentre os conjuntos enzimáticos dos fungos Peniophora estudados, a
concentração de NaCl na qual 50% da atividade inicial é observada (I50), foi melhor para o P.
cinerea CCIBt 2541 (I50 entre 50 a 100 mM). As lacases desse fungo também apresentaram
melhores resultados de resistência com o aumento da concentração do sal (Figura 18 A). As
lacases do Peniophora sp. CBMAI 1063 apresentaram I50 entre as concentrações de 10-50 mM,
conforme demonstrado na Figura 18 A. De igual forma, nesta faixa de concentração estão os
I50 dos conjuntos enzimáticos dos fungos do gênero Marasmiellus. A 1000 mM as lacases do
fungo marinho Marasmiellus sp. CBMAI 1062, apresentou 14% de atividade em relação à
inicial, apresentando maior atividade em comparação ao homólogo terrestre e aos fungos do
gênero Peniophora. As lacases deste fungo também apresentaram menor variação de atividade
entre as concentrações de 600 – 1000 mM (apenas 1%), conforme demonstrado na Figura 18
B.
 54

Figura 18. Efeito das concentrações de NaCl na atividade dos conjuntos enzimático de lacases: (A)
fungos marinho e terrestre Peniophora sp. CBMAI 1063 e Peniophora cinerea CCIBt 2541, (B) Fungos
marinho e terrestre Marasmiellus sp. CBMAI 1063 e Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 e (C) lacase
comercial pura do fungo terrestre Trametes versicolor.

A Efeito de NaCl em Lacases de Peniophora

120
atividade relativa %

100
80
60
40
20
0
0 10 50 100 150 200 600 1000
NaCl (mM)

Peniophora sp. CBMAI 1063 Peniophora cinerea CCIBt 2541

B Efeito do NaCl em Lacases de Marasmiellus

120
Atividade relativa %

100
80
60
40
20
0
0 10 50 100 150 200 600 1000
NaCl (mM)

Marasmiellus sp. CBMAI 1062 Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388

C Efeito do NaCl em lacase de Trametes versicolor

120
100
Atividade Relativa

80
60
40
20
0
0 10 50 100 150 200 600 1000
Concentração de NaCl (mM)
 55

A fim de comparar o efeito do NaCl sobre as lacases estudadas, a enzima comercial pura
de Trametes versicolor, um fungo de origem terrestre, foi testada e mostrou pouca tolerância à
salinidade (Figura 18 C). Em 50 mM apenas 23% da atividade foi observada, isso mostra
considerável sensibilidade dessa enzima ao sal, apresentando um comportamento semelhante
às lacases do fungo M. colocasiae CCIBt 3388. Este resultado revela que os conjuntos
enzimáticos dos fungos analisados apresentam maior tolerância ao sal do que a lacase de T.
versicolor comercialmente utilizada.
A diminuição da atividade de lacases pelo NaCl, bem como, o fato da atividade entre
100 e 1000 mM não decrescer de forma proporcional ao aumento da concentração salina (Figura
8), pode ser explicado pelo fato dos Cl- causarem perturbação no fluxo da transferência de
elétrons obtidos do substrato. Pois, por serem altamente eletronegativos os íons Cl- se ligam aos
aminoácidos positivamente carregados, responsáveis pela transferência dos elétrons
provenientes do sítio T1 para o T2/T3. Além disso, aparentemente lacases possuem um
diâmetro definido neste percurso, e isto varia entre as isoenzimas, fazendo com que o aumento
da concentração de sal gere saturação neste canal, tornando desproporcional a relação entre
concentração de sal e a diminuição da atividade (XU, 1996; MOREIRA; MILAGRES;
MUSSATTO, 2014; SHLEEV et al, 2005; CHRISTOPHER et al., 2014).
Cabe destacar que em estudo prévio do nosso grupo de pesquisa foi constatado que o
fungo de origem marinha Peniophora sp. CBMAI 1063 produz quantidades significativas de
lacases apenas na presença de salinidade (ASW) e CuSO4, revelando a sua adaptação ao
ambiente marinho (MAINRADI et al., 2017). Em adição, experimentos realizados pelo nosso
grupo de pesquisa mostraram que, embora o fungo de origem terrestre P. cinerea CCIBt 2541
cresça em salinidade, ele não tolera a adição do CuSO4. Além disso, o fungo M. colocasiae não
apresentou crescimento em condições salinas. Estes resultados evidenciam a importância dos
fungos de origem marinha em processos salinos.

5.4 Descoloração e destoxificação do corante têxtil marinho reativo

O corante têxtil marinho reativo BF-V 130% (MR) (Figura 19) foi fornecido pela
empresa Texpal Química Ltda (produto 03.53.129) e sua degradação foi testada para os
conjunto enzimático de lacases dos fungos P. cinerea CCIBt 2541, Peniophora sp. CBMAI
1063, M. colocasiae CCIBt 3388 e da lacase comercial pura de Trametes versicolor. Por não
haver volume enzimático suficiente de lacases produzidas pelo fungo Marasmiellus sp. CBMAI
1062, estas não foram testadas quanto ao potencial de descoloração do corante MR.
 56

Figura 19 – Estrutura química associada do corante têxtil marinho reativo (Fonte: SIGMA-ALDRICH).

A descoloração do corante têxtil MR após tratamento com o conjunto enzimático dos

fungos em estudo mostraram, após 7 dias de cultivo, descoloração acima de 60% pela ação das
lacases dos fungos do gênero Peniophora, com melhor ação para descoloração pelas enzimas
do P. cinerea CCIBt 2541 (67%), enquanto que as do Peniophora sp. CBMAI 1063 descoloriu
61% (Figura 20). As lacases do representante terrestre M. colocasiae CCIBt 3388 apresentaram
apenas 27% de descoloração após 7 dias de incubação. A lacase comercial pura do T. versicolor
apresentou resultado de descoloração de 66%, similar aos resultados observados para os fungos
do gênero Peniophora (Figura 20). Analises estatística, pelo teste de Tukey (p<0,05), mostram
não haver diferença significativa entre o processo de descoloração do corante MR pelo conjunto
enzimático dos fungos do gênero Peniophora e da amostra comercial T. versicolor, utilizada
como parâmetro de comparação, (referências A do gráfico). Entretanto, as amostras do M.
colocasiae CCIBt 3388 apresenta diferença para este parâmetro estatístico (referências B do
gráfico), evidenciando que as lacases deste fungo, agem de maneira distinta das demais no
processo de descoloração do corante MR.

Não há relatos na literatura do tratamento deste corante por outras lacases, mas o fato
das lacases em conjunto com outras enzimas mostrarem eficiência na descoloração de corantes
têxtil, tal qual a enzima pura, evidencia o potencial das lacases para agir sobre determinado
substrato, mesmo estando em conjunto com outras proteínas. No processo de descoloração, o
corante em estudo de cor azul e muda para uma coloração próxima ao rosa e então vai se
tornando, conforme o decorrer do tempo, cada vez mais transparente. Bonugli-Santos et al.,
(2016) em estudo de descoloração do corante Preto Reativo 5 (PR5) pelo fungo Peniophora sp.
CBMAI 1063 identificaram um processo semelhante ao visualizado no presente trabalho para
o corante MR. Nas primeiras 24 hs de cultivo do fungo Peniophora sp. CBMAI 1063 em
solução contendo o corante PR5 o meio extracelular apresentou coloração roxa, a qual com o
 57

tempo foi decrescendo até o momento da descoloração. Os autores atribuíram a alteração da

cor nas primeiras 24 hs à alta ação oxidativa, ocasionando a redução das ligações azo, porém,
permanecendo ainda intermediários da reação. Logo após este período houve a descoloração
por conta da redução destes intermediários. Entretanto, os autores sugerem que este processo
ocorreu devido à ação de MnP. Porém, no presente estudo não foi identificado nenhuma outra
enzima ligninolítica além de lacases e o teste com resultado semelhante (Figura 20), usando
lacase comercial pura de Trametes versicolor, fortalece a proposição da ação somente das
lacases no processo de descoloração do MR.

Figura 20 – Descoloração do corante têxtil marinho reativo pelo conjunto enzimático de lacases dos
fungos marinho e terrestre do gênero Peniophora, do fungo terrestre Marasmiellus colocasiae CCIBt
3388 e da lacase pura comercial de Trametes versicolor.

Descoloração do corante marinho reativo por lacases

80 A A
70 A

60
Descoloração %

50

40
B
30

20

10

0
Trametes versicolor Peniophora sp. CBMAI Peniophora cinerea Marasmiellus
1063 CCIBt 2541 colocasiae CCIBt 3388

Dos fungos analisados, apenas o M. colocasiae CCIBt 3388 não apresenta registro de
descoloração de corantes têxteis em literatura, quer seja por ação de suas enzimas, ou do fungo
diretamente aplicado. Fungos do gênero Peniophora apresentaram resultados relevantes quanto
a descoloração de corantes têxteis. O Peniophora sp. CBMAI 1063, em estudos conduzidos por
Bonugli-Santos et al., (2016) mostraram eficiência na degradação do corante preto reativo 5
(reactive black 5), com taxa de descoloração de 94% em sete dias. Estudos realizados por
Moreira, Milagres e Mussato (2014), mostraram que lacases do P. cinerea foram capazes de
descolorir até 77% o corante têxtil azul reativo 19 (reactive blue 19) em 3 dias, utilizando 1
U/mL de lacases, em reação contendo tampão e mediadores redox.
 58

Embora o tempo de sete dias seja longo para o tratamento do corante, a dosagem da
enzima parcialmente purificada usada na reação de descoloração, foi baixa (0,2 U/mL), quando
comparada à outros trabalhos (LIU., et al., 2015; YAMAK et al., 2008; WANG et al., 2010;
ZHENG et al., 2017; FANG et al., 2012). Além disso, as reações ocorreram na ausência de
tampão e de forma livre, enquanto que muitos trabalhos aplicam a enzima de forma imobilizada,
e também não se usou mediador redox, que geralmente proporciona maior eficiência na
descoloração (FERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ; SANROMAN; MOLDES, 2012; ZOUARI-
MECHICH et al., 2006; BIBI; BHATTI, 2012; MOREIRA; MILAGRES; MUSSATTO, 2014).
Lacases de T. versicolor apresentaram 66% de descoloração do corante laranja ácido 52 (Acid
Orange 52) em 6 h, porém foi utilizado 11,4 U/mL da enzima de forma imobilizada na presença
de tampão (YAMAK et al., 2008). A lacase comercial de T. versicolor na ausência de
mediadores não foi capaz de descolorir o corante preto reativo 5 (reactive black 5),
concentração da enzima não especificada (BIBI; BHATTI, 2012). No que diz respeito à pureza
das lacases em aplicação de descoloração de corantes têxtis, isoformas puras não têm
demonstrado bons desempenhos quando comparadas com o caldo bruto, contendo outras
enzimas (ZOUARI-MECHICH et al., 2006).
Testes de toxicidade aguda realizados pelo Microtox 500, revelaram aumento da
toxicidade, com base no EC50 (concentração que inibe em 50% a luminescência da bactéria
Aliivibrio ficheri), na descoloração do corante marinho reativo pelo conjunto enzimático do
fungo Peniophora sp. CBMAI 1063, apresentando nível muito tóxico (EC50 = 3,39%),
conforme demonstrado na Tabela 5

Tabela 5. Concentração efetiva (EC50 ) de A. fischeri, após 15 min de exposição do conjunto enzimático
das lacases com o corante marinho reativo (40 mg L-1).

Peniophora sp P. cinerea M. colocasiae

CBMAI 1063 CCIBt 2541 CCIBt 3388 T. versicolor
Controle
negativo (%) 10,37 19,54 26,66 9,04

𝐄𝐂𝟓𝟎 (%)
3,39 20,01 12,38 9,34
Desvio padrão ± 0,78 ± 2,7 ±2,96 ±0,34

Por outro lado, os ensaios do conjunto enzimático do P. cinerea CCIBt 2541 (o que
apresentou maior descoloração) levando em consideração o desvio, não apresentou maior
toxicidade após o tratamento, exibindo a mesma taxa de antes do tratamento, porém, sendo
ainda considerado muito tóxico (EC50 = 20,01%) (Tabela 5). O M. colocasiae CCIBt 3388
 59

também mostrou-se mais tóxico após o tratamento, tomando o controle negativo como
parâmetro de comparação, com EC50 de 12,38%. A lacase pura do T. versicolor também não
apresentou destoxificação, sendo o EC50 da amostra (9,34) praticamente igual ao controle
(9,04), isto reafirma que o conjunto enzimático em comparação com uma enzima pura pode não
apresentar diferença neste tipo de aplicação biotecnológica.
Estudos têm revelado que nem sempre é possível destoxificar uma amostra de corante
ou até mesmo efluente apesar de haver a descoloração, devido a fatores como a composição do
corante ou a sensibilidade do microrganismo teste a solução proteica (PEREIRA et al., 2009;
FORGACS; CSERHÁTI; OROS, 2004). Champagne e Ramsay (2010) mostraram que lacases
de T. versicolor imobilizadas e livres descoloriram os corantes índigo e antraquinona, tendo
significância na descoloração do primeiro, porém, não havendo destoxificação no segundo.
Resultados negativos para destoxificação são poucos relatados, por haver poucos estudos
testando essa variável. Khlifi e colaborades (2010) relataram que o caldo bruto de Trametes
trogii aplicados em efluentes de corantes têxteis, apresentou descoloração apenas na presença
de mediadores, não sendo capaz de destoxificar o efluente em diferentes concentrações. Além
disso, a ação das enzimas sobre o composto alvo, pode quebrá-lo, gerando produtos ainda mais
tóxicos do que a própria molécula do poluente inicial (CATHERINE; FRÉDÉRIC;
PENNINCKX, 2016; CHHABRA; MISHRA; RAMASWAMY, 2015).

6. CONCLUSÕES
O meio de cultivo otimizado por Sette e colaboradores (2014) para produção de lacases
mostrou-se adequado para os quatros fungos analisados, com ausência de salinidade para os
fungos de origem terrestre. A purificação de modo parcial com caracterização de modo aparente
(app.), foi realizada apenas levando em conta a cromatografia de troca iônica.
O estudo comparativo das lacases parcialmente purificadas, mostrou que o conjunto
enzimático de lacases da espécie terrestre P. cinerea CCIBt 2541, apresentou melhor resultado
que o do marinho Peniophora sp. CBMAI 1063. P. cinerea CCIBt 2541 apresentou mais
isoformas de lacases, um menor Km, as lacases foram mais resistentes à influência do NaCl,
apresentaram ativação pelos íons Zn2+, Mg2+ e Ca2 e melhor descoloração e destoxificação do
corante têxtil marinho reativo. Quanto aos conjuntos parcialmente purificados das lacases dos
fungos do gênero Marasmiellus, as lacases do fungo de origem marinha Marasmiellus sp.
CBMAI 1062 apresentaram melhor eficiência ante o efeito do NaCl e aos íons metálicos, sendo
a atividade enzimática ativadas pelos íons Zn2+e Al3+. M. colocasiae CCIBt 3388 apresentou
 60

maior Km para ambos os substratos. Entretanto, os fungos de origem terrestre P. cinerea CCIBt
2541 e M. colocasiae CCIBt 3388 não se desenvolveram no meio salino, nas condições
estudadas, o que indica a inviabilização da aplicação dos mesmos em processos ou ambientes
salinos.
De modo geral, as características cinéticas dos fungos analisados são muito semelhantes
entre si para o mesmo gênero, principalmente para os fungos Peniophora, pois apresentaram
pH ótimo e temperatura ótima iguais, produção de lacases e mesmo padrão de atividade em
respostas ante influências dos íons e agentes testados, bem como descoloração do corante têxtil.
Os fungos Marasmiellus, de similaridade apresentaram apenas o mesmo pH ótimo para ambos
os substratos testados.
Por conta do conjunto enzimático parcialmente purificados de todos os fungos analisados
não apresentarem atividades para as enzimas ligninolitica MnP e LiP, acredita-se que apenas as
enzimas lacases agiram no processo de descoloração do corante marinho reativo.
Os resultados do presente trabalho contribuíram para o conhecimento de laccases de
basidiomicetos de origem marinha e abrem novas perspectivas para o estudo das lacases de
origem marinha e terrestre, incluindo a caracterização molecular das mesmas, a avaliação do
potencial de oxidação e aplicações biotecnológicas.

7. REFERÊNCIAS
AFREEN, S.; SHAMSI, T. N.; BAIG, M. A.; AHMAD, N.; FATIMA, S.; QURESHI, M. I.;
HASSAN, I.; FATMA, T. A novel multicopper oxidase (laccase) from cyanobacteria:
Purification, characterization with potential in the decolorization of anthraquinonic dye. PloS
one, v. 12, n. 4, p. e0175144, 2017.

ARACAGÖK, Y. D.; CİHANGİR, N. Decolorization of Reactive Black 5 by Yarrowia

lipolytica NBRC 1658. American Journal of Microbiological Research, v.1, n.2, p. 16-20,
2013.

ARORA, D. S.; GILL, P. K. Comparison of two assay procedures for lignin peroxidase.
Enzyme and Microbial Technology, v. 28, n. 7–8, p. 602–605, 7 maio 2001.

BAGEWADI, Z. K.; MULLA, S. I.; NINNEKAR, H. Z. Purification and immobilization of

laccase from Trichoderma harzianum strain HZN10 and its application in dye decolorization.
Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, v. 15, n. 1, p. 139-150, 2017.
 61

BALDRIAN, P. Fungal laccases-occurrence and properties. FEMS Microbiology Reviews,

Amsterdam, v.30, n. 2, p. 215-242, 2006.

BAO, W.; O'MALLEY, D. M.; WHETTEN, R.; SEDEROFF, R. R. A laccase associated with
lignification in loblolly pine xylem. Science, v. 260, n. 5108, p. 672-674, 1993.

BENKHAYA, S.; HARFI, S.; HARFI, A. Classifications, properties and applications of textile
dyes: a review. Applied Journal of Environmental Engineering Science, v. 3, n. 3, p. 311-
320, 2017.

BIBI, I.; BHATTI, H. N. Biodecolorization of Reactive Black 5 by laccase mediator

system. African Journal of Biotechnology, v. 11, n. 29, 2012.

BLAICH, R.; ESSER, K. Function of enzymes in wood destroying fungi - II. Multiple forms
of laccase in white rot fungi. Archives of Microbiology, Berlin, v. 103, s.n, p. 271-277, 1975.

BONUGLI-SANTOS, R. C.; DURRANT, L. R.; DA SILVA, M.; SETTE, L. D. Laccase

activity and putative laccase genes in marine-derived basidiomycetes. Fungal Biology,
Amsterdam, v. 114, n. 10, p. 863-872, 2010a.

BONUGLI-SANTOS, R. C.; DURRANT, L. R.; DA SILVA, M.; SETTE, L. D. Production of

laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase by Brazilian marine-derived
fungi. Enzyme and Microbial Technology, v. 46, n. 1, p. 32-37, 2010b.

BONUGLI-SANTOS, R. C.; VIEIRA, G. A. L.; COLLINS, C.; FERNANDES, T. C. C.;

MARIN-MORALES, M. A.; MURRAY, P.; SETTE, L. D. Enhanced textile dye decolorization
by marine-derived basidiomycete Peniophora sp. CBMAI 1063 using integrated statistical
design. Environmental Science and Pollution Research, Landsberg, v. 23, n. 9, p. 8659-8668,
2016.

BONUGLI-SANTOS, R.C.; DURRANT, L. R.; SETTE, L. D. The production of ligninolytic

enzymes by marine-derived basidiomycetes and their biotechnological potential in the
biodegradation of recalcitrant pollutants and the treatment of textile effluents. Water Air and
Soil Pollution, Dordretch, v. 223, n. 5, p. 2333-2345, 2012.

BONUGLI-SANTOS, R.C.; VASCONCELOS, M. R. D.; PASSARINI, M. R. Z.; VIEIRA, G.;

LOPES, V. C. P.; MAINARDI, P. H.; DOS SANTOS, J. A.; DUARTE, L. D.; OTERO, I. V.
R.; YOSHIDA, A. M. D.; FEITOSA, V.A.; PESSOA, A.; SETTE, L. D. Marine-derived fungi:
Diversity of enzymes and biotechnological applications. Frontiers in Microbiology,
Lausanne, v. 6, n. 269, p. 1-15, 2015.
 62

BRADFORD, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram

Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry,
New Delhi, v.72, n. 1, p.248-254, 1976.

BRAZKOVA, M.; MERCATI, A.; HRISTOVA, I; LANTE, A.; KRASTANOV, A. Isolation,

Purification and Characterization of Laccase from the White-rot Fungus Trametes Versicolor.
Scientific Works of University of Food Technologies, Washington, v. 63, n. 1, 2016.

BULICH, A. A. A practical and reliable method for monitoring the toxicity of aquatic samples.
Process Biochemistry, v. 17, n. 2, p. 45–47, 1992.

BUSWELL, J. K.; CAI, Y. J.; CHANG, S. T.; Effect of nutrient nitrogen and manganese on
manganese peroxidase and laccase production by Lentinula (Lentinus) edodes. FEMS
Microbiology Letters, Nova Iorque, v. 128, n. 1, p. 81-88, 1995.

CAPELARI, M; ANTONÍN, V; ASAI, T; COSTA, H; VENTURA, J. A. A new pathogenic

species of Marasmiellus from Brazil. Cryptogamie, Mycologie, v. 31, n. 2, p. 137-142, 2010.

CASTRO, P.; HUBER, M. E. Marine Biology. 7. ed. Nova Iorque: MicGraw-Hill , 2008.

CATHERINE, H., FRÉDÉRIC, D., PENNINCKX, M. Product formation from phenolic

compounds removal by laccases: A review. Environmental Technology and Innovation,
2016.

CERRÓN, L. M.; ROMERO-SUÁREZ, D.; VERA, N.; LUDEÑA, Y.; VILLENA, G. K.;
GUTIÉRREZ-CORREA, M. Decolorization of textile reactive dyes and effluents by biofilms
of Trametes polyzona LMB-TM5 and Ceriporia sp. LMB-TM1 Isolated from the Peruvian
Rainforest. Water, Air, and Soil Pollution, v. 226, n.8 , p. 226-235, 2015.

CHAMPAGNE, P.-P.; RAMSAY, J. A. Dye decolorization and detoxification by laccase

immobilized on porous glass beads. Bioresource technology, v. 101, n. 7, p. 2230-2235, 2010.

CHAMURIS, G. P. Speciation in the Peniophora cinerea complex. Mycologia, p. 736-742,

1991.

CHATHA, S. A. S.; ASGHER, M.; IQBAL, H.M.N. Enzyme-based solutions for textile
processing and dye contaminant biodegradation—a review. Environmental Science and
Pollution Research, v. 24, n. 16, p. 14005-14018, 2017.

CHEN, C. Y.; HUANG, Y. C.; WEI, C. M.; MENG, M.; LIU, W. H.; YANG, C. H. Properties
of the newly isolated extracellular thermo-alkali-stable laccase from thermophilic
 63

actinomycetes, thermobifida fusca and its application in dye intermediates oxidation. AMB
Express, v. 3, n. 1, p. 1-9, 2013.

CHHABRA, M.; MISHRA, S.; RAMASWAMY, T. Combination of chemical and enzymatic

treatment for efficient decolorization / degradation of textile effluent : High operational stability
of the continuous process. Biochemical Engineering Journal, v. 93, s. n, p. 17-24, 2015.

CHRISTHOPHER, L. P.; YAO, B.; JI, Y. Lignin Biodegradation with Laccase-Mediator

Systems. Frontiers in Energy Research, v. 2, n. 12, p. 1-13, 2014.

CHRISTIAN, V.; SHRIVASTAVA, R.; SHUKLA, D.; MODI, H.; VYAS, B. R. M. Mediator
role of veratryl alcohol in the lignin peroxidase-catalyzed oxidative decolorization of Remazol
Brilliant Blue R. Enzyme and microbial technology, v. 36, n. 4, p. 426-431, 2005.

CHUNG, K.-T.; CERNIGLIA, C.E. Mutagenicity of azo dyes: Structure–activity relationships.

Mutatation Resarch, v. 227, n.3, p. 201-220, 1992.

CLAUS, H. Laccases: Structure, reactions, distribution. Micron, London, v.35, 1-2, p. 93-96,
2004.

COLLINS, P. J.; DOBSON, A. Regulation of laccase gene transcription in Trametes

versicolor. Applied and Environmental Microbiology, v. 63, n. 9, p. 3444-3450, 1997.

CORREIA, V.M., STEPHENSON, T., JUDD, S.J.: Characterization of textile waste waters—
a review. Environmental Technology, v. 15, . 10, p. 917–929, 1994.

COUTO, S. Decolouration of industrial azo dyes by crude laccase from Trametes hirsuta.
Journal of Hazardous Materials, v. 148, n. 3, p. 768-770, 2007.

DA SILVA, M.; PASSARINI, M. R. Z.; BONUGLI, R. C.; SETTE, L. D. Cnidarian-derived

filamentous fungi from Brazil: isolation, characterization and RBBR decolorization screening.
Environmental Technology, v. 29, s. n, p. 1331-1339, 2008.

DAÂSSI, D.; ZOUARI-MECHICHI , H.; PRIETO, A.; MARTÍNEZ, M. J.; NASRI, M.;
MECHICHI, T. Purification and biochemical characterization of a new alkali-stable laccase
from Trametes sp . isolated in Tunisia: role of the enzyme in olive mill waste water treatment.
World Jornal of Microbiology and Biotechnollogy, v. 29, s. n, p. 2145-2155, 2013.

D'AGOSTINI, É. C., MANTOVANI, T. R. D. A., VALLE, J. S. D., PACCOLA-MEIRELLES,

L. D., COLAUTO, N. B., & LINDE, G. A. Low carbon/nitrogen ratio increases laccase
 64

production from basidiomycetes in solid substrate cultivation. Scientia Agricola, v. 68, n. 3, p.

295-300, 2011.

DEDEYAN, B.; KLONOWSKA, A.; TAGGER, S.; TRON, T.; IACAZIO, G.; GIL, G.; PETIT,
J. L. Biochemical and Molecular Characterization of a Laccase from Marasmius quercophilus.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 66, n. 3, p. 925-929, 2000.

DESAI, S. S.; NITYANAND, C. Microbial laccases and their applications: a review. Asian
Jornal of. Biotechnology, v. 3, s.n, p. 98-124, 2011.

DITTMER, N. T.; SUDERMAN, R. J.; JIANG, H.; ZHU, Y.C.; GORMAN, M. J.; KRAMER,
K. J.; KANOST, M. R. Characterization of cDNAs encoding putative laccase-like multicopper
oxidases and developmental expression in the tobacco hornworm, Manduca sexta, and the
malaria mosquito, Anopheles gambiae. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 34, n.
1, p. 29-41, 2004.

D'SOUZA, D. T.; TIWARI, R.; SAH, A. K.; RAGHUKUMAR, C. Enhanced production of

laccase by a marine fungus during treatment of colored effluents and synthetic dyes. Enzyme
and Microbial Technology, v. 38, n. 3-4, p. 504-511, 2006.

DUARTE, A. W. F.; SANTOS, J. A.; VIANNA, M. V.; VIEIRA, J. M. F.; MALLAGUTTI, V.

H.; INFORSATO, F. J.; WENTZEL, L. C. P.; LARIO, L. D.; Rodrigues, A.; Pagnocca, F. C;
Pessoa, A.; SETTE, L. D. Cold-adapted enzymes produced by fungi from terrestrial and marine
Antarctic environments. Critical reviews in biotechnology, v. 1, p. 600-619, 2018.

DURÁN, N.; ROSA, M. A.; D’ANNIBALE, A.; GIANFREDA, L. Applications of laccases

and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review. Enzyme and
Microbial Technology, Nova Iorque, v. 31, s.n, p. 907–931, 2002.

EGGERT, C.; TEMP, U.; ERIKSSON, K. E. The ligninolytic system of the white rot fungus
Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase. Applied and
Environmental Microbiology, v. 62, n. 4, p. 1151-1158, 1996.

EGGERT, C; LAFAYETTE, P. R.; TEMP, U.; ERIKSSON, K. E. L.; DEAN, J. F. Molecular

analysis of a laccase gene from the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. Applied and
Environmental Microbiology, v. 64, n. 5, p. 1766-1772, 1998.

ENGUITA, F. J.; MARTINS, L. O.; HENRIQUES, A. O.; CARRONDO, M. A. Crystal

structure of a bacterial endospore coat component: A laccase with enhanced thermostability
properties. Journal of Biological Chemistry, v. 278, n. 21, p. 19416-19425, 2003.
 65

FANG, Z. M.; LI, T. L.; CHANG, F.; ZHOU, P.; FANG, W.; HONG, Y. Z.; ZHANG, X. C.;
PENG, H.; XIAO, Y. Z. A new marine bacterial laccase with chloride-enhancing, alkaline-
dependent activity and dye decolorization ability. Bioresource Technology, v. 111, s. n, p. 36-
41, 2012.

FERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ, M.; SANROMÁN, M. A.; MOLDES, D. Recent developments

and applications of immobilized laccase. Biotechnology Advances, v. 31, n. 8, p. 1808-1825,
2013.

FORGACS, E.; CSERHÁTI, T.; OROS, G. Removal of synthetic dyes from wastewaters: A
review. Environment International, v. 30, n. 7, p. 953-971, 2004.

GAJERA, H. P.; GAJERA, H. P.; BAMBHAROLIA, R. P.; HIRPARA, D. G.; PATEL, S. V.;
GOLAKIYA, B. A. Molecular identification and characterization of novel Hypocrea koningii
associated with azo dyes decolorization and biodegradation of textile dye effluents. Process
Safety and Environmental Protection, v. 98, p. 406-416, 2015.

GARCIA, T. A. Purificação e caracterização de lacases de Pycnoporus sanguineus. 2006.

p.126. Tese de doutorado – Universidade de Brasilia, Brasilia - DF, 2006.

GAUR, N.; NARASIMHULU, K.; PYDISETTY, Y. Biochemical and kinetic characterization

of laccase and manganese peroxidase from novel Klebsiella pneumoniae strains and their
application in. RSC Advances, v. 8, s.n, p. 15044–15055, 2018.

GHOSH, A.; DASTIDAR, M. G.; SREEKRISHNAN, T. R. Recent advances in bioremediation

of heavy metals and metal complex dyes: review. Journal of Environmental Engineering,
v.192, n.9, p. 2-14, 2016.

GIARDINA, P.; FARACO, V.; PEZZELLA, C.; PISCITELLI, A.; VANHULLE, S.; SANNIA,
G. Laccases: A never-ending story. Cellular and Molecular Life Sciences, Basel, v. 67, n. 3,
p. 369-385, 2010.

GIESE, E. C.; COVIZZI, L. G.; DEKKER, R. F. H.; BARBOSA, A. M. Influência de Tween

na produção de lacases constitutivas e indutivas pelo Botryosphaeria sp. Acta Scientiarum:
Biological Sciences, Maringá, v. 26, n. 4, p. 463-470, 2004.

GLAZERA, A. N.; NIKAIDO, H. Microbial biotechnology: fundamentals of applied

microbiology. 2nd edition: New York, Cambridge University Press, 2007, p. 577.
 66

GOLVEIA, J. C. S. Indução de lacase de Pycnoporus sanguineus CCT 4518 induzida por

resíduos agroindustriais e ensaio de biorremediação de estrogênio sintético (EE2). 2016.
p.82. Dissertação de Mestrado – Universidade Federal de Goias, Goiânia – GO, 2016.

GOMES, E.; AGUIAR, A. P.; CARVALHO, C. C.; BONFÁ, M. R. B. B.; DA SILVA, R.;
BOSCOLO, M. Ligninases production by basidiomicetes strains on lignocellulosic agricultural
residues and decolorization of synthetic dyes. Brazilian Journal of Biotechnology, v. 131, n.
2, p. 31-39, 2007.

GONÇALVES, I.; SILVA, C.; CAVACO-PAULO, A. Ultrasound enhanced laccase

applications. Green Chemistry, v. 17, n. 3, p. 1362-1374, 2015.

HAO, Z.; MOHNEN, D. A review of xylan and lignin biosynthesis: Foundation for studying
Arabidopsis irregular xylem mutants with pleiotropic phenotypes. Crital Reviews
Biochemestry Molecular Biology, p. 1–30, 2014.

HUNGER, K. Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Application. Editora Wiley-VCH, 1ª

ed, Weinheim, Alemanha, 2003.

HÜTTERMANN, A.; MAI, C.; KHARAZIPOUR, A. Modification of lignin for the production
of new compounded materials. Applied microbiology and biotechnology, v. 55, n. 4, p. 387-
394, 2001.

JAFARI, N.; REZAEI, S.; REZAIE, R.; DILMAGHANI, H.; KHOSHAYAND, M. R.;
FARAMARZI, M. A. Improved production and characterization of a highly stable laccase from
the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens for the efficient delignification of
almond shell bio-waste. International Journal of Biological Macromolecules, v. 105, s. n, p.
489-498, 2017.

JIANG, J. ZHOU, Z.; DONG, Y.; GUAN, X.; WANG, B.; JIANG, B.; YANG, A.; CHEN, Z.;
GAO, S.; SUN, H. Characterization of phenoloxidase from the sea cucumber Apostichopus
japonicus. Immunobiology, v. 219, n. 6, p. 450-456, 2014.

JONES, E. B. G.; SAKAYAROJ, J.; SUETRONG, S.; SOMRITHIPOL, S.; PANG, K.L.
Classification of marine Ascomycota , anamorphic taxa and Basidiomycota. Fungal Diversity,
v. 35, p. 1-187, 2009.

KESTER, Dana R. et al. Preparation of artificial seawater 1. Limnology and oceanography,

v. 12, n. 1, p. 176-179, 1967.
 67

KHLIFI, R.; BELBAHRI, L.; WOODWARD, S.; ELLOUZ, M.; DHOUIB, A.; SAYADI, S.;
MECHICHI, T. Decolourization and detoxification of textile industry wastewater by the
laccase-mediator system. Journal of Hazardous Materials, v. 175, s. n., p. 802-808, 2010.

KILARU, S.; HOEGGER, P. J.; KÜES, U. The laccase multi-gene family in Coprinopsis
cinerea has seventeen different members that divide into two distinct subfamilies. Current
genetics, v. 50, n. 1, p. 45-60, 2006.

KOHLMEYER, J.; VOLKMANN-KOHLMEYER, B. Fungi from Coral Reefs: A

Commentary. Mycological Research, v. 107, p. 386-387, 2003.

KUMAR, M.; MISHRA, A.; SINGH, S. S.; SRIVASTAVA, S.; THAKUR, I. S. Expression
and characterization of novel laccase gene from Pandoraea sp. ISTKB and its application.
International Journal of Biological Macromolecules, v. 115, s. n, p. 308-316, 2018.

KUMAR, R.; DAYAL, R.; ONIAL, P. Utilization of Tagetes minuta Aerial Parts as a Source
of Natural Dyes for Textile Coloration. Waste and Biomass Valorization, v. 5, n. 4, p. 699-
707, 2014.

KUMAR, R.; KAUR, J.; JAIN, S.; KUMAR, A. Optimization of laccase production from
Aspergillus flavus by design of experiment technique: Partial purification and characterization.
Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, Amsterdam, v.14, n.1, p 125-131, 2016.

KUMAR, S. V. S.; PHALE, P. S.; DURANI, S.; WANGIKAR, P. P. Combined sequence and
structure analysis of the fungal laccase Family. Biotechnology and Bioengineering, Nova
Iorque, v. 83, n. 4, p. 386-394, 2003.

KUMAR, V. V.; SATHYASELVABALA, V.; PREMKUMAR, M. P.; VIDYADEVI, T.;

SIVANESAN, S. Biochemical characterization of three phase partitioned laccase and its
application in decolorization and degradation of synthetic dyes. Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic, Amsterdam, v. 74, n. 1-2, p. 63-72, 2012.

KUMARI, A.; KISHOR, N.; GUPTASARMA, P. Characterization of a mildly alkalophilic and

thermostable recombinant Thermus thermophilus laccase with applications in decolourization
of dyes. Biotechnology Letters, v. 40, n. 2, p. 285-295, 2018.

LEONOWICZ, A.; CHO, N. S.; JOLANTA LUTEREK, J.; WILKOLAZKA, A.; WOJTAS-
WASILEWSKA, M.; MATUSZEWSKA, A.; HOFRICHTER, M.; WESENBERG, D.;
ROGALSKI, J. Fungal laccase: properties and activity on lignin. Journal of Basic
Microbiology, Nova Iorque, v. 41, [s.n], p.185-227, 2001.
 68

LI, X; KONDO, R.; SAKAI, K. Studies on hypersaline-tolerant white-rot fungi III:

biobleaching of unbleached kraft pulp by hypersaline-tolerant manganese peroxidase from a
marine white rot isolate, Phlebia sp. MG-60. Journal of wood science, v. 49, n. 1, p. 0042-0046,
2003a.

LI, X.; KONDO, R.; SAKAI, K.. Studies on hypersaline-tolerant white-rot fungi IV: effects of
Mn 2+ and NH 4+ on manganese peroxidase production and Poly R-478 decolorization by the
marine isolate Phlebia sp. MG-60 under saline conditions. Journal of wood science, v. 49, n.
4, p. 355-360, 2003b.

LIU, H. CHENG, Y.; DU, B.; TONG, C.; LIANG, S.; HAN, S.; ZHENG, S.; LIN, Y.
Overexpression of a novel thermostable and chloride-tolerant laccase from Thermus
thermophilus SG0.5JP17-16 in Pichia pastoris and its application in synthetic dye
decolorization. PLoS ONE, v.10, n.3, p. 1-14, 2015.

MAGRINI, M. J. Degradação de HPAs e produção de enzimas ligninolíticas por fungos

basidiomicetos derivados de esponjas marinhas. 2012. 91 f. Dissertação (Mestrado em
Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Campinas, Campinas – SP, 2012.

MAINARDI, P. H. Produção de lacases pelo fungo filamentoso de origem marinha

Peniophora sp. CBMAI 1063 em biorreator de bancada. 2015. 74 f. Dissertação (Mestrado
em Ciências Biologicas: Microbiologia Aplicada) - Universidade Estadual Paulista, Rio Claro
– SP. 2015.

MAINARDI, P. H; FEITOSA, V. A.; PAIVA, L. B. B.; BONUGLI-SANTOS, R. C.; SQUINA,

F. M.; PESSOA, A.; SETTE, L. D. Laccase production in bioreactor scale under saline
condition by the marine-derived basidiomycete Peniophora sp. CBMAI 1063. Fungal biology,
v. 122, n. 5, p. 302-309, 2018.

MALINAUSKIENE, L., BRUZE, M., RYBERG, K., ZIMERSON, E., ISAKSSON, M.

Contact allergy from disperse dyes in textiles: a review. Contact Dermatitis, v. 68, s.n, p.65–
75, 2012.

MANAVALAN, T.; MANAVALAN, A.; THANGAVELU, K. P.; HEESE, K.

Characterization of optimized production, purification and application of laccase from
Ganoderma lucidum. Biochemical engineering journal, v. 70, p. 106-114, 2013.

MATE, D. M.; ALCALDE, M. Laccase: a multi-purpose biocatalyst at the forefront of

biotechnology. Microbial Biotechnology, v.10, n.16, p. 1457-1467, 2017.
 69

MENEZES, C. B. A.; BONUGLI-SANTOS, R. C.; MIQUELETTO, P. B.; PASSARINI, M. R.

Z.; DA SILVA, C. H. D.; JUSTO, M. R.; FANTINATTI-GARBOGINI, F.; OLIVEIRA, V. M.;
BERLINCK, R. G. S.; SETTE, L. D. Microbial diversity associated with algae, ascidians and
sponges from the north coast of Sao Paulo state. Brazilian Journal of Microbiology, v. 165,
s.n, p. 466–482, 2010.

MINUSSI, R. C.; PASTORE, G. M.; DURAN, N.; Potential applications of laccase in the food
industry. Trends in Food Science and Technology, Chichester, v. 13, n. 6-7, p. 205-216, 2002

MIRZADEH, S. S.; KHEZRI, S. M.; REZAEI, S.; FOROOTANFAR, H.; MAHVI, A. H.;
FARAMARZI, M. A. Decolorization of two synthetic dyes using the purified box of
Paraconiothyrium variabile immobilized on porous silica beads. Journal of Environmental
Health Sciences and Engineering, London, v. 12, s.n, p. 9, 2014.

MOHD-NASIR, H.; ABD-TALIB, N.; MOHD-SETAPAR, S. H.; WONG, L. P.; IDHAM, Z.;
CASILLAS, A. C.; AHMAD, A. Natural colorants from plants for wellness
industry. Empowerment, v. 9, n. 3, p. 836-843, 2018.

MOJSOV, K. Biotechnological applications of laccases in the textile industry. Savremene

tehnologije, v.3, n.1, p. 76-79, 2014.

MOJSOV, K. D; ANDRONIKOV, D.; JANEVSKI, A.; KUZELOV, A.; GABER, S. The

application of enzymes for the removal of dyes from textile effluents. Advanced technologies,
v.5, n.10, p. 81-86, 2016.

MORE, S. S.; RENUKA, P. S.; PRUTHVI, K.; SWETHA, M.; MALINI, S.; VEENA, S. M.
Isolation, Purification , and Characterization of Fungal Laccase from Pleurotus sp. Enzyme
research, v. 2011, s. n, p. 1-7, 2011.

MOREIRA, S.; MILAGRES, A. M. F.; MUSSATTO, S. I. Reactive dyes and textile effluent
decolorization by a mediator system of salt-tolerant laccase from Peniophora cinerea.
Separation and Purification Technology, v. 135, n. 1, p. 183-189, 2014.

MOREIRA-NETO, S. L. M. Caracterização de lacase de Peniophora cinerea e estudo do

potencial de aplicação biotecnológica. 2012. 169 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia
Industrial) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012.

MOROZOVA, O. V.; SHUMAKOVICH, G. P.; GORBACHEVA, M. A.; SHLEEV, S. V.;

YAROPOLOV, A. I. “Blue” Laccases. Biochemistry, Moscow, v. 72, n. 10, p. 1136-1150,
2007.
 70

MYDLARZ, L. D.; PALMER, C. V. The presence of multiple phenoloxidases in Caribbean

reef-building corals. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular &
Integrative Physiology, v. 159, n. 4, p. 372-378, 2011.

NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Tradução de A. A.

Simões. 6 ed. Porto Alegre: Artmed, 2014, p.1220

NILADEVI, K. N.; JACOB, N.; PREMA, P. Evidence for a halotolerant-alkaline laccase in

Streptomyces psammoticus: Purification and characterization. Process Biochemistry, Barking,
v. 43, s.n, p. 654-660, 2008.

OBARA, F. W. H.; VARÉA-PEREIRA, G.; MIYAGUI, D. T.; SILVA, M.L. C. PPO-

Purificação de lacases PPO - I de Botryosphaeria rhodina. Acta Science Biology Science, v.
17, n. 13, P. 303-310, 2005.

OLIVEIRA, G. A. R.; LAPUENTE, J.; TEIXIDÓ, E.; PORREDÓN, C.; BORRÀS, M.;
OLIVEIRA, D. P. Textile dyes induce toxicity on zebrafish early life stages. Environmental
Toxicology and Chemistry, v.35, n.2, p. 429-434, 2016.

ONG, S. A.; UCHIYAMA, K.; INADAMA, D.; ISHIDA, Y.; YAMAGIWA, K. Treatment of
azo dye Acid Orange 7 containing wastewater using up-flow constructed wetland with and
without supplementary aeration. Bioresource Technology, v.101, n.23, p. 9049-9057, 2010.

OSTERHAGE, C. Isolation, Structure Determination and Biological Activity Assessment

of Secondary Metabolites from Marine-derived Fungi. 2001, 195f. Tese (Doutorado em
Ciências ) Universidade de Tecnologia de Carolo-Braunschweig, Brunswick – Alemanha,
2001.

OTERO, I. V. R. Transcriptoma do fungo de origem marinha Peniophora sp. CBMAI

1063: análise dos genes de lacase, clonagem e expressão heteróloga. 2016. 74 f. Dissertação
(Mestrado em Ciências Biologicas: Microbiologia Aplicada) - Universidade Estadual Paulista,
Rio Claro, 2016.

OTERO, I. V. R.; FERRO, M.; BACCI, M.; FERREIRA, H.; SETTE, L. D. De novo
transcriptome assembly: a new laccase multigene family from the marine-derived
basidiomycete Peniophora sp. CBMAI 1063. AMB Express, Heidelberg, v. 1, n. 7, 2017.

OTTO, B.; SCHLOSSER, D. First laccase in green algae: purification and characterization of
an extracellular phenol oxidase from Tetracystis aeria. Planta, v. 240, n. 6, p. 1225-1236, 2014.
 71

PAIVA, C. K. C. Produção de lacase por fungo isolado de sedimento marinho. 2016. 37 f.

Trabalho de Conclusão de Curso (Curso de graduação em engenharia ambiental) –
Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 2016.

PARK, N.; PARK, S. International Journal of Biological Macromolecules Purification and

characterization of a novel laccase from Fomitopsis pinicola mycelia. International Journal
of Biological Macromolecules, v. 70, s. n, p. 583-589, 2014.

PASSARINI, M. R. Z.; OTTONI, C.; SANTOS, C.; LIMA, N.; SETTE, L. D. Induction,
expression and characterisation of laccase genes from the marine-derived fungal strains
Nigrospora sp. CBMAI 1328 and Arthopyrenia sp. CBMAI 1330. AMB Express, v. 5, p. 1-9,
2015.

PASSARINI, M. R.Z.; RODRIGUES, M. V. N.; SILVA, M.; SETTE, L. D. Marine-derived

filamentous fungi and their potential application for polycyclic aromatic hydrocarbon
bioremediation. Marine Pollution Bulletin, v. 62, p. 364–370, 2011.

PATEL, H.; GUPTE, S.; GAHLOUT, M.; GUPTE, A. Purification and characterization of an
extracellular laccase from solid-state culture of Pleurotus ostreatus HP-1. 3 Biotech, v.4, n.1,
p. 77-84, 2014.

PEREIRA, L.; COELHO, A. V.; VIEGAS, C. A.; SANTOS, M. M. C.; ROBALO, M. P.;
MARTINS, L. O. Enzymatic biotransformation of the azo dye Sudan Orange G with bacterial
CotA-laccase. Journal of Biotechnology, v. 139, n. 1, p. 68-77, 2009.

PESSOA-JR, A.; KILIKIAN, B. V. Purificação de Produtos Biotecnológicos. 1ª ed. Barueri-

SP: Manole, 2005. p. 444.

POLIZELI, M. L. T. M.; RAI, M. Fungal Enzymes. 1 ed. Boca Raton: CRC press, 2014.

RAGHUKUMAR, C.; D’SOUZA-TICLO, D.; VERMA, A. K. Treatment of Colored Effluents

with Lignin-Degrading Enzymes: An Emerging Role of Marine-Derived Fungi. Critical
Reviews in Microbiology, Boca Raton, v. 34, n. 3-4, p. 189–206, 2008.

RAGHUKUMAR, C.; RAGHUKUMAR, S.; CHINNARAJ, A.; CHANDRAMOHAN, D.;

D’SOUZA, T. M.; REDDY, C. A. Laccase and other lignocellulose modifying enzymes of
marine fungi isolated from the coast of India. Botanica Marina, v. 37, n. 6, p. 515-524, 1994.

RAMÍREZ-CAVAZOS, L. I.; JUNGHANNS, C.; ORNELAS-SOTO, N.; CÁRDENAS-

CHÁVEZ, D. L.; HERNÁNDEZ-LUNA, C.; DEMARCHE, P.; ENAUD, E.; GARCÍA-
MORALES, R.; AGATHOS, S. N.; PARRA, R. Purification and characterization of two
 72

thermostable laccases from Pycnoporus sanguineus and potential role in degradation of

endocrine disrupting chemicals. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Amsterdam,
v. 108, s.n, p 32-42, 2014.

REVANKAR, M. S.; LELE, S. S. Enhanced production of laccase using a new isolate of white
rot fungus WR-1. Process Biochemistry, v. 41, n. 3, p. 581-588, 2006.

RIVA, S. Laccases: blue enzymes for green chemistry. TRENDS in Biotechnology, v. 24, n.
5, p. 219-226, 2006.

RODGERS, C. J.; BLANFORD, C. F.; GIDDENS, S. R.; SKAMNIOTI, P.; ARMSTRONG,

F. A.; GURR, S. J. Designer laccases: a vogue for high-potential fungal enzymes? Trends in
Biotechnology, v.28, n.2, p. 63-72, 2009.

ROSSI, T.; SILVA, P. M.S.; DE MOURA, L. F.; ARAÚJO, M. C.; BRITO, J. O.; FREEMAN,
H. S. Waste from eucalyptus wood steaming as a natural dye source for textile fibers. Journal
of Cleaner Production, v.143, s.n, p. 303-310, 2017.

SCHNEIDER, K., HAFNER, C.; JÄGER, I. Mutagenicity of textile dye products. Journal of
Applied Toxicology, v. 24, n.2, p. 83– 91, 2004.

SENTHIVELAN, T.; KANAGARAJ, J.; PANDA, R. C. Recent trends in fungal laccase for
various industrial applications: an eco-friendly approach-a review. Biotechnology and
bioprocess engineering, v. 21, n. 1, p. 19-38, 2016.
SETTE, L. D.; BONUGLI-SANTOS, R. C. Ligninolytic enzymes from marine-derived fungi:
production and applications. In: Antonio Trincone. (Org.). Marine enzymes for biocatalysis:
Sources, biocatalytic characteristics and bioprocesses of marine enzymes. 1ed.Cambridge:
Woodhead Publishing Limited, 2013, v., p. 403-427.

SETTE, L.; BONUGLI-SANTOS, R. C.; TERRONE, C. C.; CARMONA, E. C. Processo de

obtenção da enzima lacase por fungo marinho, enzima lacase e uso da mesma. 2014, Brasil.
Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: BR102014008502, título: "processo de
obtenção da enzima lacase por fungo marinho, enzima lacase e uso da mesma", Instituição de
registro: INPI - Instituto Nacional da Propriedade Industrial. Depósito: 09/04/2014; Em
Domínio Público: 01/12/2015.

SHANKAR, S.; SHIKHA. Laccase production and enzymatic modification of lignin by a novel
Peniophora sp. Applied Biochemistry and Biotechnology, Totowa, v. 166, n. 4, p. 1082-1094,
2012.
 73

SHARMA, P.; GOEL, R.; CAPALASH, N. Bacterial laccases. World Journal of

Microbiology and Biotechnology, v. 23, n. 6, p. 823-832, 2007.

SHIN, K. S.; LEE, Y. J. Purification and characterization of a new member of the laccase family
from the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus. Archives of biochemistry and
biophysics, v. 384, n. 1, p. 109-115, 2000.

SHLEEV, S.; JAROSZ-WILKOLAZKA, A.; KHALUNINA, A.; MOROZOVA, O.;

YAROPOLOV, A.; RUZGAS, T.; GORTON, L. Direct electron transfer reactions of laccases
from different origins on carbon electrodes. Bioelectrochemistry, Nova Iorque, v. 67, n.1, p.
115-124, 2005.

SHRADDHA; SHEKHER, R.; SEHGAL, S.; KAMTHANIA, M.; KUMAR, A. Laccase:

microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications.
Enzyme research, Nova Iorque, v. 2011, s.n, p. 1-11, 2011.

SI, J.; PENG, F.; CUI, B. Bioresource Technology Purification, biochemical characterization
and dye decolorization capacity of an alkali-resistant and metal-tolerant laccase from Trametes
pubescens. Bioresource Technology, v. 128, s.n, 2013.

Sigma-Aldrich, disponível em:

<https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b1064?lang=pt&region=BR>
acessado 10 de janeiro de 2019.

SILVÉRIO, S. C.; MOREIRA, S.; MILAGRES, A. M.; MACEDO, E. A.; TEIXEIRA, J. A.;
MUSSATTO, S. I. Laccase production by free and immobilized mycelia of Peniophora cinerea
and Trametes versicolor: a comparative study. Bioprocess and biosystems engineering, v. 36,
n. 3, p. 365-373, 2013.

SINGH, R. L.; SINGH, P. K.; SINGH, R. P.. Enzymatic decolorization and degradation of azo
dyes–A review. International Biodeterioration & Biodegradation, v. 104, p. 21-31, 2015.

SIVAKUMAR, R.; RAJENDRAN, R.; BALAKUMAR, C.; TAMILVENDAN, M. Isolation,

screening and optimization of production medium for thermostable laccase production from
Ganoderma sp. Int J Eng Sci Technol, v. 2, n. 12, p. 7133-7141, 2010.

STOILOVA, I.; KRASTANOV, A.; STANCHEV, V. Properties of crude laccase from

Trametes versicolor produced by solid-substrate fermentation. Advances in Bioscience and
Biotechnology, Oxford, v. 1, n. 3, p. 208-215, 2010.
 74

TAGGER, S.; PÉRISSOL, C.; GIL, G.; VOGT, G. LE PETIT, J. Phenoloxidases of the white-
rot fungus Marasmius quercophilus isolated from an evergreen oak litter (Quercus ilex L.).
Enzyme and Microbial Technology. V.23 N.6 p. 372-379, 1998.

TANI, H.; FUJII, Y.; NAKAJIMA, H. Chlamydocin analogues from the soil fungus Peniophora
sp.: Structures and plant growth-retardant activity. Phytochemistry, v. 58, n. 2, p. 305-310,
2001.

THEERACHAT, M.; GUIEYSSE, D.; MOREL, S.; REMAUD-SIMÉON, M.;

CHULALAKSANANUKUL, W. Laccases from Marine Organisms and Their Applications in
the Biodegradation of Toxic and Environmental Pollutants: a Review. Applied Biochemistry
and Biotechnology. p.1-29, 2018.

THURSTON, C. F. The structure and function of fungal laccases. Microbiology, United

Kingdon, v. 140, s.n, p. 19-26, 1994

TIEN, M; KIRK, T. K. Lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium:

purification, characterization, and catalytic properties of a unique H2O2-requiring
oxygenase. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 81, n. 8, p. 2280-2284,
1984.

TINOCO, R.; ACEVEDO, A.; GALINDO, E.; SERRANO-CARREÓN, L. Increasing

Pleurotus ostreatus laccase production by culture medium optimization and copper/lignin
synergistic induction. Journal of industrial microbiology & biotechnology, v. 38, n. 4, p.
531-540, 2011.

TRINCONE, A. Potential biocatalysts originating from sea environments. Journal of

Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 66, p. 241-256, 2010.

UTHANDI, S.; SAAD, B.; HUMBARD, M. A.; MAUPIN-FURLOW; J. A. LccA, an archaeal

laccase secreted as a highly stable glycoprotein into the extracellular medium by Haloferax
volcanii. Applied and environmental microbiology, v. 76, n. 3, p. 733-743, 2010.

VAITHANOMSAT, P.; APIWATANAPIWAT, W.; PETCHOY, O.; CHEDCHANT, J.

Production of ligninolytic enzymes by white-rot fungus Datronia sp. KAPI0039 and their
application for reactive dye removal. International Journal of chemical engineering, v. 2010,
2010.
 75

VIEIRA, G.; PURIC, J.; MORAO, L.G; SANTOS, J. A.; INFORSATO, F. J.; SETTE, L. D.;
FERREIRA, H.; SASS, D. C. Terrestrial and marine Antarctic fungi extracts active against
Xanthomonas citri subsp. citri.. Letters in applied microbiology, v. 67, p. 64-71, 2018.

WANG, Z.; CAI, Y.; LIAO, X.; ZHANG, F.; ZHANG, D.; LI, Z. Production and
characterization of a novel laccase with cold adaptation and high thermal stability from an
isolated fungus. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 162, n. 1, p. 280-294, 2010.

WARIISHI, H.; VALLI, K.; GOLD, M. H. Manganese (II) oxidation by manganese peroxidase
from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Kinetic mechanism and role of
chelators. Journal of Biological Chemistry, v. 267, n. 33, p. 23688–23695, 25 nov. 1992.

WILSON, K.; WALKER, J. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular

Biology. 7. ed. Nova Iorque: Cambridge University Press, 2010, p. 484.

XU, F. Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: Correlation

between activity and redox potentials as well as halide inhibition. Biochemistry, Washington,
v. 35, n. 23, p. 7608-7614, 1996.

YAMAK, O.; KALKAN, N. A.; AKSOY, S.; ALTINOK, H.; HASIRCI, N. Semi-
interpenetrating polymer networks (semi-IPNs ) for entrapment of laccase and their use in Acid
Orange 52 decolorization. Process Biochemistry, v. 44, s. n, p. 440-445, 2009.

YANG, J.; LIN, Q.; NG, T. B.; YE, X.; LIN, J. Purification and characterization of a novel
laccase from Cerrena sp. HYB07 with dye decolorizing ability. PLoS ONE, v. 9, n. 10, p. 1-
13, 2014.

YANG, J.; XU, X.; NG, T. B.; LIN, J.; YE, X. Laccase gene family in Cerrena sp. HYB07:
Sequences, heterologous expression and transcriptional analysis. Molecules, v.21, n. 8, p.1-16,
2016.

YAVER, D. S.; XU, F.; GOLIGHTLY, E. J.; BROWN, K. M.; BROWN, S. H.; REY, M. W.;
SCHNEIDER, P.; HALKIER, T. DALBOGE, H. Purification, characterization, molecular
cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes
villosa. Applied and Environmental Microbiology, v. 62, n. 3, p. 834-841, 1996.

YOSHIDA, H. LXIII.- Chemistry of lacquer (Urushi). Part I. communication from the chemical
society of Tokio. Journal of the Chemical Society, Washington, v. 43, s.n, p. 472-486, 1883.
 76

YOUNES, S. B.; SAYADI, S. Purification and characterization of a novel trimeric and

thermotolerant laccase produced from the ascomycete Scytalidium thermophilum
strain. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 73, n. 1-4, p. 35-42, 2011.

ZHENG, F.; AN, Q.; MENG, G.; WU, X. J.; DAI, Y. C.; SI, J. A novel laccase from white rot
fungus Trametes orientalis: Purification, characterization, and application. International
Journal of Biological Macromolecules, v. 102, s. n, p. 758-770, 2017.

ZOUARI-MECHICHI, H.; MECHICHI, T.; DHOUIB, A.; SAYADI, S.; MARTÍNEZ, A. T.;
MARTÍNEZ, M. J. Laccase purification and characterization from Trametes trogii isolated in
Tunisia: decolorization of textile dyes by the purified enzyme. Enzyme and Microbial
Technology, v. 39, n. 1, p. 141-148, 2006.

ZUCCA, P.; COCCO, G.; SOLLAI, F.; SANJUST, E. Fungal laccases as tools for
biodegradation of industrial dyes. Biocatalysis, v. 1, n. 1, p. 82-108, 2015.
 77

APÊNDICE

Apêndice 1. Curva de Bradford, plotado com concentrações de BSA variando de 0 a 0,2 mg/mL em
tampão acetato, com relação do volume de 20μL amostra para 80μL reagente.

Bradford
0,25
Absorbância (595 nm)

0,2

0,15

0,1
y = 1,0837x + 0,0028
0,05 R² = 0,9983

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
Proteinas (mg/mL)

Apêndice 2. Absorbância da reação do caldo bruto, ultrafiltrado concentrado (*diluída 1,6 X),
ultrafiltrado permeado 1 e 2 e troca iônica (*diluída 1,6 X) do Peniophora sp. CBMAI 1063 com o
reagente de Bradford (Sigma).

Proteínas totais Absorbância (595)

Amostra I II III Média
Caldo Bruto 0,069 0,069 0,096 0,078
*Ultrafiltrado concentrado 0,127 0,125 0,127 0,126
Ultrafiltrado Permeado 1 0,001 0,003 0,005 0,003
Ultrafiltrado Permeado 2 0 0 0 0
*Troca Iônica 0,184 0,179 0,183 0,182

Apêndice 3. Absorbância da reação do caldo bruto, ultrafiltrado concentrado (*diluída 1,6 X),
ultrafiltrado permeado e troca iônica do Peniophora cinerea CCIBt 2541 com o reagente de Bradford
(Sigma).

Proteínas totais Absorbância (595)

Amostra I II III Média
Caldo Bruto 0,151 0,176 0,159 0,162
*Ultrafiltrado concentrado 0,155 0,157 0,153 0,155
Ultrafiltrado Permeado 1 0,002 0,003 0 0
Troca Iônica 0,142 0,169 0,134 0,15
 78

Apêndice 4. Absorbância da reação do caldo bruto, ultrafiltrado concentrado (*diluída 5 X), ultrafiltrado
permeado e troca iônica (*diluída 5 X) do Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 com o reagente de
Bradford (Sigma).

Proteínas totais Absorbância (595)

Amostra I II III Média
Caldo Bruto 0,111 0,107 0,126 0,115
*Ultrafiltrado concentrado 0,104 0,110 0,100 0,105
*Troca Iônica 0,181 0,194 0,188 0,188

Apêndice 5. Absorbância da reação do caldo bruto, ultrafiltrado concentrado (*diluída 1,6 X),
ultrafiltrado permeado e troca iônica (*diluída 1,6 X) do Marasmiellus sp. CBMAI 1062 com o reagente
de Bradford (Sigma).

Proteínas totais Absorbância (595)

Amostra I II III Média
Caldo Bruto 0,07 0,077 0,072 0,073
*Ultrafiltrado concentrado 0,133 0,119 0,0129 0,127
*Troca Iônica 0,122 0,128 0,131 0,127

Apêndice 6. Absorbâncias (420 nm) do caldo bruto e após o processo purificação de lacases, em
diferentes diluições do caldo do fungo Marasmiellus colocasiae CCIBt 3388 aplicado à equação 1 para
determinação da atividade enzimática de lacase.

Caldo bruto Ultrafiltrado Troca Iônica

t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’)
0,09 0,28 0,03 0,12 0,20 0,03 0,20 0,36
0,08 0,27 0,02 0,12 0,20 0,03 0,19 0,350
0,07 0,26 0,03 0,12 0,20 0,03 0,19 0,35
-1 -1 -1
Total (U/L ) 887,30 Total(U/L ) 8117 Total (U/L ) 15031
Desvio Padrão 21 Desvio Padrão 71 Desvio Padrão 377
 79

Apêndice 7. Absorbâncias (420 nm) do caldo bruto e após o processo purificação de lacases, em diferentes diluições do caldo do fungo Peniophora sp. CBMAI
1063, aplicado à equação 1 para determinação da atividade enzimática de lacase.
Caldo bruto Ultrafiltrado Permeado ultrafiltrado Troca iônica
t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’)
0,12 0,22 0,30 0,09 0,19 0,30 0,04 0,09 0,18 0,05 0,28 0,55
0,13 0,25 0,31 0,08 0,20 0,33 0,04 0,10 0,19 0,05 0,28 0,56
0,13 0,21 0,31 0,08 0,19 0,30 0,03 0,08 0,17 0,05 0,29 0,57
Total (U/L-1) 1.722,00 Total(U/L-1) 10632,70 Total (U/L-1) 0,65 -1
Total (U/L ) 4691,40
Desvio Padrão 9,30 Desvio Padrão 1053,01 Desvio Padrão 0,01 Desvio Padrão 107,30

Apêndice 8. Absorbâncias (420 nm) do caldo bruto e após o processo purificação de lacases, em diferentes diluições do caldo do fungo Peniophora cinerea
CCIBt 2451, aplicado à equação 1 para determinação da atividade enzimática de lacase.

Caldo bruto Ultrafiltrado Permeado ultrafiltrado Troca iônica

t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’)
0,12 0,21 0,30 0,03 0,09 0,17 0,02 0,07 0,13 0,01 0,04 0,08
0,06 0,15 0,25 0,04 0,11 0,18 0,02 0,06 0,10 0,01 0,04 0,08
0,06 0,16 0,27 0,03 0,09 0,16 0,02 0,06 0,11 0,01 0,04 0,08
-1 -1 -1 -1
Total (U/L ) 1753 Total(U/L ) 6419,70 Total (U/L ) 422,80 Total (U/L ) 642
Desvio Padrão 123,30 Desvio Padrão 208,80 Desvio Padrão 55,80 Desvio Padrão 26,7
Apêndice 9. Absorbâncias (420 nm) durante os processos de purificação de lacases, em diferentes diluições do caldo do fungo Marasmiellus sp. CBMAI 1062,
aplicado à equação 1 para determinação da atividade enzimática de lacase.

Caldo bruto Ultrafiltrado Troca Iônica

t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’) t1 (0’) t2 (5’) t3 (10’)
0,044 0,061 0,077 0,022 0,061 0,094 0,049 0,146 0,235
0,047 0,066 0,085 0,023 0,059 0,096 0,053 0,142 0,235
0,021 0,056 0,094 0,045 0,130 0,227
Total (U/L-1) 1,1 Total(U/L )-1
33,6 -1
Total (U/L ) 85
Desvio Padrão 0,16 Desvio Padrão 0,26 Desvio Padrão 1