UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE – PPGCS

JOSÉ MARCELO BOTACIN CAMPOS

AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO GESTACIONAL AO VALPROATO DE

SÓDIO COMBINADO A PRIVAÇÃO MATERNA EM UM MODELO
ANIMAL DE AUTISMO

CRICIÚMA, 2020
 JOSÉ MARCELO BOTACIN CAMPOS

AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO GESTACIONAL AO VALPROATO DE

SÓDIO COMBINADO A PRIVAÇÃO MATERNA EM UM MODELO
ANIMAL DE AUTISMO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade do Extremo Sul Catarinense -
UNESC, para a obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Cinara Ludvig

Gonçalves

CRICIÚMA, 2020
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

C198a Campos, José Marcelo Botacin.

Avaliação da exposição gestacional ao
valproato de sódio combinado a privação materna
em um modelo animal de autismo / José Marcelo
Botacin Campos. - 2020.
74 p. : il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade do

Extremo Sul Catarinense, Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde, Criciúma, 2020.
Orientação: Cinara Ludvig Gonçalves.

1. Transtorno do Espectro Autista (TEA). 2.

Autismo. 3. Privação dos pais. 4. Ácido valpóico.
5. Estresse oxidativo. I. Título.

CDD 23. ed. 616.8982

Bibliotecária Elisângela Just Steiner – CRB 14/1576

Biblioteca Central Prof. Eurico Back - UNESC
 UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
PRÓ-REITORIA ACADÊMICA - PROACAD
DIRETORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (Mestrado e Doutorado)
Recomendado pela CAPES – Homologado pelo CNE – Portaria Nº 609 de 14.03.2019

ATA DE MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE – Nº 357

Com início às 16h (dezesseis horas) do dia vinte e oito de julho de 2020 (dois mil e
vinte), realizou-se, via ferramenta digital Google Meet, o seminário formal de
apresentação dos resultados da dissertação de Mestrado de JOSÉ MARCELO
BOTACIN CAMPOS, sob a orientação da Profa. Dra. Cinara Ludvig Gonçalves
intitulada “AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO GESTACIONAL AO VALPROATO DE
SÓDIO COMBINADO A PRIVAÇÃO MATERNA EM UM MODELO ANIMAL DE
AUTISMO”. A dissertação foi examinada por uma banca examinadora constituída
pelos seguintes membros: Profa. Dra. Gislaine Zilli Réus (Universidade do Extremo
Sul Catarinense - UNESC) – Conceito final: Aprovado, Profa. Dra. Alexandra Ioppi
Zugno (Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC) – Conceito final:
Aprovado e Profa. Dra. Gislaine Tezza Rezin (Universidade do Sul da Santa Catarina
- UNISUL) – Conceito final: Aprovado. Com o resultado final: APROVADO, o aluno
finalizou seus estudos em nível de Mestrado, fazendo jus ao grau de MESTRE EM
CIÊNCIAS DA SAÚDE. Os trabalhos foram concluídos às 17h (dezessete horas), dos
quais eu, Fernanda Nunes Peruchi, Assistente Administrativo do Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense –
UNESC lavrei a presente ata, que assino juntamente com o Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol,
Coordenador do Programa. Criciúma, 28 (vinte e oito) de julho de 2020 (dois mil e
vinte).

Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol Fernanda Nunes Peruchi

Coordenador do PPGCS Assistente Administrativo
 FOLHA INFORMATIVA

Esta dissertação foi elaborada seguindo o estilo Vancouver e será apresentada no

formato tradicional.
Este trabalho foi realizado nas instalações do Laboratório de Autismo e pesquisa em
Neurodesenvolvimento – LAND, do Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde (PPGCS) da UNESC.
 Dedico este trabalho à minha família:
esposa Gilnara e filhos Bhrenda, Marcelo
Antônio e Olívia que sempre me apoiaram e
deram força para meu sucesso e a minha Mãe
Cecília que, nos tempos difíceis, me acolheu em
seus braços.
 AGRADECIMENTOS

Não poderia iniciar de modo diferente, que não fosse agradecer a Deus pela
saúde e por me ter permito fazer novos amigos e me tornar um profissional melhor. À
minha esposa Gilnara, que nos tempos difíceis sempre me apoiou, acreditou em mim
e em minhas ideias, e hoje faz parte do meu sucesso. A minha mãe, pois, no momento
que precisei ela me acolheu, me aconselhou e apoiou.
Agradeço as minhas amigas de estudo, que desde o começo, fizeram parte da
dura rotina de estudos, das apresentações dos trabalhos e viagens à Criciúma - SC.
Nos momentos em que estava difícil, sempre tínhamos uns aos outros para nos
socorrer. Obrigado Daine, Rovena, Lia e Rusilania pelo apoio, carinho e parceria nesta
jornada.
Agradeço também ao UNESC Colatina-ES, por ter me proporcionado a
oportunidade de aperfeiçoamento profissional através do programa MINTER,
certamente, estou mais capacitado e com olhares ampliados frente a tríade ensino-
pesquisa-extensão.
Agradeço a minha orientadora prof. Drª Cinara que me acolheu em seu grupo de
estudos, me orientou e conduziu meus estudos sobre sua sabedoria. Agradeço
também aos membros do grupo de estudos/laboratório pelo aprendizado e por ter me
ajudado com os experimentos.
Muitas pessoas fazem parte desta caminhada e não seria possível citar o nome
de todas, então, agradeço as falas, orientações dos amigos, coordenadores de curso
e família que diretamente contribuíram para a conclusão deste curso.
 “Do lado de fora, olhando para dentro, você
nunca poderá entendê-lo. Do lado de dentro,
olhando para fora, você jamais conseguirá
explicá-lo. Isso é autismo.”
Autism Topics
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2–
1O Oxigênio singlet
5-HT – Serotonina /Receptor 5-hidroxitriptamina (sigla do inglês)
BDNF – Fator neurotrófico derivado do cérebro (sigla do inglês)
CDC – Centros de Controle e Prevenção de Doenças (sigla do inglês)
CEUA – Comitê de Ética no Uso de Animais
CNVs - Variantes do Número de Cópias (sigla do inglês)
DCF – 2',7'-diclorofluoresceína
DCFH – Dicloroidrofluoresceína (sigla do inglês)
DCFH-DA – diacetato 2′,7′-diclorofluoresceína
DNA – Ácido desoxirribonucleico (sigla do inglês)
DNPH – 2,4-dinitrofenil-hidrazina
DPN – Dia pós-natal
DSM – Manual de Diagnóstico e Estatístico da Associação Americana de Psiquiatria
DTNB – Ácido 5,5'-ditio-bis- [2-nitrobenzóico] (sigla do inglês)
eNOS – Isoenzima óxido nítrico sintase endotelial (sigla do inglês)
ERN – Espécies reativas nitrogênio
ERO – Espécie Reativa de Oxigênio
FMR1 – Gene Retardo Mental frágil X 1(sigla do inglês)
GABA – Ácido gama-amino-butírico (sigla do inglês)
GABAA – Receptores do ácido γ-aminobutírico tipo A (sigla do inglês)
GABRB3 – Receptor beta3 do ácido gama-aminobutírico 3 (sigla do inglês)
GAD65 e GAD67 – Descarboxilase de ácido glutâmico (sigla do inglês)
GD – Dia gestacional
GPx – Glutationa peroxidase (sigla do inglês)
GR – Glutationa redutase (sigla do inglês)
GSH – Glutationa reduzida
GSSG – Glutationa oxidada (sigla do inglês)
GST – Glutationa transferase (sigla do inglês)
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
HNO2 – Ácido nitroso
HO• – Hidroxila
HPA – Hipotálamo-pituitária-adrenal
IFN-γ – Interferon-gama (sigla do inglês)
IL-12 – Interleucina 12
IL-1β – Interleucinas 1beta
IL-6 – Interleucina 6
iNOS – Isoenzima óxido nítrico sintase indutível (sigla do inglês)
IP – Intraperitoneal
MDA – Malondialdeído
MECP2 – Proteína 2 de ligação ao metil-CpG (sigla do inglês)
mtDNA – DNA mitocondrial
N2O3 – Óxido nitroso
NADPH – Fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida reduzida (sigla do
inglês)
NG2-glia – Células precursoras de oligodendrócitos (sigla do inglês)
nNOS – Isoenzima óxido nítrico sintase neuronal (sigla do inglês)
NO – Óxido nítrico (sigla do inglês)
NO2- – Nitrito
NO2-. – Nitrito
NO3- – Nitrato
NOS – Óxido nítrico sintase (sigla do inglês)
O2 – Oxigênio molecular
O2•- – Superóxido
ONOO- – Peroxinitrito
OPCs – Células progenitoras de oligodendrócitos (sigla do inglês)
PM – Privação Materna
RO• – Alcoxila
ROO• – Peroxila
SAL – Salina
SC – Subcutânea
SH – Grupo Sulfidrila
SHANK3 – Gene SH3 e múltiplos domínios de repetição de anquirina 3 (sigla do
inglês)
SNC – Sistema Nervoso Central
SNP – Sistema Nervoso Periférico
SOD – Superóxido dismutase
TBARS – Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
TEA – Transtorno do Espectro Autista
TNF-α – Fatores de Necrose Tumoral Alfa (sigla do inglês)
VO – Via oral
VPA – Ácido Valproico
 LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Correlação entre fatores contribuintes para o desenvolvimento do TEA... 21

Figura 2: Representação esquemática do processo inflamatório durante a gravidez
com ativação do sistema imune fetal. ....................................................................... 22
Figura 3: Quadro apresentando estágios de desenvolvimentos e fatores ambientais
associados ao Transtorno do Espectro Autista. ........................................................ 26
Figura 4: Estresse por privação materna e alterações fisiológicas.. ......................... 31
Figura 5: Hipótese de citocinas de neuroinflamação: implicações na comorbidade de
doenças sistêmicas com transtornos psiquiátricos. ................................................... 32
Figura 6: Produção de ERO e efeitos patológicos provocado pelo desequilíbrio redox
nas células. ............................................................................................................... 36
Figura 7: Representação esquemática do desenho experimental - matrizes VPA /
SAL. .......................................................................................................................... 41
Figura 8: Representação esquemática do desenho experimental modelo animal
murino de TEA: VPA + PM. ....................................................................................... 41
Figura 9: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, no comportamento
de interação social dos animais testados. ................................................................. 47
Figura 10: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, no comportamento
locomotor dos animais testados. ............................................................................... 48
Figura 11: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de
DCF, no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) de animais
expostos ao VPA (pré-natal) e a PM (pós-natal) (n= 5-6 animais/grupo). ................. 49
Figura 12: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de
Carbonil no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) dos animais
testados (n=5-6 animais/grupo). ................................................................................ 50
Figura 13: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de
Sulfidrila (SH) no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) dos
animais testados (n=5-6 animias/grupo). .................................................................. 51
Figura 14: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de
nitrito (NO2-) no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) dos
animais testados (n=5-6 animais/grupo). .................................................................. 51
Figura 15: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de
glutationa reduzida (GSH) no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo
(C) dos animais testados ( n=5-6 animais /grupo).. ................................................... 52
Figura 16: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de
Superóxido Dismutase (SOD), no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e
Cerebelo (C) dos animais testados ( n=5-6 animais /grupo). .................................... 53
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Síndromes monogênicas* associadas ao transtorno do espectro autista e a

genes correspondentes. ............................................................................................ 25
Tabela 2: Avaliação do estado redox do homogeneizado cerebral – visão geral ..... 63
 RESUMO

Introdução: O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um distúrbio complexo e

geneticamente heterogêneo caracterizado por comprometimento das habilidades
sociais e de comunicação, além de comportamentos estereotipados e um repertório
restrito de interesses e atividades. Estudos mostram que o TEA afeta 1 em cada 100
crianças em todo o mundo com prevalência em homens na proporção de quatro vezes
mais (4:1) que as mulheres. Apresenta etiopatogenia multifatorial provinda da
interação complexa entre fatores genéticos e ambientais. Essa multiplicidade de
fatores dificultam a concretização de sua fisiopatologia. Estudos demonstram que
fatores gestacionais como complicações durante a gravidez, exposição a produtos
químicos, processo inflamatório materno durante a gestação, epigenética, e disfunção
mitocondrial podem afetar o neurodesenvolvimento e estão associados ao TEA.
Objetivo: caracterizar os efeitos da exposição gestacional ao valproato de sódio
combinado à privação materna sob parâmetros comportamentais, inflamatórios e de
estresse oxidativo. Metodologia: Foi utilizado o modelo animal de autismo através de
indução química por administração de ácido valpróico (VPA) pré-natal, associado à
privação materna (PM) pós-natal. No décimo segundo dia de gestação (DG12), as
ratas Wistar grávidas receberam 600mg/kg de VPA (grupo VPA-expostos) ou salina
(grupo SAL-expostos), via intraperitoneal. Ao nascimento, as proles VPA-expostos e
SAL-expostos foram subdivididos em grupos: I) “privação materna” e II) “sem-privação
materna”, para realização do experimento. A privação materna ocorreu do 1º ao 10º
dia pós-natal, durante 3 h/dia. Os parâmetros comportamentais de interação social e
avaliação locomotora, foram avaliados nos dias 25 e 28 pós-natal. No 30º dia pós-
natal, os animais foram eutanasiados e o cérebro removido para isolamento do córtex,
pré-frontal e cerebelo para análise de parâmetros estresse oxidativo. Resultados: O
modelo VPA demonstrou alterações significativas no teste de interação social,
conforme observado em humanos com TEA. Na análise molecular, para identificar
comprometimento estrutural e funcional, os dados estatísticos demonstraram que o
grupo VPA+PM apresentou alteração significativa dos níveis de todos os marcadores
de estresse oxidativo utilizados dicloroidrofluoresceína (DCF), proteína carbonil,
sulfidrila, óxido nítrico e diminuição da defesa antioxidante de glutationa reduzida
(GSH) e superóxido dismutase (SOD). Conclusão: O protocolo de VPA+PM proposto
neste estudo se mostrou funcional com alcance dos objetivos traçados pela pesquisa.
Se mostrou como um modelo complexo e com alterações que perduraram na
juventude. Estudos futuros são sugeridos para uma melhor investigação dos
mecanismos fisiológicos promovidos pela associação do modelo VPA+PM, deste
modo, processos ainda não compreendidos podem ser avaliados direcionando
tratamento mais eficientes e menos custosos aos indivíduos com TEA e para suas
famílias.

Palavras-chave: Autismo; privação materna; ácido valpróico; estresse oxidativo.

 ABSTRACT

Introduction: Autism Spectrum Disorder (ASD) is a complex and genetically

heterogeneous disorder characterized by impairment of social and communication
skills, as well as stereotyped behaviors and a restricted repertoire of interests and
activities. Studies show that ASD affects 1 in every 100 children worldwide with
prevalence in men at a rate of four times higher (4:1) than women. It presents
multifactorial etiopathogenesis resulting from the complex interaction between genetic
and environmental factors. This multiplicity of factors hinders the realization of its
pathophysiology. Studies have shown that gestational factors such as complications
during pregnancy, exposure to chemicals, maternal inflammatory process during
pregnancy, epigenetics, and mitochondrial dysfunction can affect neurodevelopment
and are associated with ASD. Objective: to characterize the effects of gestational
exposure to sodium valproate combined with maternal deprivation under behavioral,
inflammatory and oxidative stress parameters. Methodology: We used the animal
model of autism through chemical induction by administration of prenatal valproic acid
(APV) associated with maternal deprivation (MB) postnatal. On the twelfth day of
pregnancy (GD12), pregnant Wistar rats received 600mg/kg of VPA (VPA-exposed
group) or saline (SAL-exposed group) intraperitoneally. At birth, the VPA-exposed and
SAL-exposed offspring were subdivided into groups: I) "maternal deprivation" and II)
"maternal deprivation", to perform the experiment. Maternal deprivation occurred from
the 1st to the 10th postnatal day, during 3 h/day. The behavioral parameters of social
interaction and locomotor evaluation were evaluated on days 25 and 28 postnatal. On
the 30th postnatal day, the animals were euthanized and the brain removed for
isolation of cortex, prefrontal and cerebellum structures for analysis of oxidative stress
parameters. Results: The VPA model demonstrated significant changes in the social
interaction test, as observed in humans with ASD. In the molecular analysis, to identify
structural and functional impairment, the statistical data demonstrated that the
VPA+PM group presented significant changes in the levels of all oxidative stress
markers used dichloroidrofluorescein (DCF)carbonyl protein, sulfhydryl, nitric oxide
and decreased antioxidant defense of reduced glutathione (GSH) and superoxide
dismutase (SOD). Conclusion: the VPA+PM protocol proposed in this study proved
to be functional with the objectives outlined by the research. It presented itself as a
complex model and with amendments that persisted in youth. Future studies are
suggested for a better investigation of the physiological mechanisms promoted by the
association of the VPA+PM model. Thus, processes not yet understood can be
evaluated by directing more efficient and less costly treatment to individuals with ASD
and to their families.

Key-words: Autism; maternal deprivation; valproic acid; oxidative stress.

 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19
1.1 Transtorno do Espectro Autista - TEA ............................................................. 19

1.2 Neurodesenvolvimento e genética no TEA ...................................................... 23

1.3 Modelo animal de TEA por administração de Ácido Valproico (VPA) .............. 26

1.4 Privação Materna e alterações imunológicas .................................................. 29

1.5 Neuroglia, estresse oxidativo e neuropatologia ............................................... 33

1.6 Justificativa e relevância .................................................................................. 36

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 38
2.1 Objetivo geral................................................................................................... 38

2.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 38

3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 39

3.1 Aspectos Éticos ............................................................................................... 39

3.2 Protocolo de exposição ao VPA ...................................................................... 39

3.3 Protocolo de Privação Materna ........................................................................ 40

3.4 Desenho Experimental..................................................................................... 40

3.5 Avaliação comportamental............................................................................... 41

3.5.1 Teste de interação social .......................................................................... 41

3.5.2 Teste de locomoção .................................................................................. 42
3.6 Análises Bioquímicas ....................................................................................... 42

3.7 Avaliação de Estresse Oxidativo ..................................................................... 43

3.7.1 Formação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS: ............ 43

3.7.2 Determinação da concentração da 2',7'-diclorofluoresceína - DCF .......... 43
3.7.3 Determinação da concentração de Oxido Nítrico ...................................... 43
3.7.4 Oxidação de proteínas: concentração de Carbonil ................................... 44
3.7.5 Determinação da concentração de Sulfidrila (SH) .................................... 44
3.8 Defesas antioxidantes...................................................................................... 45

3.8.1 Atividade da Superóxido Dismutase (SOD) .............................................. 45

3.8.2 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) ................. 45
 3.8.3 Nível de proteínas totais............................................................................ 45
3.9. Análises Estatísticas ....................................................................................... 46

4 RESULTADOS....................................................................................................... 47
4.1 Avaliação Comportamental .............................................................................. 47

4.1.1 Teste da Interação Social .......................................................................... 47

4.1.2 Avaliação da atividade locomotora ............................................................ 48
4.2 Análise Bioquímica .......................................................................................... 48

4.2.1 Dano oxidativo .......................................................................................... 48

4.2.1.1 Concentração de DCF ............................................................................ 48
4.2.1.2 Concentração de Carbonil ...................................................................... 49
4.2.1.3 Concentração de Sulfidrila ..................................................................... 50
4.2.1.4 Concentração de Nitrito (NO2-) ............................................................... 51
4.3 Defesa Antioxidante ......................................................................................... 52

4.3.1 Concentração de glutationa reduzida (GSH) ............................................. 52

4.3.2 Concentração Superóxido Dismutase (SOD) ............................................ 53
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 54
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 64
REFERÊNCIAS......................................................................................................... 66
ANEXO A .................................................................................................................. 74
 19

1 INTRODUÇÃO

1.1 Transtorno do Espectro Autista - TEA

O termo “autismo” foi utilizado pela primeira vez por Bleuler em 1911, para
denominar pacientes com perda do contato com a realidade o que dificultava ou
mesmo impossibilitava sua comunicação, adiante, a primeira descrição da síndrome
foi feita por Leo Kanner, em 1943 (Bernardi et al., 2012; Masi et al., 2017).
Em seu estudo, Kanner, estabeleceu uma distinção entre essa síndrome
(Autismo), e a da "esquizofrenia infantil" observando nas crianças avaliadas extrema
incapacidade de se relacionar com outras, mais tarde, Hans Asperger (1944) publicou
um trabalho intitulado de "psicopatia autista" apontando dificuldades com a
comunicação não verbal e habilidades sociais relacionadas ampliando os conceitos
sobre o transtorno (Masi et al., 2017). Atualmente, o termo transtorno do espectro do
autismo (TEA) é usado para explicar a diversidade de sintomas que caracterizam essa
neuropatologia (Bossu, Roux, 2019).
O TEA é um distúrbio complexo e geneticamente heterogêneo (Griesi-
Oliveira, Sertie, 2017), caracterizado por comprometimento das habilidades sociais e
de comunicação, além de comportamentos estereotipados e um repertório restrito de
interesses e atividades. (APA, 2013; Lai et al., 2014; Baxter et al., 2015; Gomes et al.,
2015, Bossu, Roux, 2019). A detecção do transtorno ocorre na primeira infância, antes
dos três anos de idade com alguns sintomas perceptíveis entre os 6 e os 18 meses
de idade (Bernardi et al., 2012; Lyall et al., 2017).
Atualmente, o TEA ocupa o terceiro lugar entre os transtornos de
desenvolvimento infantil mais comuns (Schlickmann, Fortunato, 2013), apresentando-
se em três graus de gravidade: leve, moderado e severo (Hadjkacem et al., 2016).
Segundo Ferreira e De Oliveira (2016), trata-se de um transtorno com grande
implicação na funcionalidade diária do indivíduo, necessitando de um direcionando no
tratamento para a intervenção educativa e comportamental, de forma individualizada,
e intensiva.
Desde a descrição da síndrome, muitos debates ocorreram e, como diagnóstico
médico para autismo infantil, são utilizados os critérios descritos no Manual de
Diagnóstico e Estatístico da Associação Americana de Psiquiatria (DSM) (Bernardi et
al., 2012; Masi et al., 2017). As orientações diagnósticas do autismo foram descritas
 20

na DSM-3 – como subgrupo de transtorno invasivo do desenvolvimento, mais tarde,

na DSM-4 (1994) houve atualização do protocolo de avaliação, no qual, ocorreu a
separação da Síndrome de Asperger do grupo autista. E, no atual protocolo, a DSM-
5 (2013), o paciente com TEA pode ser classificado, segundo o grau de
comprometimento, em Nível 1- que requer suporte; Nível 2 – que requer suporte
substancial e Nível 3 - exigindo suporte muito substancial (Hadjkacem et al., 2016;
Masi et al., 2017). Conforme descrito anteriormente, os critérios para diagnostico do
TEA estão orientados no DSM-5 de 2013, sendo o diagnóstico de TEA
“essencialmente clínico”, feito a partir do cruzamento de informações colhidas através
da observação da criança, por entrevista com os pais e aplicação de instrumentos
específicos (APA, 2013; Gomes et al., 2015), e requer a presença do distúrbio em três
domínios: 1) interação social; 2) comunicação; 3) interesses restritos e padrões
estereotipados do comportamento (Schlickmann, Fortunato, 2013).
A partir dos avanços das ciências e a obtenção de maior conhecimento sobre a
doença, estudos epidemiológicos vêm demonstrando, um aumento drástico nas
últimas décadas (Posar, Visconti, 2017). Dados epidemiológicos mundiais sugerem
que um (1) para cada oitenta e oito (88) nascidos vivos apresentem TEA (Gomes et
al., 2015). Outros estudos mostram que o TEA afeta 1 em cada 100 crianças em todo
o mundo (Bossu, Roux, 2019), com prevalência quatro vezes maior em homens do
que em mulheres (4:1) (Chaste, Leboyer, 2012; Lai et al., 2014; Griesi-Oliveira, Sertie,
2017).
O Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) – EUA, publicou um
relatório apresentando os dados de 11 locais acompanhados pela Rede de
Monitoramento de Autismo e Deficiências do Desenvolvimento em 2012 (Yenkoyan et
al., 2017), no qual, identificou-se a prevalência do TEA de 1 em 69 crianças, para o
referido ano e de acordo com os achados pelo CDC, a expectativa do número de
casos pode ser maior (Christensen et al. 2018).
Os distúrbios do desenvolvimento exercem um impacto muito negativo na
integração de crianças na sociedade e sobre as vidas de toda a família dos indivíduos
afetados (Schlickmann, Fortunato, 2013). Ainda que hajam, grandes esforços em
pesquisas médicas, atualmente muitos aspectos da etiopatogenia do TEA ainda são
desconhecidos (Posar, Visconti, 2017).
TEA têm sua etiopatogenia multifatorial provinda da interação complexa entre
fatores genéticos e ambientais (Figura 1). Dos quais 35-40% se relacionam à genética
 21

e, 60-65% se devem a fatores ambientais desencadeadores em períodos pré-natais,

perinatais e pós-natais (Hadjkacem et al., 2016; Posar, Visconti, 2017). Mesmo
o autismo tendo forte componente genético, os fatores ambientais como toxinas,
pesticidas, infecções e drogas, conferem suscetibilidade ao autismo pela indução de
alterações epigenéticas (Nicolini, Fahnestock, 2018).

Figura 1: Correlação entre fatores contribuintes para o desenvolvimento do TEA. O esquema apresenta
os múltiplos fatores/eventos, pré-natais, genéticos e ambientais, e suas correlações enquanto
desencadeadores do TEA (adaptado). Fonte: Posar, Visconti (2017).

Segundo apontamentos de Lai et al. (2014), a multiplicidade de fatores que

levam ao desenvolvimento do TEA dificulta a concretização dos motivos reais de sua
fisiopatologia estando os esforços voltados para a compreensão dos mecanismos
iniciais de desenvolvimento da síndrome e quais intervenções devem ser feitas.
Outros estudos têm demonstrado que fatores gestacionais podem afetar o
neurodesenvolvimento, como complicações durante a gravidez e exposição a
produtos químicos (Lai et al., 2014). A exposição à agentes teratógenos, como a
talidomida e o ácido valproico (VPA), durante a gestação, no período em que ocorre
o fechamento do tubo neural e a produção dos primeiros neurônios que formam os
núcleos motores dos nervos cranianos, podem alterar o desenvolvimento do cérebro
e resultar em anormalidades comportamentais e déficits cognitivos, como observados
no autismo (Rice, Barone, 2000, Schlickmann, Fortunato, 2013). O processo
inflamatório materno durante a gestação (Figura 2), também tem sido descrito pela
 22

literatura, assim, a ativação do sistema imune materno parece desempenhar um papel

importante em transtornos do neurodesenvolvimento (Hadjkacem et al., 2016).

Figura 2: Representação esquemática do processo inflamatório durante a gravidez com ativação do

sistema imune fetal. Quando, os muitos componentes do sistema imunológico estão desregulados,
essas redes podem levar a mudanças no neurodesenvolvimento e no comportamento (adaptado). Na
imagem da esquerda, há ativação imune materna com produção de citocinas e mediadores da
inflamação ultrapassam a barreira hematoencefálica e no cérebro em desenvolvimento que podem
levar ao comprometimento do neurodesenvolvimento pela produção elevada de citocinas no SNC (à
esquerda). Fonte: Meltzer, Water (2017).

Respostas imunes alteradas estão presentes em crianças com TEA. Ashwood

et al. (2011), em seu estudo, descreveu a presença de anticorpos auto-reativos para
proteínas do sistema nervoso central (SNC) incluindo perfis de citocinas de células T
auxiliares anormais, baixa de linfócitos e desequilíbrio dos níveis séricos de
imunoglobulina em amostras cerebrais. Essas respostas imunes alteradas em
indivíduos com TEA foram acompanhadas por quase 40 anos (Ashwood et al. 2011).
Wong e Giulivi (2016), estudaram o comprometimento mitocondrial de linfócitos
de crianças com autismo. Segundo os autores, a disfunção mitocondrial é um dos
distúrbios metabólicos mais prevalentes associados ao TEA, apresentando alterações
nos processos ocorridos na cadeia respiratória. O estresse oxidativo decorrente do
desequilíbrio entre o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e
respostas antioxidantes podem causar danos ao mtDNA (Wong, Giulivi, 2016).
Substâncias químicas ambientais e drogas podem atravessar a placenta durante
a gravidez e interagir com alvos celulares fetais que provocam problemas tardios no
 23

desenvolvimento (Wong, Giulivi, 2016). Poluentes atmosféricos, principalmente

metais pesados e material particulado, desreguladores endócrinos, principalmente
pesticidas, estão descritos na literatura como contribuinte para o autismo (Posar,
Visconti, 2017). Segundo Posar, Visconti (2017), tais condições de poluição levam a
danos ao DNA, estresse oxidativo, aumento do cálcio intracelular, disfunção do
sistema imunológico e rompimento da barreira hematoencefálica.
Processos neuroinflamatórios induzidos durante o período pré-natal
permanecem alterados ao longo da patologia do autismo, e estudos tem observado
resposta inflamatória anormal à infecção de diferentes células sanguíneas de crianças
autistas (El-Ansary, Al Dera, 2016).

1.2 Neurodesenvolvimento e genética no TEA

Estudos indicam que, de fato, as regiões cerebrais envolvidas na gênese do TEA

tais como o sistema límbico, áreas pré-frontais e cerebelo, se desenvolvem mais
lentamente, estando mais vulneráveis à distúrbios do neurodesenvolvimento
(Schlickmann, Fortunato, 2013). Além disso, alterações fisiopatológicas do SNC de
pacientes com TEA também podem decorrer da influência ambiental causando
estresse oxidativo, neuroinflamação, disfunção mitocondrial e distúrbios bioquímicos
(Schlickmann, Fortunato, 2013).
Estudo clínicos e experimentais também demonstraram que infecções virais e
bacterianas ocorridas em período pré-natal podem interferir no ambiente intrauterino
promovendo alterações na resposta imune com ativação de citocinas pró-inflamatórias
(Schlickmann, Fortunato, 2013). As citocinas, por sua vez, atravessam a barreira
hematoencefálica, interagem com células neurogliais, induzindo neuroinflamação. De
fato, citocinas como Interleucina-1-beta (IL-1β), Interleucina-6 (IL-6) e Fator de
Necrose Tumoral alfa (TNF-α), apresentaram-se aumentados em pacientes autistas
(De Theije et.al, 2011; Yenkoyan et al. 2017).
Evidências têm demonstrado que fatores ambientais, como infecções ou o uso
de determinados medicamentos durante a gestação, contribuem para o
desenvolvimento do transtorno, porém, o fator hereditário apresenta-se em cerca de
50-90% dos casos demonstrando a importância dos fatores genéticos na patogênese
da doença (Griesi-Oliveira, Sertie, 2017).
 24

Estudos genéticos também têm demonstrado que alteração de genes

contribuem para o desenvolvimento do TEA (Schlickmann, Fortunato, 2013;
Hadjkacem et al., 2016). Existem evidências crescentes de que o TEA pode surgir de
mutações persistentes e desequilíbrios genômicos (Betancur, 2011).
Segundo Gupta e Stade (2006), muitos os avanços na pesquisa genética
envolvendo o autismo, como a identificação de alelos de risco ou mutações
representam um importante passo para desvendar a fisiopatologia do TEA; há um
esforço de contribuições combinadas de uma variedade de áreas, incluindo genética,
clínica, neurobiologia do desenvolvimento e neuroimagem. Descrevem ainda, dados
dos resultados de estudos de ligação genética, citogenéticos e de genes candidatos
com um foco no progresso de desenvolvimento de TEA (Gupta, State, 2006).
As anormalidades genéticas associadas com o TEA podem ser agrupadas em
três classes: i) mutações de um único gene (SHANK3, FMR1 ou MECP2.), (ii)
variantes do número de cópias (CNVs), por duplicações, grandes deleções, inversões
e translocações de cromossomos, e (iii) fatores de risco poligênicos, e desta forma,
cada uma contribui para uma parte do risco (Varghese et al., 2017).
De acordo com o estudo de Griesi-Oliveira, Sertie (2017), eventos de deleção e
duplicação representam risco de moderado a alto para desenvolvimento da doença e
estes, ocorrem em mais de 400 genes por diversas CNVs. O TEA pode fazer parte da
sintomatologia de alguns transtornos monogênicos (Griesi-Oliveira, Sertie, 2017,
p.235) (Tabela 1). Sanders e colaboradores, listaram as CNVs mais frequentes
encontradas em pacientes com TEA estando confirmadas em seis locos de risco:
1q21.1, 3q29, 7q11.23, 16p11.2, 15q11.2-13 e 22q11.2 (Sanders et al., 2015). Destas
CNVs as 15q11-13, 16p11 e 22q11-13, juntas, têm incidência de 3-5% (Betancur,
2011; Griesi-Oliveira, Sertie, 2017). Essas variações genéticas conferem
vulnerabilidade a estressores ambientais (Bernardi et al., 2012).
A região do cromossomo 15q11-q13 contém um número de genes que codificam
para as subunidades particulares do ácido gama-aminobutírico-A (GABAA) e CNVs de
microdeleção / microduplicação foram observados no autismo (Coghlan et al., 2012).
As alterações estão presentes no lócus GABRB3 que codifica o receptor de ácido
gama-aminobutírico (GABA) (Gupta, State, 2006).
 25

Tabela 1: Síndromes monogênicas* associadas ao transtorno do espectro autista e a genes

correspondentes.

Síndrome Gene mutado

**Síndrome do X frágil FMR1
**Síndrome de Rett MECP2
**Síndrome de Cowden PTEN
Neurofibromatose NF1
Esclerose tuberosa TSC1/2
Síndrome de Angelman UBE3A (15q11-q13)

**A identificação das três síndromes listadas refere-se a alta prevalência entre indivíduos com TEA.
Fonte: Adaptado de Griesi-Oliveira, Sertie (2017).

No estudo de Betancur (2011), pode-se encontrar a lista ampla com 100 genes
descritos correlacionados ao TEA. No estudo de Varghese et al. (2017), pode-se
encontrar uma revisão ampla apresentando as variáveis que corroboram para o
desenvolvimento do TEA, os intervenientes neuropatológicos e o uso de modelos
animais correspondentes às diferentes frentes de pesquisas de cunho epigenético e
ambiental.
Ao acompanhar o esquema do quadro (Figura 3), identifica-se da 1ª a 20ª
semana de gestação, como “períodos mais críticos” por envolver três estágios
importantes do SNC: a neurogênese, a migração neuronal e a maturação neuronal.
Fica evidenciado que, se neste período, qualquer agente pode causar injúria ao SNC,
o indivíduo terá seu neurodesenvolvimento comprometido. Períodos de maior risco na
gravidez têm resultados variáveis, mas tendem a se reunir na primeira metade da
gravidez (Lyall et al., 2014).
 26

Figura 3: Quadro apresentando estágios de desenvolvimentos e fatores ambientais associados ao

Transtorno do Espectro Autista. Os fatores ambientais descritos foram identificados por Lyall et al.
(2014). Os autores realizaram um levantamento dos diversos fatores que de forma direta ou indireta
conduzem ao Transtorno do espectro autista. De acordo com o estudo, em indivíduos com transtornos
do espectro autista encontraram-se evidências de neurogênese desregulada, migração neuronal e
maturação neuronal. Se a exposição a substâncias tóxicas ambientais coincidirem com a ontogênese
dos processos de desenvolvimento do SNC, há maior probabilidade de causar efeitos adversos pois,
irão interferir na cascata desses processos tornando o indivíduo vulnerável a perturbações na infância
e na vida adulta (adaptado). Fonte: Lyall et al. (2014).

Diferentes domínios comportamentais como as funções cognitivas, sensoriais e

motoras são promovidos por diferentes áreas cerebrais estando os distúrbios clínicos,
por exemplo, esquizofrenia, dislexia, epilepsia e autismo, como resultado da
interferência na ontogênese normal dos processos de desenvolvimento no sistema
nervoso (Rice, Barone, 2000).

1.3 Modelo animal de TEA por administração de Ácido Valproico (VPA)

Com o avanço das ciências e dos protocolos de pesquisas, diversos estudos têm
utilizado modelos animais para melhor compreender as causas e consequências do
autismo, e para isto, os modelos animais devem ser qualificados em critérios como: I)
constructo - verifica o grau de similaridade entre os mecanismos subjacentes aos
modelos animais e a doença humana; II) face – verifica se o aspecto fenomenológico
observado em animais é semelhante ao observado em pacientes; III) validade
preditiva – avalia se o modelo animal demonstra resposta similar à que os humanos
 27

têm na redução de sintomas após a administração de medicação específica(Yenkoyan

et al. 2017).
O TEA ainda tem sua etiologia desconhecida, tais modelos são importantes
ferramentas de estudo científico, pois permitem a análise minuciosa dos mecanismos
fisiopatológicos que desencadeiam as alterações comportamentais, neurais, imunes
e genéticas encontradas em pacientes autistas (Bernardi et al., 2012). O modelo
animal para TEA é construído a partir da intervenção a que ele será submetido, ficando
subdividido em grupos: agentes biológicos; agentes químicos; modelos induzidos por
lesão/dano cerebral; modelos induzidos por modificações genéticas (Yenkoyan et al.
2017).
Fazendo parte do grupo de agentes químicos, o modelo animal de TEA por
administração gestacional de VPA é um dos mais utilizados no campo científico
(Mabunga et al., 2015). O VPA é um agente teratogênico que promove anormalidades
comportamentais tornando-se um dos agentes ambientais ligados ao TEA, que vem
sendo largamente estudado (Schlickmann, Fortunato, 2013). As anormalidades são
decorrentes de malformações congênitas, síndromes perinatais e transtornos no
neurodesenvolvimento (Christensen et al., 2013; Schlickmann, Fortunato, 2013); e
defeitos do tubo neural (Roullet et al., 2013).
As vias afetadas pelo VPA e seu suposto mecanismo incluem o estresse
oxidativo, a inibição da histona desacetilase, o desequilíbrio excitatório / inibitório e a
hiperserotonemia (Mabunga et al., 2015). Vários estudos em modelo animal com
administração de valproato, em vários estágios da gravidez, descrevem
manifestações do autismo como: aumento da atividade repetitiva ou estereotipada,
maior ansiedade e diminuição do nível de interação social (Christensen et al., 2013).
Segundo estudos, ratos expostos ao VPA no dia 12,5 da gestação exibem várias
anormalidades anatômicas no tronco encefálico e no cerebelo (Schneider et al.,
2006).
O VPA é um anticonvulsivante utilizado em casos de epilepsia e também como
estabilizador do humor, sua principal ação é aumentar no nível do (GABA) no cérebro
(Schlickmann, Fortunato, 2013). O GABA regula a migração, diferenciação, morte
celular, e ainda, a formação das sinapses (Coghlan et al., 2012). O GABA é o principal
neurotransmissor inibitório no cérebro humano, ele é sintetizado a partir do glutamato,
um neurotransmissor excitatório através da ação de enzimas glutamato
descarboxilase (GAD65 e GAD67), portanto, alterações na produção e ou na reciclagem
 28

do GABA podem levar a quadros de defeito de circuito comum do equilíbrio excitatório-

inibitório e, de acordo com a literatura, estudos evidenciaram padrões anormais de
expressão dos genes do receptor GABA-A, das enzimas de síntese GABA - GAD65 e
GAD67 (Coghlan et al., 2012).
Alterações no metabolismo da serotonina sugerem relação com o
desenvolvimento do autismo (Lai et al., 2014). Estudos demonstraram que a
hiperserotonemia relacionada ao TEA seja proveniente de doenças genéticas,
gastrointestinais ou imunológicas (De Theije et.al, 2011). A serotonina é um
neurotransmissor e mediador da inflamação que tem sido relacionada aos estudos na
patogênese do TEA, uma vez, que os níveis aumentados de serotonina no sangue (5-
hidroxitriptamina; 5-HT) foram descritos em crianças com autismo (De Theije et.al,
2011).
Segundo estudos, mulheres que fizerem uso do VPA durante os dias 20-24 de
gestação apresentaram prole susceptível a distúrbios de desenvolvimento
neurológico, afetando as funções cognitiva e comportamental, semelhante às
apresentadas no TEA (Rice, Barone, 2000). A exposição durante a gestação ao VPA,
mas não a outros tratamentos antiepilépticos, quase triplica o risco de ter um filho com
TEA (Varghese et al., 2017). De acordo com Rice e Barone (2000), a vulnerabilidade
do cérebro em desenvolvimento depende de dois problemas de exposição de
significância: 1) se um agente ou metabólito ativo atingir o sistema nervoso em
desenvolvimento; 2) em qual período ocorreu a exposição.
Ao utilizar um modelo animal de estudos, é de fundamental importância que se
tenha uma boa compreensão das linhas temporais de desenvolvimento neural normal
em humanos e das outras espécies usadas como modelo (Rice, Barone, 2000).
Schlickmann e Fortunato (2013), realizaram um estudo revisional para modelo animal
e o uso de VPA, descrevendo três formas de administração e dosagem da substância.
Para administração, os procedimentos foram realizados na via subcutânea (SC);
intraperitoneal (IP) e via oral (VO), utilizando diferentes dosagens de VPA, incluindo
400 mg/kg (SC), 500 mg/kg (IP), 600 mg/kg (IP) e 800 mg/kg (IP). Para cada dosagem
e via de administração foram observados efeitos diferentes para o modelo proposto
(Schlickmann, Fortunato, 2013). Regiões cerebrais específicas podem ser mais
suscetíveis a danos durante o neurodesenvolvimento após a exposição ao VPA
(Roullet et al., 2013).
 29

Em resumo, o protocolo para modelo animal de TEA consiste na formação de

dois grupos, no qual se administra em ratas prenhas, VPA em um grupo e salina (SAL)
no grupo (controle), no dia gestacional (GD) 12,5. As doses podem variar de 400 a
600 mg/kg. Os animais validados para modelo de TEA serão as proles, que passarão
por testes visando avaliar o comprometimento e ou à melhora a partir do tratamento
proposto (Olexová et al., 2013; Cezar et al., 2018).

1.4 Privação Materna e alterações imunológicas

O cuidado parental é um comportamento fortemente estabelecido em roedores,

sendo essencial para o desenvolvimento saudável da prole (Varela, 2018). O
ambiente ao qual um indivíduo é exposto no início da vida influencia fortemente o
desenvolvimento de respostas comportamentais na idade adulta (Weiss et.al, 2011).
De acordo com Lehmann e Feldon (2000), filhotes de mamíferos apresentam
alta dependência de cuidados maternos durante os primeiros dias e ou semanas de
vida, desta forma, este período se torna crítico e as mudanças nas interações mãe-
filhote produzem efeitos negativos no desenvolvimento normal que podem perdurar
ao longo da vida do animal.
Estudos clínicos fornecem evidências de que fatores prejudiciais, como abuso
ou trauma precoce podem ter um impacto severo nos comportamentos e, continuam
afetando os indivíduos durante e ao longo da vida adulta (Weiss et.al, 2011). A
plasticidade cerebral é altamente sensível ao estresse, tais estressores com
exposição aguda ou crônica, podem diminuir a plasticidade do cérebro (Herpfer et al.,
2012).
O cérebro se desenvolve durante a gestação e continua nos períodos pós-natal,
adolescência e idade adulta, quando a maturidade cerebral é atingida (estes são
chamados períodos críticos), nos quais, o desenvolvimento em cada fase, ocorre de
forma diferente no cérebro ou sistemas de neurotransmissores tornando estes
períodos os de maior vulnerabilidade a insultos específicos para cada região cerebral
(Marco et al., 2015).
Desde o início da vida os seres vivos estão constantemente expostos ao
estresse, seja por condições agradáveis ou desagradáveis e os tipos de estresse
ocorrem nas formas físicas ou psicológicas, agudas ou crônicas e apresentam efeitos
diferentes em cada situação (Webster et al., 2008). Em cada experiência vivida há um
 30

limiar de estresse, que quando excedido, ocasiona o aumento temporário desse limiar
e leva o corpo/cérebro a responder fisiologicamente diferente à cada situação, neste
sentido, parafraseando Seyle (1976), o estresse pode ser definido como “resposta
inespecífica do corpo a qualquer exigência feita a ele, ou seja, a taxa na qual se vive
a qualquer momento”.
Para identificar e compreender os efeitos de eventos estressores ocorridos nos
primeiros dias e nas primeiras semanas de vida de roedores, as pesquisas têm feito
uso do modelo de Privação Materna (PM). De acordo com Silva (2017), a PM é um
modelo de estudos utilizado para induzir comportamentos depressivos em roedores e
também para estudar os efeitos de estresse precoce e seu impacto no
desenvolvimento.
A PM ou separação materna foi introduzida em 1956, por Levine et al., e desde
então, os estudos têm demonstrado que este tipo de privação produz efeitos
neuroendócrinos e comportamentais relativamente consistentes e identificáveis no
animal adulto (Lehmann, Feldon, 2000). A compreensão dos efeitos fisiológicos e das
mudanças comportamentais a partir de estudos com roedores submetidos à PM
podem contribuir para o maior entendimento dos distúrbios psiquiátricos e auxiliar na
indicação de tratamentos mais efetivos (Ignácio et al., 2017).
A PM neonatal é um evento estressante, de caráter ambiental, capaz de
desencadear alterações estruturais e neurobiológicas no desenvolvimento do SNC
durante a diferenciação celular migratória e proliferativa (Czarnabay et al., 2019). Para
induzir tais alterações, o protocolo de PM consiste em separar a mãe da ninhada
durante 3h por dia, do dia pós-natal 1 (DPN 1) ao 10 (DPN 10), e desta forma, não
requer a manipulação dos filhotes (Réus et al., 2017; Giridharan et al. 2019).
Boku et al. (2015), identificaram que a PM, altera fenótipos comportamentais
relacionados a distúrbios neuropsiquiátricos. Ménard et al. (2017), descreveu em seu
trabalho que o acometimento a eventos adversos nas fases iniciais do
desenvolvimento de roedores, promovem alterações em diversos circuitos neurais que
persistem na idade adulta e que o estresse precipita eventos inflamatórios no SNC.
No estudo de Réus et al. (2017), os resultados mostraram que eventos estressantes
“críticos”, no início da vida induzem alterações no comportamento que persistem na
idade adulta; estimulam a inflamação e o dano oxidativo no SNC e Sistema Nervoso
Periférico (SNP).
 31

No trabalho de Lehmann e Feldon (2000), os autores relataram a existência de

inúmeras evidências sobre as consequências neuroendócrinas a curto e longo prazo
advindas da PM, especificamente ao eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (ΗΡΑ). No
estudo de Weiss et.al (2011), foram identificadas alterações do sistema imunológico
e aumento da morte celular neuronal.
O SNC é complexo e sua perfeita homeostase se dá pela conexão e integração
entre suas diferentes áreas, neste sentido, Ignácio et al. (2017) propuseram um
esquema descrevendo a correlação do eixo HPA e as respostas fisiológicas do
estresse decorrentes da PM nos primeiros dias de vida (figura 4).

Figura 4: Estresse por privação materna e alterações fisiológicas. O eixo HPA interage com outros
processos fisiológicos, como ativação epigenética levando a alterações na expressão de moléculas
envolvidas em funções específicas. Outra correlação se dá aos fatores de transcrição promovido pelo
aumento da produção de glicorticóides, isso potencializa a ativação imunológica e eleva a expressão
de interleucinas inflamatórias no plasma e em regiões cerebrais responsável pelas emoções e
comportamento (sistema límbico). Ademais, os efeitos inflamatórios crônicos e alterações metabólicas
advindos de falhas em processos mitocondriais elevam a produção de espécies reativas de oxigênio
(ERO) aumentando os efeitos negativos e danos ao cérebro (adaptado). Fonte: Ignácio et al. (2017).

Ao ser acometido por um estressor o eixo HPA e o sistema nervoso simpático

são ativados provocando uma cascata de eventos conforme descrito por Glaser;
Kiecolt-Glaser (2005), a modulação da resposta hormonal associada ao estresse pelo
SNC tem início com a excitação da glândula pituitária, liberação do hormônio
adrenocorticotrópico que estimula a glândula adrenal a produzir hormônios
glicocorticoides e catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) que irão modular
mecanismos do sistema imunológico.
De forma direta, o sistema nervoso simpático também pode estimular a glândula
adrenal e/ou órgãos linfoides provocando interações bidirecionais. Essa modulação
ativa as células imunológicas fazendo com que elas produzam citocinas em nível
 32

periférico e que também podem ultrapassar a barreira hematoencefálica e modular a

atividade do hipotálamo potencializando o efeito estressante (Glaser; Kiecolt-Glaser,
2005).
Conforme já discutido anteriormente, injúria, estressor, alterações metabólicas e
inflamação acometidos ao cérebro (figura 5), promovem excitação das células gliais
que, por sua vez, irão expressar citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6, estas
citocinas irão ativar granulócitos, monócitos/macrófagos, Natural Killer e células T,
todo este conjunto de eventos, juntos, contribuem para a fisiopatologia da
neuroinflamação (Glaser e Kiecolt-Glaser, 2005; Singhal et al., 2014; Ignácio et al.,
2017).

Figura 5: Hipótese de citocinas de neuroinflamação: implicações na comorbidade de doenças

sistêmicas com transtornos psiquiátricos. Condições que acometem injúrias ao SNC levam a produção
de citocinas. Estas citocinas irão estimular a ativação dos mecanismos de defesa, que por sua vez,
também irão produzir mediadores da inflamação. Esse processo conduz ao estado cada vez mais
citotóxico no cérebro, de neurodegeneração e de desordens psiquiátricas. Fonte: Singhal et al. (2014).

Yenkoyan et al. (2017), fizeram uma revisão discutindo as teorias modernas

sobre a fisiopatologia do TEA apontando como contribuintes os defeitos na
conectividade neural e migração neural prejudicada o que pode levar à maturação
ruim do cérebro. Estes mesmos achados também são identificados e estão
associados ao protocolo de PM, que induz processo inflamatório e distúrbios
neuropsiquiátricos.
 33

1.5 Neuroglia, estresse oxidativo e neuropatologia

O SNC é complexo, formado por um emaranhado de células que desempenham

papéis crucias à manutenção e correto funcionamento deste sistema. As células da
glia são as mais abundantes e estão amplamente distribuídas no SNC interagindo
com neurônios, células imunológicas e vasos sanguíneos (Yang, Zhou, 2019). Os
tipos celulares da glia encontrados são astrócitos, oligodendrócitos e seus precursores
(NG2-glia ou OPCs), e micróglia, estas células não geram impulsos nervosos, não
formam sinapses, porém, mantêm funções cerebrais vitais (Morrens et al., 2012;
Bronzuoli et al., 2018). Os tipos celulares estão comentados abaixo.
A microglia é uma população de células independente e auto renovadora
(Butovsky, Weiner, 2018), tem importante função no desenvolvimento cerebral
incluindo crescimento axonal, sobrevivência e apoptose neuronal, migração de
neurônios, maturação e poda sináptica (Giridharan et al. 2019), fagocitando conexões
e axônios sinápticos inadequados (Butovsky, Weiner, 2018).
As microglias exibem plasticidade fenotípica e funcional em cérebros saudáveis
e doentes (Butovsky, Weiner, 2018), neste sentido, algumas células da glia funcionam
como células imunes inatas do SNC contribuindo para o monitoramento do meio
fisiológico e agem como primeira linha de defesa quando o SNC é acometido a insultos
(Yang, Zhou, 2019).
Os oligodendrócitos são células mielinizantes do SNC e parte integrante da
substância branca do cérebro, cuja as funções da mielina, são fornecimento de
isolamento crítico axonal, para permitir velocidades de condução saltatória mais
rápidas (Haroon et al., 2017), de potenciais de ação através dos fluxos de íons de
sódio nos nós de Ranvier; contribuir para a sinalização neuronal; fornece suporte
trófico aos neurônios, aos axônios e apresenta papel crítico quando ocorre
desregulação imunológica em nível do tecido da substância branca (Goldman,
Kuypers, 2015).
O antígeno nervoso glial 2 (NG2-glia) ou células progenitoras de
oligodendrócitos (OPCs) estão presentes em todas as regiões do cérebro na
substância cinzenta e branca, durante o desenvolvimento pós-natal e na idade adulta.
As células que expressam NG2 podem gerar não apenas oligodendrócitos, mas
também astrócitos, demonstrando que a expressão de NG2 é característica comum a
 34

todas as células (Dimou e Gallo, 2015). Ainda no mesmo estudo, os autores Dimou e
Gallo (2015), descrevem a relação sináptica entre neurônio-glia como indefinida,
porém, essa sinalização mediada por neurotransmissores entre neurônios e NG2-glia
parecem modular o desenvolvimento dessas células da glia.
Os processos microgliais são altamente ativos, examinando continuamente o
microambiente do parênquima, ainda que, no estado de repouso (Morrens et al., 2012;
Yang, Zhou, 2019). A Micróglia é a célula imune inata residente e a mais móvel no
SNC, semelhante aos macrófagos do sangue periférico e, quando ativadas,
aumentam a expressão gênica inflamatória secretando citocinas IL-1β, TNF, IL-6, IL-
12 e IFN-γ; mudam de forma; assumem perfil fagocítico e se movem em direção a
regiões de lesão (Haroon et al., 2017).
Os astrócitos são células multiramificadas em formato de estrela, cuja morfologia
e funções mudam variando a especialização e diferenciação em resposta a demandas
fisiológicas e patológicas (Haroon et al., 2017). São células que se encontram em
íntimo contato com as células do SNC, como os neurônios, oligodendrócitos e com
outros astrócitos. Além disso, controlam o metabolismo dos neurônios, participam da
captação e liberação de diversos neurotransmissores, atuam na manutenção dos
níveis iônicos do meio extracelular, participam da formação da barreira
hematoencefálica, entre outras funções essenciais para a homeostase do SNC (Silva,
2017; Yang, Zhou, 2019).
Tal discussão é importante, pois alterações na funcionalidade destas células
levam ao comprometimento do funcionamento cerebral, instalação e ou agravo de
patologias. Contudo, as respostas imunológicas no SNC são reguladas pela micróglia
e astrócitos, os quais desempenham papéis inflamatórios e anti-inflamatórios (Silva,
2017). Porém, a neuroinflamação não é uma resposta simples, diferentes sinais
inflamatórios por infecção, dano mecânico, metabólitos tóxicos ou autoimunidade
promovem uma variabilidade ampla de respostas e adaptações (Yang, Zhou, 2019).
Haroon et al. (2017), verificaram que a ativação das células imunes no cérebro
produz um efeito excitotóxico, podendo conduzir à disfunção sináptica, à morte, a
deficiências comportamentais e cognitivas. Evidências atuais sobre a fisiologia glial
no SNC, tanto em desenvolvimento quanto maduro, sugerem que alterações nas
funções das células glias contribuem para o desenvolvimento de neuropatologias
(Bronzuoli et al., 2018).
 35

A formação de sinapse desarranjada, por falha astrocítica, também foi implicada

em vários distúrbios do desenvolvimento neurológico, incluindo esquizofrenia, autismo
e síndrome do X frágil (Haroon et al., 2017). O papel da micróglia na escultura e na
regulação das sinapses neuronais sugere que a disfunção microglial contribui para o
TEA (Butovsky, Weiner, 2018).
Estudos com modelo animal de PM têm demonstrado ativação microglial com
aumento do estresse oxidativo podendo culminar em alterações comportamentais
prejudiciais que persistem na idade adulta (Ignácio et al., 2017; Réus et al., 2017).
Estudos recentes têm destacado a contribuição da neuroglia para a fisiopatologia do
TEA (Bronzuoli et al., 2018).
O estresse oxidativo é definido como o desequilíbrio entre processos
bioquímicos que levam à produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e os
responsáveis por sua remoção, a chamada cascata antioxidante (Sayre et al., 2008).
O desequilíbrio entre formação e remoção originou o termo “estresse oxidativo”
(Hawkins, Davies, 2019).
A ativação crônica de micróglia e astrócitos geram espécies reativas de oxigênio
(ERO) e espécies reativas nitrogênio (ERN), e quando a produção supera as defesas
antioxidantes elas culminam em estresse oxidativo no SNC (Ignácio et al., 2017). O
SNC é particularmente vulnerável ao insulto oxidativo devido à alta taxa de utilização
de O2 para a produção de energia (Sayre et al., 2008), e consequentemente há
produção de radicais livres.
A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo o radical
superóxido, podem resultar em inflamação (Perry et al., 2010), e o radical hidroxila é
considerado o principal instigador dos danos causados pelo estresse oxidativo (Sayre
et al., 2008). Porém, não apenas as ERO e ERN de origem microglial criam um
estresse sobre os neurônios do ambiente, mas, em oposto, os oxidantes podem
estimular a transcrição de genes pró-inflamatórios na glia, criando um ciclo vicioso
(Sayre et al., 2008).
O mecanismo de proteção é constituído por dois tipos de componentes, um
enzimático e o outro não enzimático; no primeiro, a superóxido dismutase (SOD), a
catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GSH-Px), agem na captura de radicais
superóxido e hidroxila (SOD e CAT) ou na destruição de peróxidos orgânicos
produzidos pelos ácidos graxos; e no segundo, a glutationa (GSH) e a vitamina E
agem como “eliminador” de radicais livres (Ortiz et al., 2017).
 36

Figura 6: Produção de ERO e efeitos patológicos provocado pelo desequilíbrio redox nas células.
A produção de ERO é inerente ao processo de produção de energia. A manutenção da homeostase
redox é feita por sistemas enzimáticos especializados que promovem a remoção destas substâncias.
Porém, quando há produção excessiva ou remoção inadequada o resultado é cúmulo de radicais livres
na célula. Esse acúmulo conduz a lesão de lipídios (por peroxidação), proteínas e DNA, resultando em
lesão celular (Adaptado). Fonte: Kumar et al., Robins-Patologia Básica, ed. 9. 2013. Pág. 15.

Em homeostase, as ERO são produzidas em pequenas quantidades, em todas

as células, durante as reações de oxidação; as células imunológicas são responsáveis
por sua produção, especialmente neutrófilos e macrófagos através dos fagossomas e
fagolisossomas leucocitários, deste modo, quando a produção de ERO aumenta ou
quando os sistemas de remoção são ineficientes, o resultado é o excesso desses
radicais livres levando a condição chamada de estresse oxidativo (Kumar et al., 2013),
o processo está demonstrado na fig. 6.

1.6 Justificativa e relevância

Considerando a enorme prevalência do TEA na atualidade, sendo um dos

transtornos de neurodesenvolvimento mais comuns, ainda, pouco se sabe a respeito
das suas causas e da sua fisiopatologia. Estudos em humanos, apresentam diversas
limitações como os métodos de investigação neurofisiológica, que oferecem apenas
dados indiretos e inespecíficos acerca do equilíbrio excitatório/inibitório do SNC.
Neste sentido, a utilização de modelos animais torna factível o estudo das
alterações comportamentais encontradas no TEA, sua relação com a exposição pré-
natal a intoxicantes e agentes ambientais permitindo ainda o estudo direto dos
mecanismos bioquímicos relacionados. Como qualquer outro modelo animal de
desordens neurológicas, os modelos animais de TEA foram desenvolvidos para obter
uma visão e fazer previsões da condição de TEA humana.
 37

O modelo animal de exposição ao VPA pré-natal mostra-se relevante por abordar

um agente químico associado epidemiologicamente a etiologia do transtorno, que
consegue promover o surgimento de alguns fenômenos bioquímicos e
comportamentais do TEA. No entanto, tal modelo não contempla as questões
inflamatórias e o desbalanço de neurotransmissores glutamatérgicos e
serotoninérgicos associados ao transtorno. Paralelamente, animais submetidos ao
modelo animal de PM – utilizado para estudar o efeito de eventos estressores
precoces no desenvolvimento da depressão – apresentam potencialmente a ativação
dos receptores de glutamato, bem como, há um aumento nos marcadores
inflamatórios.
Devido às limitações de reprodutibilidade do modelo animal com VPA (pré-natal),
acredita-se que a união de tal protocolo ao de PM (que mimetiza muitos dos aspectos
fisiopatológicos do TEA) resultará em um modelo animal de TEA mais complexo, com
maior reprodutibilidade e potencialmente com uma gama maior de fenótipos e
mecanismos fisiopatológicos contemplados.
Assim, percebe-se a necessidade deste estudo, onde a avaliação
comportamental e de marcadores de estresse oxidativo permite caracterizar e
compreender um modelo animal de TEA adequado e, consequentemente, avançar na
compreensão da complexa fisiopatologia do TEA abrindo possibilidades terapêuticas
futuras.
 38

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Caracterizar os efeitos da exposição gestacional ao valproato de sódio

combinado à privação materna sob parâmetros comportamentais e de estresse
oxidativo em um modelo animal murino de transtorno do espectro autista.

2.2 Objetivos específicos

• Avaliar o comportamento do tipo autista nos dias 25 e 28 pós-natal (DPN 25 e

DPN 28), através de testes de avaliação da locomoção, comportamentos
repetitivos, e de interação social, em ratos machos expostos ao valproato de
sódio (pré-natal) e submetidos a privação materna (pós-natal).
• Avaliar parâmetros de dano oxidativo (níveis de TBARS e carbonil, oxido
nítrico, sulfidrila) em córtex pré-frontal, córtex posterior e cerebelo de ratos
machos expostos ao valproato de sódio (pré-natal) e submetidos a privação
materna (pós-natal).
• Avaliar parâmetros de defesa antioxidantes (atividade das enzimas glutationa
e superóxido dismutase) em córtex pré-frontal, córtex posterior e cerebelo de
ratos machos expostos ao valproato de sódio (pré-natal) e submetidos a
privação materna (pós-natal).
 39

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Aspectos Éticos

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram realizados de

acordo com as recomendações internacionais para o cuidado e o uso de animais de
laboratório, além das recomendações da Sociedade Brasileira de Neurociências e
Comportamento para cuidados com animais. Este estudo foi submetido à avaliação
do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade do Extremo Sul
Catarinense (UNESC) e aprovado sob protocolo número 035/2019-1 (ANEXO A).

3.2 Protocolo de exposição ao VPA

Foram utilizadas 12 ratas Wistar fêmeas adultas (60 dias/400g) e 6 machos para
acasalamento, provenientes do Biotério Central da UNESC. As fêmeas foram
colocadas ao final de um período de vigília em caixas contendo machos (3
animais/gaiola – 2 fêmeas/macho), com condição controlada de temperatura (22 ±
1ºC) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 horas, fase clara das 7h às 19h), e com
acesso ad libitum a alimento e água. As fêmeas com conteúdo seminal positivo
(matrizes) foram divididas em dois grupos ficando alocadas em caixas individuais
durante o restante do período gestacional.
No décimo segundo dia de gestação, as matrizes foram divididas em dois grupos
(6 cada), onde receberam 600mg/kg de VPA (grupo VPA-expostos) ou salina (grupo
SAL-expostos), via intraperitoneal.
Após o nascimento, as proles das matrizes VPA-expostos (6 matrizes) e SAL-
expostos (6 matrizes) foram subdivididos em dois grupos cada - I) “privação materna”
e II) “sem-privação materna” - compondo 4 subgrupos para a realização do
experimento:
• Grupo 1: SAL-expostos + não privados (n=12);
• Grupo 2: SAL- expostos + privação materna (n=12);
• Grupo 3: VPA-expostos + não privados (n=12);
• Grupo 4: VPA-expostos + privação materna (n=12).
 40

3.3 Protocolo de Privação Materna

O protocolo de PM constitui em retirar a mãe da caixa original e levá-la para outra

sala. Os filhotes são mantidos em suas gaiolas (agrupados no ninho na presença de
odor materno). Do 1º ao 10º dia pós-natal os filhotes foram privados da mãe durante
3 horas por dia, sendo este procedimento realizado durante as manhãs das 08h às
12h. No final de cada sessão diária de privação, as mães foram devolvidas às caixas.
Os animais (ratos) controle permaneceram em suas caixas junto com suas mães
durante todo o experimento. Os ratos foram desmamados no 21º dia após o período
pré-natal. Em consideração aos dados epidemiológicos de prevalência de TEA em
homens (diferença 4:1 homens/mulher), somete os ratos machos foram utilizados
neste estudo.

3.4 Desenho Experimental

No décimo segundo dia de gestação (DG12), as matrizes receberam 600mg/kg

de VPA (grupo VPA-expostos) ou salina (grupo SAL-expostos), via intraperitoneal
para indução do modelo animal murino de transtorno do espectro autista. Após o
nascimento, as proles VPA-expostos e SAL-expostos foram subdivididos em dois
grupos cada - I) “privação materna” e II) “sem-privação materna” - compondo 4
subgrupos para a realização do experimento com n= 48 animais:
• Grupo 1: animais que receberam salina na gestação e não foram privados da
presença materna (n=12, machos);
• Grupo 2: animais que receberam salina na gestação e foram privados da presença
materna (n=12, machos);
• Grupo 3: animais que receberam VPA na gestação e não foram privados da
presença materna (n=12, machos);
• Grupo 4: animais que receberam VPA na gestação e foram privados da presença
materna (n=12, machos).

Após o protocolo de PM (do 1º ao 10º dia pós-natal), os grupos de animais

privados e não privados (controles) foram submetidos a testes comportamentais e
posteriormente, às análises bioquímicas. No DPN 25 e DPN 28, os filhotes machos
foram submetidos aos testes comportamentais (n=12 por grupo, 4 grupos x 2
 41

(machos) = 48 animais) para avaliar a presença de comportamentos repetitivos,

locomoção e interação social.
Após a conclusão dos testes comportamentais, DPN 30, os ratos foram
eutanasiados e seus cérebros removidos para a dissecção das estruturas: córtex
posterior, córtex pré-frontal e cerebelo, sendo processados e utilizados para as
análises bioquímicas. Conforme já citado, somete os machos foram utilizados neste
estudo.

Figura 7: Representação esquemática do desenho experimental - matrizes VPA / SAL. Confirmação

da gestação, administração de VPA no DG 12 e constituição da prole como modelo animal murino de
TEA.

Figura 8: Representação esquemática do desenho experimental modelo animal murino de TEA: VPA
+ PM. Divisão dos grupos de estudo; protocolo de privação materna (PM), testes comportamentais e
análise molecular.

3.5 Avaliação comportamental

3.5.1 Teste de interação social

No DPN 25, os ratos (n=12), foram submetidos ao teste de interação social. O

teste se baseia na tendência natural que os roedores tem de investigar animais
considerados desconhecidos, intrusos. Os animais foram levados individualmente a
 42

interagir com outro rato desconhecido do mesmo sexo em uma caixa de acrílico (60 x
60 x 30mcm). A análise consistiu na quantificação do tempo de interação do modelo
experimental abrangendo os episódios de grooming, cheirar, seguir, chutar, socar,
montar ou permitir a monta. Os ratos foram pareados e inseridos na área de testes
por 10 minutos.

3.5.2 Teste de locomoção

No DPN 28, os ratos (n=12), foram submetidos ao teste locomotor. A atividade

motora foi medida, colocando os animais individualmente, em gaiola de atividade
animal - câmara (41x41x33 cm) (Multiple Activity Cage; Ugo Basile®), que consiste em
uma Gaiola Animal de Perspex claro, completa com dois conjuntos de matrizes
emissor/sensor, equipadas com monitores infravermelhos para atividade horizontal e
vertical. O experimento ocorreu em uma sala experimental iluminada e silenciosa. A
avaliação da atividade motora foi definida como a contagem horizontal do número total
de feixes cruzados. Os dados de velocidade, distância e movimento ambulatório foram
coletados durante 20 minutos por meio do software do equipamento.

3.6 Análises Bioquímicas

Após a conclusão dos testes comportamentais, no 30º dia, os ratos foram

eutanasiados por decapitação e o cérebro dissecado em: córtex, pré-frontal e
cerebelo, de acordo com o método descrito por Glowinski e Iversen (1966).
A partir do homogenato das regiões córtex pré-frontal, córtex posterior e
cerebelo, os seguintes testes bioquímicos foram conduzidos: avaliação da produção
de radicais livres pela oxidação da dicloroidrofluoresceína (DCFH), concentração de
Oxido Nítrico, oxidação de proteínas por concentração de Carbonil, concentração de
Sulfidrila (SH); atividade da glutationa redutase (GSH), e da superóxido dismutase
(SOD), além da dosagem de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e tióis
totais.
 43

3.7 Avaliação de Estresse Oxidativo

3.7.1 Formação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS:

A peroxidação lipídica foi analisada através da formação de TBARS

(Cheeseman, 1990). As amostras de tecido cerebral foram lavadas com PBS, colhidas
e lisadas. As espécies reativas foram obtidas por hidrólise ácida de 1,1,3,3-tetra-etoxi-
propano (TEP) e foram utilizadas como padrão para a quantificação de TBARS. A
cada tubo foi adicionado TBA a 0,67% e em seguida agitados. A mistura da reação foi
incubada a 90o C durante 20 min e posteriormente as amostras colocadas em gelo. A
densidade óptica de cada solução foi medida em um espectrofotômetro a 535 nm. Os
dados foram expressos como nmol de equivalentes malondialdeído (MDA) por mg de
proteína.

3.7.2 Determinação da concentração da 2',7'-diclorofluoresceína - DCF

O homogeneizado de tecido cerebral (pré-frontal, Córtex e Cerebelo) foram

utilizadas analisar a concentração da 2',7'-diclorofluoresceína – DCF. A produção de
hidroperóxidos foi determinada pela oxidação intracelular de diacetato 2′,7′-
diclorofluoresceína (DCFH-DA) por espécies reativas de oxigênio (ERO). A formação
do derivado fluorescente oxidado foi monitorada nos comprimentos de onda de
excitação e emissão de 488 e 525nm, respectivamente, usando um espectrofotômetro
de fluorescência como descrito anteriormente por LeBel et al. (1990).

3.7.3 Determinação da concentração de Oxido Nítrico

Citocinas estimulam os níveis de expressão de óxido nítrico sintase das células

imunes promovendo estresse oxidativo induzido pelo óxido nítrico (NO) levando a
danos citotóxicos. Seguindo os procedimentos conforme descrito por Chae et al.
(2004), o óxido nítrico (NO) foi estimado espectrofotometricamente de acordo com a
produção de nitrito (NO2-). As amostras do homogeneizado de tecido cerebral (pré-
frontal, Córtex e Cerebelo), foram incubadas com reagente de Griess à temperatura
ambiente (18-22 ºC), e a absorbância foi medida a 540 nm usando um leitor de
microplacas da Molecular Devices.
 44

3.7.4 Oxidação de proteínas: concentração de Carbonil

O homogeneizado de tecido cerebral (pré-frontal, Córtex e Cerebelo) foi utilizado

para análise da concentração de Carbonil. Seguindo a técnica descrita por Levine et
al. (1990), a oxidação de proteínas foi determinada mediante a quantificação de
proteínas carboniladas através da reação de grupos carbonilas com a
dinitrofenilhidrazina, essa reação gera a formação de hidrazonas correspondentes. O
teor de carbonil de proteína foi medido usando derivados de proteína-hidrazona
marcados com 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH), que reage com as proteínas
carboniladas, formando dinitrofenil-hidrazonas. Estes derivados foram extraídos com
ácido tricloroacético seguido de tratamento com etanol / acetato de etilo e dissolvidos
em cloridrato de ureia. As concentrações de dinitrofenil-hidrazonas incorporada foram
medidas pela absorbância a 370 nm e são mostradas em miligramas de proteína.

3.7.5 Determinação da concentração de Sulfidrila (SH)

Resíduos de aminoácidos – as cisteínas – que contêm sulfidrila (-SH) nas

proteínas são alvos suscetíveis a uma variedade de pró-oxidantes. Em diferentes
tecidos, as células, incluindo o cérebro, possuem um sistema que regula o status
redox dos tióis celulares e protegem as proteínas que contêm -SH contra oxidação
excessiva. Os radicais sulfidrilas (-SH) representam todos os grupos tióis, portanto,
conforme descrito por Aksenov, Markesbery (2001), para a análise do teor de tiol total
e ligado às proteínas, as amostras (pré-frontal, Córtex e Cerebelo) foram processadas
e suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH, 7,5) contendo
inibidores de protease: leupeptina (0,5mg / ml), pepstatina (0,7 mg / ml), inibidor de
tripsina de soja do tipo IIS (0,5 mg / ml) e fluoreto de fenilmetanossulfonil (40 mg / ml).
O conteúdo total de tiol foi determinado usando 5,50-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) e
quantificado de acordo com a absorbância a 412 nm usando um espectrofotômetro.
 45

3.8 Defesas antioxidantes

3.8.1 Atividade da Superóxido Dismutase (SOD)

Amostras cerebrais (Pré-frontal, Córtex e Cerebelo) foram homogeneizadas em

tampão de glicina. A atividade da SOD foi determinada pela inibição da autoxidação
da adrenalina segundo Bannister e Calabrese (1987). Foi utilizado 10, 30 e 50µL da
amostra (homogeneizado em tampão glicina) e adicionado 10µL de catalase
(0,0024g/ml de água destilada), 970µL de tampão glicina (0,75g em 200mL de água
destilada – 32ºC), 17µL de adrenalina (60 mM em água destilada + 15μL/ml de HCl
fumegante). A leitura foi realizada em 180 segundos com intervalo de 10 segundos
medida espectrofotometricamente a 480nm e os valores foram expressos em Unidade
de SOD por miligrama de proteína (U/mg proteína).

3.8.2 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH)

Os níveis de glutationa reduzida (GSH) foram determinados com base na reação

da GSH com o ácido 5,5′-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzóico), reagente de Ellman (DTNB).
A reação gera um produto oxidado de GSH-TNB que, posteriormente é reduzido a
glutationa redutase (GR). Na presença de nicotinamida-adenina 2'-fosfato
dinucleotídeo reduzido – o hidrato de sal tetrassódico (NADPH), reage com a GR –
reduzindo-a, com consequente síntese de GSH. As concentrações de GSH foram
determinadas usando uma curva de regressão plotada usando vários padrões de GSH
conforme o estudo de Hissin e Hilf (1976).

3.8.3 Nível de proteínas totais

O conteúdo de proteínas no tecido muscular homogeneizado foi determinado

usando albumina sérica bovina como padrão, de acordo com o estudo de Lowry et al.
(1951). O reagente fosfomolibdico-fosfotungstico (Folin fenol) foi adicionado para ligar
a proteína. O reagente foi reduzido lentamente, como indicado por uma mudança da
coloração amarela para azul. A absorbância foi medida a 750 nm.
 46

3.9. Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas no programa SPSS e os gráficos

construídos utilizando o programa Graphpad versão 7.0. Para as comparações entre
os grupos utilizou-se a análise de variância ANOVA de uma via, seguido do teste de
Tukey (post hoc). O critério de significância utilizado foi de p < 0,05. Os asteriscos (*p
<0,5; **p < 0,01) caracterizam o grau de significância.
 47

4 RESULTADOS

4.1 Avaliação Comportamental

4.1.1 Teste da Interação Social

No DPN 25, ratos machos jovens, foram colocados individualmente em uma

caixa de acrílico para interagir com outro animal (do mesmo sexo e grupo
experimental), com objetivo de verificar o comportamento de interação social. Os
animais permaneceram na área de testes por 10 minutos e os dados de latência para
o primeiro encontro (A), número de encontros (B) e tempo total juntos em todos os
encontros (C) estão apresentados na figura 9. Na avaliação da latência e tempo total
de encontros não foram identificadas diferenças significativas entre os grupos
testados relacionados ao controle. Mas, no número de encontros, o grupo VPA
demonstrou uma diminuição estatística (*p < 0,05), em relação ao grupo controle. Os
animais deste grupo se encontraram menos vezes com seu par, isso demonstra que
a administração de VPA no DG12 foi capaz de induzir alterações no comportamento
interesse/relação social dos ratos. Os grupos PM e VPA+PM não diferiram em relação
ao grupo controle.

A B C
20 25 600
T e m p o T o ta l E n c o n tro s
N ú m e r o d e E n c o n tr o s

20
L a t ê n c ia ( s e g .)

15
400
(s e g .)

15 *
10
10
200
5
5

0 0 0
le

A
A
M

le

le
A

A
A

A
M

M
P
P
o

P
P

P
o

o
P

P
tr

V
V

tr

tr

V
V

V
+
n

+
n

n
M
o

M
o

o
C

C
P

Figura 9: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, no comportamento de interação social

dos animais testados. Os animais foram levados individualmente a interagir com outro animal
desconhecido do mesmo sexo em uma caixa de acrílico. Os ratos foram pareados e inseridos na área
de testes por 10 minutos (n=12 animais/grupo). Os dados coletados estão representados nas figuras:
(A) Latência (segundos) – representa tempo de repouso do animal antes da primeira movimentação;
(B) Número de encontros – representa o total de encontros entre os animais pareados e, (C) Tempo
total Encontros (segundos) – representa o tempo total gastos nos encontros. Dados expressos como
média ± desvio padrão da média (DPM). As análises estatísticas foram realizadas através da análise
de variância ANOVA de uma via, seguido do teste de post hoc de Tukey, *P < 0,05.
 48

4.1.2 Avaliação da atividade locomotora - caixa de atividade

No DPN 28, foi avaliada a atividade locomotora espontânea dos ratos machos
jovens e os dados estão apresentados na figura 10. Foram registrados os dados
referentes a velocidade de locomoção (A), distância percorrida na caixa (B) e o registro
de movimento ambulatório (C), com propósito de verificar a hiperatividade e
movimentos estereotipados. Os dados coletados e analisados não demonstraram
diferenças estatísticas significativas entre os grupos PM, VPA e VPA+PM em relação
ao grupo controle.

A B C
20 20000 100
V e lo c id a d e (m m /s )

M o v .A m b u la tó r io
80
D is tâ n c ia ( m m )

15 15000

60
10 10000
40

5 5000
20

0 0 0
le M A M
le

le
A

A
M

M
M

M
ro P P P
P

P
o

P
P

P
t V +
tr

tr
V

V
+

+
n A
A

A
n

n
o P
o

o
P

P
C V
C

C
V

V
Figura 10: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, no comportamento locomotor dos
animais testados. Para avaliar a locomoção foi utilizada a gaiola de atividade, onde os animais foram
testados individualmente durante 10 minutos (n=12 animais/grupo). Os dados coletados estão
representados nas figuras: (A) velocidade (mm/s) – representa a velocidade de deslocamento do
animal, (B) distância (mm/s) – representa a distância total percorrida pelo animal e (C) movimento
ambulatório – representa o deslocamento. Dados expressos como média ± desvio padrão da média
(DPM). As análises estatísticas foram realizadas através da análise de variância ANOVA de uma via,
seguido do teste de post hoc de Tukey.

4.2 Análise Bioquímica

4.2.1 Dano oxidativo

4.2.1.1 Concentração de DCF

No DPN 30, os animais foram eutanasiados e o encéfalo foi removido para

avaliação molecular de ERO, os resultados estão apresentados das figuras 11 a 14.
Os níveis de oxidação de DCFH são indicadores da produção de espécies reativas,
especialmente peróxido de hidrogênio. A produção de ERO foi mensurado com base
 49

na oxidação da sonda DCFH-DA em composto fluorescente da DCF em amostra

cerebral. Os dados estão apresentados na figura 11. Foram analisadas as seguintes
regiões encefálicas: córtex pré-frontal (A), córtex posterior (B) e cerebelo (C). Na
região do córtex pré-frontal, o grupo VPA apresentou aumento significativo na
produção de DCF (p < 0,05), em relação ao grupo controle, enquanto que os grupos
PM e VPA+PM, não diferiram estatisticamente do controle. No cerebelo, o grupo PM
apresentou aumento significativo (p < 0,05), assim como o grupo VPA+PM (p < 0,01)
em relação ao grupo controle. O grupo VPA não apresentou diferença comparado ao
controle. Na região de córtex pré-frontal não houveram diferenças estatísticas entre
os grupos quando comparados ao grupo controle. Os dados demonstram que o VPA
administrado no GD12 e a PM do DPN1 a 10, de modo isolados e em associação,
produziram aumento da DCF em regiões distintas, estando o córtex posterior e o
cerebelo mais vulneráveis aos radicais livres gerados frente aos insultos pré (VPA) e
pós natal (PM).

A P ré -fro n ta l (M ) B C ó rte x (M ) C C e r e b e lo ( M )

6 1 .5 3 **
* *
( U F lu o r e s c ê n c ia /m g

( U F lu o r e s c ê n c ia /m g

( U F lu o r e s c ê n c ia /m g

4 1 .0 2
p r o t e ín a )

p r o t e ín a )

p r o t e ín a )
DCF

DCF

DCF

2 0 .5 1

0 0 .0 0
le M A M
le

le
M

M
M

M
A

A
o P P P
tr
o

P
P

+
P

V
tr

tr
+

+
n A
V

V
A

A
n

o P
o

o
P

C V P
C

C
V

Figura 11: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de DCF, no cérebro
em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) de animais expostos ao VPA (pré-natal) e a PM
(pós-natal) (n=5-6 animais/grupo). Dados expressos como média ± desvio padrão da média (DPM). As
análises estatísticas foram realizadas através da análise de variância ANOVA de uma via, seguido do
teste de post hoc de Tukey, *P < 0,05, **P < 0,01.

4.2.1.2 Concentração de Carbonil

A carbonilação proteica é resultado da ação direta de ERO produzindo

modificações oxidativas nas proteínas, deste modo, para verificar alterações proteicas
foi medido a concentração da proteína carbonil conforme apresentado na figura 12.
Os resultados demonstram que no córtex pré-frontal, a PM e VPA, isoladamente ou
em associação provocaram aumento dos níveis da proteína carbonil (p < 0,05 e p <
0,01, respectivamente), quando comparados ao grupo controle. Na região do córtex
 50

posterior, os dados também confirmaram aumento significativo dos níveis de proteínas

carboniladas (p < 0,01), para grupo VPA+PM, quando comparado ao grupo controle.
Não houveram diferenças estatísticas entre os grupos quando comparados ao grupo
controle, no cerebelo. Os resultados mostram que a associação de VPA+PM,
conforme protocolo adotado por esta pesquisa, promoveu dano oxidativo consistente
no pré-frontal e córtex de ratos jovens.

A P ré -fro n ta l (M ) B C ó rte x (M ) C C e r e b e lo ( M )

0 .1 0 0 .2 5 0 .1 0
** **
( n m o l/m g /p r o te ín a )

( n m o l/m g /p r o te ín a )

( n m o l/m g /p r o te ín a )
0 .0 8 * 0 .2 0 0 .0 8
*
C a r b o n il

C a r b o n il

C a r b o n il
0 .0 6 0 .1 5 0 .0 6

0 .0 4 0 .1 0 0 .0 4

0 .0 2 0 .0 5 0 .0 2

0 .0 0 0 .0 0 0 .0 0
le M A M
le

le
M

M
M

M
A

A
o P P P
tr
o

P
P

P
+ P

P
V
tr

tr
+

+
n
V

V
A

A
n

n
o P
o

o
P

P
C V
C

C
V

V
Figura 12: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de Carbonil no
cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) dos animais testados (n=5-6
animais/grupo). A oxidação de proteínas foi determinada mediante a quantificação de proteínas
carboniladas. Dados expressos como média ± desvio padrão da média (DPM). As análises estatísticas
foram realizadas através da análise de variância ANOVA de uma via, seguido do teste de post hoc de
Tukey, *P < 0,05, **P < 0,01.

4.2.1.3 Concentração de Sulfidrila

Os dados da figura 13, representam os níveis de oxidação de proteína tiol

(sulfidrila -SH) para as regiões do córtex pré-frontal (A), córtex posterior (B) e cerebelo
(C). No pré-frontal, somente o grupo VPA+PM (p < 0,05), apresentou um aumento
significativo nos níveis de sulfidrila, quando comparado ao controle. No cerebelo, o
grupo VPA + PM apresentou diferença estatística (p < 0,05), na oxidação de -SH,
quando comparados aos grupos PM e VPA, mas não quando comparado ao grupo
controle. Na região do córtex posterior, não houveram alterações significativas entre
os grupos PM, VPA e VPA+PM, quando comprados ao grupo controle. Os resultados
apresentados demonstram que o grupo submetido ao protocolo conjugado VPA+PM,
contém maior dano oxidativo nas regiões encefálicas avaliadas (córtex pré-frontal e
cerebelo), sugerindo um desequilíbrio redox nas células e consequentemente maior
vulnerabilidade do tecido.
 51

A P ré -fro n ta l (M ) B C ó rte x (M ) C C e r e b e lo ( M )

( n m o l T N B /m g d e p r o te ín a )
( n m o l T N B /m g d e p r o te ín a )

( n m o l T N B /m g d e p r o te ín a )
5 2 .5 2 .0
*
#
4 2 .0
1 .5

S u lfid r ila
S u lfid r ila

S u lfid r ila
3 1 .5
1 .0
2 1 .0

0 .5
1 0 .5

0 0 .0 0 .0

le

le

M
M

M
M

le

M
M
A

A
o P P

P
P
P

P
P
P
tr

P
+

tr

tr
V

+
V

V
n A

A
n

A
n
o P

P
C V

V
Figura 13: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de Sulfidrila (SH)
no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) dos animais testados (n=5-6
animais/grupo). A oxidação de grupamentos Sulfidrilas (dano proteico) foi determinada mediante a
quantificação do teor de tiol total ligado às proteínas. As análises estatísticas foram realizadas através
da análise de variância ANOVA de uma via, seguido do teste de post hoc de Tukey, *P < 0,05, quando
comparados com ao grupo controle; # P < 0,05 quando comparados aos grupos PM e VPA.

4.2.1.4 Concentração de Nitrito (NO2-)

A figura 14 apresenta a relação dos níveis de nitrito, nas regiões do pré-frontal

(A), córtex posterior (B) e cerebelo (C). Na região pré-frontal, observou-se um aumento
estatístico na produção de nitrito somente no grupo VPA+PM (p < 0,05), comparado
ao controle, evidenciando maior toxicidade por associação dos protocolos PM e VPA.
Surpreendentemente, no cerebelo, houve uma diminuição dos níveis de nitrito nos
grupos PM (p < 0,01), VPA (p < 0,01) e VPA+PM (p < 0,01), em comparação ao grupo
controle. Nas amostras do córtex, os grupos não diferiram estatisticamente. Os dados
demonstram alterações na produção de nitrito.

A P ré -fro n ta l (M ) B C ó rte x (M ) C C e r e b e lo ( M )

5 10 10

*
(  m o l/m g /p r o te ín a )
(  m o l/m g /p r o te ín a )

(  m o l/m g /p r o te ín a )

4 8 8

6
N it r it o

3 6
N it r it o

N it r it o

**
** **
2 4 4

1 2 2

0 0 0
le

M
M
le

le
M

M
M

M
A
A

A
o

P
P
o

P
P

P
P
P

P
tr

+
tr

tr
+

+
V
V

V
A
n
A

A
n

n
o

P
o

o
P

P
C

V
C

C
V

Figura 14: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de nitrito (NO2-) no
cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) dos animais testados (n=5-6
animais/grupo). O estresse oxidativo induzido pelo óxido nítrico (NO), foi estimado
espectrofotometricamente mediante a quantificação da produção de nitrito (NO 2-). Dados expressos
como média ± desvio padrão da média (DPM). As análises estatísticas foram realizadas através da
análise de variância ANOVA de uma via, seguido do teste de post hoc de Tukey, *P < 0,05, **P < 0,01.
 52

4.3 Defesa Antioxidante

4.3.1 Concentração de glutationa reduzida (GSH)

Parâmetros para verificar a defesa antioxidante das células também foram

utilizados, a partir, da avaliação dos níveis de GSH e SOD, do homogenato das
estruturas cerebrais já mencionadas. A figura 15 apresenta a relação dos níveis de
glutationa, nas regiões do pré-frontal (A), córtex posterior (B) e cerebelo (C). Na região
do córtex pré-frontal, somente o grupo PM, demonstrou diminuição na concentração
de GSH (p < 0,05), em relação ao grupo controle. Nas amostras do córtex posterior,
houve uma diminuição estatística na concentração de GSH nos grupos PM (p < 0,05)
e VPA+PM (p < 0,05), quando comparados ao grupo controle. No cerebelo, a
concentração de GSH apresentou-se diminuída no grupo VPA (p < 0,05). Os achados
comprovam diminuição na capacidade de reciclagem da ERO peróxido de hidrogênio
(H2O2), concomitante com estresse oxidativo, pela menor atividade da GSH. Os dados
mostram que tanto o VPA quanto a PM isoladamente, ou em associação foram
capazes de promover a diminuição de glutationa, onde as diferentes áreas cerebrais
divergem quanto a sua suceptibilidade e resposta ao dano oxidativo.

A P ré -fro n ta l (M ) B C ó rte x (M ) C C e r e b e lo ( M )

0 .6 0 .1 5 0 .2 5
(  M /m g d e p r o t e ín a )

(  M /m g d e p r o t e ín a )

(  M /m g d e p r o t e ín a )
C o n te ú d o d e G S H

C o n te ú d o d e G S H

C o n te ú d o d e G S H

0 .2 0
* *
0 .4 0 .1 0 *
0 .1 5
*

0 .1 0
0 .2 0 .0 5

0 .0 5

0 .0 0 .0 0 0 .0 0
le M A M
le

le
M

M
M

M
A

o P P P
tr
o

P
P

+
P

V
tr

tr
+

n
V

A
A

A
n

o P
o

o
P

C V
C

C
V

Figura 15: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de glutationa

reduzida (GSH) no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) dos animais testados
(n=5-6 animais/grupo). As concentrações de GSH foram avaliadas usando uma curva padrão de GSH.
Dados expressos como média ± desvio padrão da média (DPM). As análises estatísticas foram
realizadas através da análise de variância ANOVA de uma via, seguido do teste de post hoc de Tukey,
*P< 0,05.
 53

4.3.2 Concentração Superóxido Dismutase (SOD)

Neste estudo, avaliou-se a atividade da SOD, no homogeneizado cerebral das

regiões do córtex pré-frontal (A), córtex posterior (B) e cerebelo (C), e os resultados
estão apresentados na figura 16. Os dados obtidos nas regiões córtex pré-frontal e
córtex posterior não apresentaram alterações estatísticas da atividade da SOD para
os grupos PM, VPA, VPA+PM, comparados ao controle. Ademais, no cerebelo, a
concentração da SOD apresentou-se diminuída para o grupo VPA+PM (p < 0,05),
comparado ao controle. Com a diminuição da atividade de SOD, o radical ânion
superóxido (O2• –) presente no meio celular poderá reagir com o radical HO•
produzindo oxigênio singleto 1O2 e com o óxido nítrico (NO) produzindo peroxinitrito
(ONOO−), aumentando o estado de toxicidade do meio.

A P ré -fro n ta l (M ) B C ó rte x (M ) C C e r e b e lo ( M )

0 .6 0 .6 0 .4
( U /m g d e p r o t e ín a )

( U /m g d e p r o t e ín a )

( U /m g d e p r o t e ín a )
A tiv id a d e d e S O D

A tiv id a d e d e S O D

A tiv id a d e d e S O D
0 .3
0 .4 0 .4 *

0 .2

0 .2 0 .2
0 .1

0 .0 0 .0 0 .0
le M A M
le

le
M

M
M

M
A

A
o P P P
tr
o

P
P

P
+
P

P
V
tr

tr
+

+
n
V

V
A
A

A
n

o P
o

o
P

P
C V
C

C
V

V
Figura 16: Efeito da exposição pré-natal ao VPA e PM pós-natal, na concentração de Superóxido
Dismutase (SOD), no cérebro em região Pré-frontal (A), Córtex (B) e Cerebelo (C) dos animais testados
(n=5-6 animais/grupo).A atividade da SOD foi avaliada medindo a inibição da autoxidação da adrenalina
com absorbância a 480 nm. Dados expressos como média ± desvio padrão da média (DPM). As
análises estatísticas foram realizadas através da análise de variância ANOVA de uma via, seguido do
teste de post hoc de Tukey, *P< 0,05.
 54

5 DISCUSSÃO

O TEA é um transtorno do neurodesenvolvimento de origem multifatorial, no

qual, os agentes ambientais podem atuar como um gatilho em indivíduos
geneticamente suscetíveis. Neste sentido, o estresse oxidativo parece atuar como
uma conexão entre genes e fatores ambientais, ativando e potencializando os efeitos
do TEA, afetando gravemente o funcionamento social e a autossuficiência (Hegazy et
al., 2015; Posar, Visconti, 2017).
A proposta deste estudo foi verificar os efeitos da exposição gestacional ao VPA
combinado à PM, em parâmetros comportamentais e de estresse oxidativo no cérebro
de ratos jovens, pois estas alterações estão presentes no TEA. Os modelos animais
são fundamentais para a pesquisa por mimetizarem algumas características
elementares de determinado estado patológico específico e reduzir o número de
variáveis, assim, pode-se ter maior grau de controle experimental (Arruda et al., 2011).
O modelo animal de TEA por administração gestacional de VPA é um dos
modelos animais mais amplamente utilizados e, como qualquer outro modelo
experimental, ele não consegue modelar a totalidade dos sinais vistos no TEA
(Schlickmann, Fortunato, 2013; Mabunga et al., 2015). Devido às limitações de
reprodutibilidade do modelo animal de TEA com administração de VPA (pré-natal) e
toda sua complexidade, o presente estudo associou a PM, que também mimetiza
aspectos fisiopatológicos do transtorno, buscando um modelo animal de TEA mais
complexo; e atender também as condições de validação de constructo, face e
preditiva, conforme descrito por Bossu e Roux (2019).
As condições ambientais neonatais, têm profundo impacto no desenvolvimento
do SNC, evidências clínicas e epidemiológicas apoiam o entendimento de que a
exposição a um ambiente adverso inicial pode estar implícita à vulnerabilidade e à
expressão posterior de doenças neuropsicológicas (Ignácio et al., 2017). Segundo
Herpfer et al. (2012), experiências adversas na infância associadas a altos níveis de
estresse prolongado se apresentam como importantes fatores de risco para uma
variedade de distúrbios psiquiátricos e médicos como diminuição da emocionalidade
em novos ambientes, tendência para aumento da ansiedade, características
semelhantes à anedonia e motivação social reduzida. Outros autores, ainda reforçam
que a exposição a ambientes estressantes durante a vida pré-natal ou neonatal
 55

podem alterar o desenvolvimento e predispor o indivíduo a problemas de saúde que

perduram ao longo da vida (Marco et al., 2015).
Em humanos, o autismo é diagnosticado quando o paciente apresenta pelo
menos dois itens em uma lista de comportamentos em três domínios: interação social;
comunicação; interesses restritos e padrões estereotipados do comportamento
(Schlickmann, Fortunato, 2013). Sabe-se que os ratos são uma espécie altamente
social (Moy et al., 2004), exibem um conjunto notável de comportamentos sociais,
servindo como modelos de diagnóstico de TEA, para muitas das categorias
observadas em seres humanos e que são acessíveis através de testes padronizados
(Schroeder et al., 2017).
Neste sentido, no presente trabalho foi realizado o teste de interação social, onde
o modelo animal de VPA apresentou déficit social. Houve uma redução significativa
no número de encontros quando comparado ao grupo controle, ou seja, o grupo VPA
apresentou prejuízo em interagir com seus pares e menor interesse pelo novo. Tais
achados reproduzem características fenotípicas encontradas em humanos com TEA.
Estes mesmos achados se comparam aos descritos na literatura, nos quais indivíduos
com TEA apresentam dificuldades de interação social e restrição de interesses em
diferentes idades (Sanchack, Thomas, 2016), e que o organismo exposto a agentes
químicos teratogênicos durante o período pré-natal leva ao desenvolvimento
neurológico comprometido (Posar, Visconti, 2017). Os mesmos achados de
sociabilidade prejudicada e a preferência pela novidade social em modelo de rato
macho de autismo induzido por VPA foram confirmados por Win-Shwe et al. (2018).
Conforme descrito por Iwata (2019), aspectos clínicos do autismo e
comportamentos relevantes em modelos animais podem ser avaliados através das
três principais deficiências comportamentais observadas no autismo e suas medidas
comportamentais em camundongos e ratos: 1) Prejuízo na interação social (contato
direto; comportamento lúdico; exploração social; atividade sexual e agressão); 2)
Deficiências cognitivas e de comunicação (chamadas de emergência (filhotes);
acasalamento e submissão) e 3) Atividades motoras repetidas.
Além disso, no presente projeto foi avaliada a condição motora dos animais
através da caixa de atividade. Não foram observadas alterações locomotoras
significativas, evidenciando que a motricidade dos animais (ratos machos jovens) não
se aprestou afetada pelo tratamento com VPA (pré-natal) e/ou PM (pós-natal). Os
 56

dados demonstram também que os animais não apresentaram hipoatividade e nem

hiperatividade locomotora.
O cerebelo é essencial para a coordenação, adaptação/ajuste, aprendizado
motor, estando esta região do SNC responsável pela execução das habilidades
motoras especializas, além de regular o tônus postural e o equilíbrio (Fenner, 2009).
Dada informação é importante, pois ao analisar os dados de dano oxidativo no
cerebelo não se identificam alterações significativas estatisticamente que possam
conduzir ao mal funcionamento desta área, e portanto, que possam comprometer a
locomoção dos animais avaliados.
Estes resultados nos levam à novas reflexões e a futuros projetos, conforme já
discutido, por Rice e Barone (2000), a vulnerabilidade do cérebro em desenvolvimento
depende da exposição ao metabólito ativo e, em qual período ocorreu a exposição;
segundo Schlickmann e Fortunato (2013), diferentes dosagens apresentam diferentes
efeitos; e regiões cerebrais específicas podem ser mais suscetíveis a danos durante
o neurodesenvolvimento (Roullet et al., 2013), e ainda, desde a gestação, o cérebro
se desenvolve e continua nos períodos pós-natal, adolescência e idade adulta. Cada
área amadurece se desenvolve atendendo as especializações fisiológicas de cada
região.
Neste sentido, na idade temporal utilizada – animais jovens – o cérebro, devido
sua plasticidade, pode ter sido capaz de se adaptar às necessidades fisiológicas e se
recuperado, em parte, das injúrias sofridas no período gestacional e pós-natal, por
isso, tais efeitos esperados não foram evidenciados, mas, isso não descarta a
possibilidade de, na infância ou idade adulta, as alterações comportamentais de
interesses restritos e repetitivos possam se fazer presentes.
Outro ponto a ser observado é o tipo de teste utilizado no estudo, o qual, não
possibilitou a identificação de alterações comportamentais em nível estatístico. Assim
como proposto no estudo de Bronzuoli et al. (2018), para melhor entender estes
efeitos, fica sugestivo o estudo longitudinal desde o período gestacional à idade adulta
(conferentes à infância, adolescência e idade adulta humana), para compreender os
efeitos do VPA pré-natal associado a PM pós-natal sobre a locomoção do modelo
animal proposto, com aplicação de diferentes testes, segundo a especificidade, nas
diferentes fases do desenvolvimento.
Além da questão comportamental, a fisiopatologia do TEA também é
amplamente investigada. A oxidação é um processo fundamental da vida aeróbica e
 57

do nosso metabolismo, deste modo, há produção, natural ou por alguma disfunção

biológica, dos radicais livres que por sua vez, são denominados de acordo com o
elétron desemparelhado, encontrando-se centrado nos átomos de oxigênio, formando
a espécie reativa de oxigênio – ERO, ou centrado nos átomos de nitrogênio formando
a espécie reativa de nitrogênio – ERN (Barreiros et al., 2006; Kumar et al. 2013).
As ERO são produzidas em pequenas quantidades, em todas as células, durante
as reações de oxidação e redução, por meio da cadeia transportadora de elétrons,
decorrentes da respiração e geração de energia mitocondrial (Kumar et al., 2013), se
tornam um subproduto “não intencional”, como quando há o escape de elétrons da
cadeia respiratória mitocondrial - originando o superóxido; as ERO também podem
ser produzidas pelo sistema imunológico, principalmente neutrófilos e macrófagos,
para eliminar agentes invasores e outras substâncias durante a inflamação e defesa
do organismo (Kumar et al. 2013; Hawkins, Davies, 2019). As principais ERO estão
distribuídas em dois grupos, os radicalares: hidroxila (HO•), superóxido (O2•-), peroxila
(ROO•) e alcoxila (RO•); e os não-radicalares: peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio
singlet (1O2) e o ácido hipocloroso; as ERN incluem o óxido nítrico (NO•), óxido nitroso
(N2O3), ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2-), nitratos (NO3-) e peroxinitritos (ONOO-)10
(Barreiros et al., 2006; Chen et al., 2010).
Erros no metabolismo energético e a produção de radicais livres podem levar ao
surgimento de doenças e/ou agravá-las, pois, o excesso desta produção apresenta
efeitos prejudiciais como a peroxidação dos lipídios de membrana e agressão às
proteínas dos tecidos, às enzimas, carboidratos e ao DNA (Barreiros et al., 2006).
Wong e Giulivi (2016), relatam que a disfunção mitocondrial é o distúrbio metabólico
mais prevalente associado ao TEA, onde a diminuição na atividade da cadeia de
transporte de elétrons estaria relacionada ao aumento da produção de ERO e
respostas antioxidantes. Isto também favoreceria o aumento na replicação e deleções
de mtDNA agravando ainda mais a patologia (Hollis et al., 2017).
Dada a relevância fisiopatológica das ERO, este estudo se propôs a verificar a
homeostase redox nas estruturas cerebrais do córtex pré-frontal, córtex posterior e
cerebelo de animais expostos a VPA (pré-natal) e /ou PM (pós-natal). Para avaliar a
produção geral de ERO intracelular, utilizou-se a sonda 2',7'-diclorofluoresceína
(DCFH-DA). A DCFH-DA é um biomarcador (corante não polar), convertido em DCFH
(polar), por esterases celulares que não são fluorescentes, mas, que são alteradas
para DCF altamente fluorescentes quando oxidadas por ERO intracelular, este
 58

processo de conversão ocorre em nível mitocondrial (Chen et al., 2010; Rastogi et al.,
2010). Observou-se que a concentração de DCF para o grupo VPA apresentou
aumento estatístico em relação ao grupo controle, no córtex posterior. Já no cerebelo
houve um aumento significativo no grupo PM e VPA+PM quando comparados ao
controle. No pré-frontal, não foram registradas alterações significativas para este
parâmetro. Os dados demonstram presença de ERO aumentada nas regiões
avaliadas, em reposta às injúrias acometidas ao cérebro.
A presença de ERO sugere prejuízo na atividade neurofisiológica da região
acometida. Os achados de aumento de radicais livres, como neste estudo, foram
descritos no estudo de Bu et al. (2017), no qual foi detectado aumento significativo de
espécies reativas intracelulares de oxigênio; ERO mitocondrial e apoptose induzida
pelo estresse oxidativo mitocondrial, em células linfoblásticas de pacientes com TEA.
As proteínas são abundantes e reagem rapidamente com muitos oxidantes, elas
são altamente suscetíveis e são os principais alvos de danos oxidativos (Hawkins,
Davies, 2019). Com aumento do estresse oxidativo, a ERO no interior da célula pode
provocar a carbonilação de proteínas, através de modificações de cadeias laterais de
aminoácidos formando grupamentos carbonil como aldeídos e cetonas, por sua vez,
as proteínas podem ser danificadas e suas estruturas sofrerem fragmentação,
degradação, e consequentemente, perder e/ou alterar suas funções fisiológicas
(Fernandes, 2017). Os biomarcadores utilizados para avaliação de oxidação incluem
alterações no conteúdo de proteínas carbonilas, nitrotirosinas, produtos finais de
glicação e alterações no teor de proteínas e tiol (Aksenov, Markesbery, 2001). No
presente projeto, para verificar alterações e dano oxidativo a proteínas, realizou-se a
quantificação dos compostos carbonílicos e sulfidrílicos no córtex pré-frontal, córtex
posterior e cerebelo de animais expostos a VPA (pré-natal) e/ou PM (pós-natal).
De acordo com as análises bioquímicas, na região do córtex pré-frontal, os níveis
de proteínas carboniladas apresentaram-se elevadas em todos os grupos PM; VPA e
VPA+PM, comparados ao grupo controle. Já no córtex posterior, apenas os animais
expostos ao protocolo VPA+PM confirmaram elevação da proteína carbonil quando
comparados ao grupo controle. No cerebelo, não foram registradas alterações
significativas. Os grupos demonstraram carbonilação de proteínas por ação de ERO,
ademais, o grupo que sugere maior dano/prejuízo é o grupo VPA+PM, que
estatisticamente, em diferentes regiões cerebrais, apresentou elevada concentração
da proteína carbonil.
 59

Os grupos tióis, representados pelo radical sulfidrila (-SH), podem estar ligados
a proteínas ou a compostos de baixo peso molecular e quando o estresse redox está
elevado, podem ser oxidados. Utilizando o corante de Ellman (DTNB), os grupos tióis
absorvem a luz e podem ser quantificados (Aksenov, Markesbery, 2001). Analisando
os dados do presente projeto, mais uma vez, a exposição de animais ao protocolo
VPA+PM mostrou-se mais prejudicial ao SNC, onde houve um aumento significativo
nos níveis de sulfidrila para este grupo no córtex pré-frontal quando comparados ao
grupo controle. No cerebelo, este grupo também foi significativamente mais afetado
que o grupo exposto a PM e a VPA, isoladamente. No córtex posterior não foram
registradas alterações.
O óxido nítrico (NO) é um importante neuromodulador com capacidade
potencializadora, atuando na memória e no aprendizado, regulando a atividade do
BDNF (Tripathi et al., 2020). O NO possui três isoformas descritas pela ciência, a
endotelial (eNOS) e neuronal (nNOS), sendo expressos constitutivamente, e a (iNOS)
uma enzima induzível pode ser encontrada em células imunes ativadas, como
macrófagos (Flora Filho, Zilberstein, 2000; Sweeten et al., 2004; Tripathi et al., 2020).
As isoformas (nNOS e eNOS) estão envolvidas em processos homeostáticos como
neurotransmissão podendo também ter ações endócrinas, autócrinas e parácrinas;
ademais a eNOS e a iNOS estão envolvidas em várias patologias do SNC (Flora
Filho, Zilberstein, 2000; Sweeten et al., 2004).
Nas amostras da região do córtex pré-frontal, o grupo exposto ao VPA+PM
demonstrou aumento significativo nos níveis de nitrito, comparado ao controle. Por
outro lado, as amostras do cerebelo, apresentam menor concentração de NO para os
grupos PM; VPA e VPA+PM, em comparação ao grupo controle. Os dados
demonstram alterações no metabolismo do NO dependente da área cerebral.
A expressão da NOS é estimulada devido resposta inflamatória levando a
superprodução de NO, e nesta condição, pode ser convertido em espécies reativas
como peroxinitrito (ONOO-) e dióxido de nitrogênio (NO2), conduzindo à oxidação de
diversas classes de lipídeos (O'Donnell, Freeman, 2001). Sweeten et al. (2004),
concluíram em seu estudo que a produção de NO é alta em crianças com autismo e
este fato pode estar associado à regulação positiva do iNOS mediada por IFN-γ, em
consequência, a produção de NO anormalmente aumentada no cérebro pode
interromper as conexões sinápticas, o neurodesenvolvimento normal do cérebro e,
possivelmente contribuir para a fisiopatologia subjacente do autismo.
 60

Outra condição a ser observada é possibilidade de reações do NO com outros

radicais como o ânion superóxido (O2-) resultando na formação de peroxinitrito
(ONOO-), ou então, a reação do ONOO- com o íon hidrogênio (H+) originando o radical
hidroxil (HO.), desta forma, ao considerar esta condição, sugere-se que a baixa de NO
na região do cerebelo se deve ao consumo deste radical através de sua reação com
outras espécies reativas dando origem a outros compostos radicalares. De acordo
com o estudo de Keynes et al. (2005), a concentração de NO no homogenato de tecido
do cerebelo depende da taxa de geração e degradação e pouco se sabe como o NO
é inativado.
Esses dados nos faz reforçar, conforme os achados no estudo de Bronzuoli et
al. (2018), que a mesma proteína tem medidas e efeitos diferentes em diferentes áreas
cerebrais nas distintas fases de desenvolvimento, e também pode ter relação com sua
função naquele local. Amal et al. (2018), em estudo com modelo animal genético de
SHANK3, relataram a nitrosilação de proteína S, NO e a modificação pós-tradução
mediada (PTM) de cisteína-tióis (NOS), que modulam a atividade de proteínas que
regulam as principais vias de sinalização, desta forma compreender as alterações
moleculares relacionadas com NO e sinalização de NOS no cérebro de um modelo de
autismo, permite caracterizar e identificar proteínas-chave, vias celulares e
mecanismos neurobiológicos que podem ser afetados no TEA. Além disso, Tripathi et
al., (2020), relacionam o NO como fator importante no TEA, pois, através da
mutação SHANK3 há um aumento do influxo de Ca2+ excitando a atividade da nNOS;
registraram a elevação da atividade da óxido nítrico sintase das proteínas envolvidas
no ciclo da vesícula sináptica (Syntaxin1a (Stx1a), sinaptotagmina 1, proteína de fusão
sensível à N-etilmaleimida (Nsf) e comprometimento na neurotransmissão, portanto,
dado os achados, pode-se implicar o NO como um fator patológico importante no TEA.
Como forma protetora, o organismo possui mecanismo para controle da
produção de substancias tóxicas advindos do processo metabólico mitocondrial - a
defesa antioxidante – desempenhando a função de inibir e/ou reduzir os danos
causados pela ação deletéria dos radicais e/ou espécies reativas não radicalares,
neste sentido, a defesa antioxidante celular e organizacional incluem enzimas que
removem oxidantes ou precursores de oxidantes (superóxido dismutases,
peroxiroxinas, tioredoxina / tioredoxina redutase, isoformas de GSH peroxidase e
catalases); eliminadores de oxidantes lipossolúveis, incluindo tióis (GSH e
tiorredoxina); e não-enzimática através de compostos antioxidantes de origem
 61

dietética, dos quais se destacam as vitaminas (A, C, E), minerais e polifenóis (Barbosa
et al., 2010; Hawkins e Davies, 2019).
A L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina (GSH - glutationa reduzida), é o tiol (-SH) mais
abundante no meio intracelular presente na maioria das células, desta forma, torna-
se um dos agentes importantes do sistema de defesa antioxidante (El-Ansary, Al Dera,
2016). As enzimas envolvidas neste sistema são a glutationa redutase (GR)
catalisando a troca SH / S ± S que contribui para a proteção das proteínas tiol;
glutationa peroxidase (GPx); glutationa transferases (GST), que usa GSH para
desintoxicar peróxidos e produtos contendo peróxido de carbonila; gama-
glutamilcisteína sintetase; e glicose-6-fosfato desidrogenase, que controla as
principais etapas do metabolismo do GSH (Aksenov e Markesbery, 2001; Santos,
2009; Barbosa et al., 2010; Hawkins, Davies, 2019).
Com relação a quantificação dos níveis de glutationa, presente no
homogeneizado cerebral dos animais testados neste estudo, na região do córtex pré-
frontal do grupo PM, houve diminuição dos níveis de GSH, em relação ao grupo
controle. No córtex posterior, a diminuição dos níveis de GSH, foram apresentados
pelos grupos expostos à PM e VPA+PM. Já no cerebelo, a ocorrência da diminuição
de GSH foi apresentado pelo grupo VPA. Os três protocolos (PM, VPA ou VPA+PM)
foram capazes de desencadear, em diferentes áreas cerebrais, a diminuição dos
níveis de GSH. Corroborando com nossos achados, outros estudos com modelo de
exposição VPA também relataram diminuição dos níveis de GSH (Hegazy et al. 2015,
Kuamr et al., 2016)
Conforme Barreiros et al. (2006), o controle redox pela glutationa ocorre através
da GSH reduzindo o H2O2 à H2O em presença de GPx, e posterirormente é
regenerada a GSH. Deste modo, os dados apresentados nos gráficos, na avaliação
da glutationa, indicam que há redução de sua atividade levando o meio intracelular ao
estresse oxidativo. Corroborando a esta observação, segundo Waligóra et al. (2019),
o cérebro tem capacidade limitada para desintoxicar a ERO por falta de potencial para
a produção de glutationa pelos neurônios, deste modo, os neurônios ficam vulneráveis
ao estresse oxidativo e, se as alterações neurológicas provocadas pelo estresse
oxidativo, ocorrerem nos estágios iniciais do desenvolvimento do tecido cerebral,
poderão levar a distúrbios do espectro do autismo.
De fato, crianças com autismo apresentam menor razão redox de GSH para
glutationa oxidada, consistente com o estresse oxidativo (Mabunga et al., 2015).
 62

Waligóra et al. (2019), discutem ainda que a menor concentração da forma reduzida
de glutationa também pode explicar a possibilidade de infecções recorrentes,
inflamação do tecido nervoso e capacidade reduzida de remover substâncias tóxicas
do corpo em pacientes com TEA.
Outra proteína antioxidante é a superóxido dismutase (SOD), uma enzima
importante para a proteção das células contra os danos oxidativos, catalisando a
conversão do radical aniônico superóxido em peróxido de hidrogênio (que é altamente
tóxico para as células), em oxigênio molecular e água através da catalase (Barreiros
et al., 2006; Perry et al., 2010; Stryer et al., 2014). Devido a isto, é uma importante
defesa antioxidante para a maioria das células expostas ao oxigênio.
Até momento, três isoformas de SOD estão descritas em mamíferos: a
citoplasmática (SOD-1) Cu/Zn-SOD (Cobre-zinco-SOD); a mitocondrial (SOD2) de
Mn-SOD (Manganês-SOD), e a extracelular (SOD3) Cu/Zn-SOD (Cobre-zinco-SOD),
todas, as quais, requerem metal catalítico (Cu ou Mn) para sua ativação (Perry et al.,
2010; Fukai, Ushio-Fukai, 2011). A enzima SOD catalisa a dismutação dos radicais
superóxido (O2·-) em oxigênio molecular (O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (Perry
et al., 2010). Neste estudo, na avaliação da atividade da SOD no homogeneizado
cerebral, o grupo exposto ao VPA+PM apresentou diminuição significativa no
cerebelo, comparado do controle. Em conjunto com os achados anteriores pode-se
observar que a maior produção de ERO é acompanhado de uma menor capacidade
de reciclagem, configurando desbalanço redox. Com a atividade da SOD e da GSH
diminuídas a homeostase do estado redox fica comprometido e o cérebro exposto a
danos por radicais livres.
Em pesquisa recente, foram verificadas diferenças nas concentrações das
enzimas SOD, GPx e CAT em amostras de sangue em crianças com TEA, indicando
capacidade reduzida de neutralizar H2O2, radical aniônico superóxido e hidróxidos
orgânicos (Waligóra et al., 2019).
Os achados neste estudo indicam que a aplicação do protocolo de VPA
administrado no DG12 e associado a PM do DPN 1-10, provocaram alterações mais
significativas em diversos parâmetros em ratos machos jovens. Sugere-se que as
alterações provocadas pelo VPA durante a gestação, com a PM aplicada no período
crítico de neurodesenvolvimento produziu-se efeitos que se prolongam na vida e
sugerem poder perdurar pela vida toda. Numa visão geral, propõe-se a tabela 2.
 63

Tabela 2: Avaliação do estado redox do homogeneizado cerebral – visão geral

DCF- 2',7'-diclorofluoresceína; PC- Proteína Carbonil; SH- Sulfidrila; NO- Óxido nítrico; GSH- Glutationa
reduzida; SOD- superóxido dismutase. Resultados dos grupos em comparação ao G1: Controle.
↓- Representa diminuição do parâmetro avaliado (p<0,05); ↑- Representa aumento do parâmetro
avaliado (p<0,05); ↑↑- Representa aumento do parâmetro avaliado (p<0,01); ↓↓- Representa diminuição
do parâmetro avaliado (p<0,01); # - não diferiu do controle, mas apresenta-se alterado em relação ao
grupo PM e grupo VPA.

Como observado, os dados demostram que o desequilíbrio redox parece ser

mais pronunciado no cerebelo, seguido do córtex pré-frontal e por último o córtex
posterior, evidenciando singularidade na susceptibilidade do tecido cerebral
dependente de estrutura. Como já descrito, esta pesquisa promoveu a associação de
VPA+PM, desta forma buscou-se um modelo animal de TEA mais complexo. Portanto,
ao analisar o resultado de forma geral sobre os achados do estado redox,
apresentados na tabela 2, identifica-se que o grupo VPA+PM demonstra alterações
em diversos indicadores avaliados. No entanto, mais análises bioquímicas e
comportamentais são necessárias para concluir a eficiência e versatilidade do modelo
proposto.
 64

6 CONCLUSÃO

Autismo é um espectro de transtornos que podem variar em intensidade e em

características, a depender de cada indivíduo. Dados epidemiológicos demonstram
um crescente número de pessoas com TEA, isso pode ter relação com a atualização
da DSM-5 e dos critérios diagnósticos, com isso, o número de casos discutido é de 1
a cada 68 nascidos vivos, mas com o avanço da ciência e tecnologias, estima-se que
este número possa ser maior.
Existem diferentes linhas de estudos, mas pouco se sabe a respeito dos
possíveis mecanismos fisiopatológicos relacionados a etiologia do transtorno do
espectro autista. De fato, muito dos avanços alcançados na compreensão da
fisiopatologia do TEA e no desenvolvimento de terapêuticas é atribuído ao papel
fundamental desempenhado pelos modelos animais, porém, a identificação de um
modelo de TEA ainda é um grande desafio para a ciência devido à complexidade
multifatorial para seu desenvolvimento. Diversos modelos de TEA já foram propostos,
mas que avaliam fenótipos específicos ou mimetizam um número pequeno de sinais
e sintomas.
Na literatura, o modelo mais consolidado é o modelo VPA. O modelo proposto
neste estudo, associa o modelo de VPA à PM precoce, no período crítico de
desenvolvimento do cérebro e, conforme discutido na literatura, esta privação tem
efeito negativo quando crônico, trazendo prejuízos neuropsicológicos ao indivíduo que
perduram na idade adulta e, o VPA produz alterações no cérebro e no
neurodesenvolvimento.
Avaliando os efeitos do protocolo adotado, na interação social, comunicação e
interesse restrito-repetitivo o modelo VPA, segundo os dados estatísticos, demonstrou
alterações na interação e comunicação social conforme observado em humanos com
TEA.
Na análise molecular, para identificação do comprometimento estrutural e
funcional, identificou-se, através dos dados estatísticos que o grupo VPA+PM
apresentou alteração dos níveis de marcadores de estresse oxidativo DCF, proteína
carbonil, sulfidrila, óxido nítrico e diminuição da defesa antioxidante GSH, SOD.
Estas alterações ocorreram nas diferentes regiões testadas, o que sugere, que
diferentes substâncias estão mais ativas e presentes em certas regiões cerebrais do
que em outras, desta forma podem apresentar efeitos fisiológicos singulares. Os
 65

marcadores de estresse oxidativo fortalecem a proposta de associação da PM ao

modelo de VPA como um modelo mais complexo pois, identifica-se a produção de
espécies reativas conforme avaliado por este estudo e também descrito na literatura,
portanto, se o indivíduo tiver uma pré-disposição e viver em condições estressoras na
infância, durante o período crítico de desenvolvimento cerebral, posteriormente, na
fase jovem e/ou adulta poderá apresentar prejuízo de ordem neuropsicológica.
Estudos futuros são necessários para uma melhor investigação dos mecanismos
fisiológicos promovidos pela associação do modelo VPA+PM e poderão responder às
questões ainda em aberto como - por que o grupo VPA+PM não apresentou
alterações em todos os parâmetros e regiões avaliadas? Será que na avaliação
longitudinal (infância/juventude/adulto) os resultados seriam diferentes? Deste modo
processos ainda não compreendidos podem ser avaliados direcionando para
tratamento mais eficientes e menos custosos aos indivíduos com TEA e para suas
famílias.
 66

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ANEXO A