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ABRIR Mudança da microbiota intestinal em frangas

poedeiras alimentadas com alimentos à base

de larvas de soldados negros para melhorar
a comunidade microbiana intestinal saudável
Evalyne W. Ndotono1,2, Fathiya M. Khamis1*, Joel L. Bargul1,2 e Chrysantus M.Tanga1

Globalmente, a maioria dos estudos relacionados à microbiota intestinal se concentrou em frangos de corte devido às
suas diversas comunidades microbianas em comparação com as das galinhas poedeiras. Contudo, em África foram
realizados poucos estudos, apesar dos benefícios crescentes para a indústria avícola. A utilização de dietas à base de insetos
para melhorar a função gastrointestinal e a saúde intestinal em aves está ganhando cada vez mais atenção global.
Aqui, avaliamos os papéis potenciais dos alimentos comerciais baseados em larvas de soldados negros (BSFLF) na
remodelação da abundância, composição e diversidade da microbiota intestinal de galinhas poedeiras usando
sequenciamento Oxford nanopore Minion de alto rendimento do gene 16S rRNA bacteriano de comprimento total.
Duzentos e cinquenta pintos poedeiros ISA Brown foram criados em baias por um período de 20 semanas. As frangas
poedeiras receberam 5 tratamentos dietéticos que foram formulados da seguinte forma: dieta controle (T1): 100% FM +
0% BSFL, T2: 25% BSFL + 75% FM; T3: 50% BSFL + 50% FM; T4: 75% BSFL + 25% FM e T5: 100% BSFL + 0% FM. A
amostragem foi feita nas oito regiões principais, incluindo esôfago, papo, proventrículo, moela, duodeno, íleo, intestino
grosso e ceco. Das 400.064 leituras classificadas analisadas, os filos mais dominantes identificados nos tratamentos
alimentares foram Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria e Actinobacteria. O tratamento dietético com 100% de
inclusão de BSFL apresentou maior diversidade alfa intraespécie e riqueza de acordo com os índices de Chao1 e Shannon.
A avaliação da diversidade beta intraespécie revelou que os tipos de dieta influenciaram significativamente a abundância
da microbiota, mas as diferenças entre os táxons mais abundantes foram semelhantes. Houve aumento na abundância de
bactérias potencialmente benéficas (Lactobacillus, Bacteroides e Enterococcus) com aumento dos níveis de inclusão de
BSFLF nas dietas de frangas poedeiras. Nos diferentes segmentos intestinais, os Lactobacillus dominaram todas as oito
regiões e o ceco foi o segmento mais diversificado. Nossas descobertas desvendam a complexa mudança microbiana
intestinal em galinhas poedeiras alimentadas com BSFLF e, portanto, sustentam os papéis potenciais das bactérias benéficas
como prebióticos e probióticos promissores na remodelação da microbiota intestinal para manter uma boa saúde
intestinal.

Os insetos provaram ser um ingrediente rico em nutrientes na alimentação animal, e seu uso sustentável está ganhando força em todo
o mundo devido ao aumento dos custos das principais fontes de proteína, como farinha de peixe, soja, torta de algodão, entre outras,
que são utilizadas na alimentação animal. feeds1
. Prevê-se que o rápido crescimento da população humana conduza a um aumento da
procura de proteínas animais2,3 . Na África Subsaariana, a produção doméstica de frango constitui a base da
indústria de proteínas, com mais de 80% dos pequenos agricultores contribuindo significativamente para o crescimento da indústria
avícola. Mas um dos principais constrangimentos que impede esta indústria de atingir o seu pleno potencial de produção tem sido a
disponibilidade e acessibilidade a alimentos nutritivos ricos em proteínas4,5 .
A proteína é um ingrediente essencial na alimentação de aves, pois é necessária para o seu crescimento, manutenção do corpo e
alta qualidade da carcaça6,7 . A proteína por si só representa mais de 70% do custo total da produção pecuária e a falta de tais
suplementos proteicos continua a limitar a produção avícola eficiente6 . Nos sistemas agrícolas convencionais,
o farelo de soja e o farelo de peixe são as principais fontes de proteína nas rações para aves8,9 Isso levou a um aumento na demanda
por rações comerciais à base de soja e de farinha de peixe, o que fez com que a disponibilidade de soja e farinha de peixe fosse
limitada devido à os elevados preços de custo e a escassez de recursos10. A oferta de soja e farinha de peixe também tem sido
limitada devido ao facto de também serem utilizadas para consumo humano, criando assim um desequilíbrio entre

1
Centro Internacional de Fisiologia e Ecologia de Insetos (ICIPE), Nairobi, Quênia. 2 Departamento de Bioquímica,
Universidade Jomo Kenyatta de Agricultura e Tecnologia (JKUAT), Nairobi, Quênia. *e-mail: [email protected]

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Tipos de dieta

Ingredientes (%) Dieta 1 (controle) Dieta 2 Dieta 3 Dieta 4 Dieta 5

Germe de milho 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0

Refeição de grãos de soja

21,0 21,0 21,0 21,0 21,0

Farinha de peixe 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0

Soldado negro fy larvas 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0

Óleo vegetal 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Calcário 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Fosfato dicálcico 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Sal iodado (NaCl) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

Pré-mistura Super Layer 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Tabela 1. Composição alimentar das dietas formuladas fornecidas aos pintinhos por um período de oito (8) semanas26. Conteúdo
de pré-mistura de super camada por 2,5 kg: Vit. (Vitamina) A: 8.000.000 UI/kg, Vit. D3: 2.000.000 UI/kg, Vit. E: 3000 mg, Vit.
K3: 2.000 mg, Vit B2: 3.500 mg, Ácido Pantotênico: 6.600 mg, Niacina: 20.000 mg, Ácido Fólico: 550 mg, Vit.
B12: 6 mg, Cloreto de colina: 200.000 mg, Lisina: 350 mg, Metionina: 120 mg, Manganês: 63.000 mg, Ferro: 23.000 mg, Zinco:
63.000 mg, Cobre: 14.000 mg, Cobalto: 1.000 mg, Iodo: 2.000 mg , Selênio: 100 mg e BHT: 120.000 mg. Abreviatura: BSFL-
larvas de soldado negro. FM- farinha de peixe Dieta 1—0% BSFL, Dieta 2—25% BSFL e 75% FM, Dieta 3—50% BSFL e 50% FM,
Dieta 4—75% BSFL e 25% FM e Dieta 5—100% BSFL.

a demanda e a oferta11. Portanto, para satisfazer os requisitos nutritivos para a produção avícola, é necessário identificar fontes de
proteína de baixo custo, disponíveis localmente e sustentáveis para a alimentação animal.
O soldado negro fy (BSF), Hermetia illucens L. (Diptera: Stratiomyidae), é um desses insetos promissores. É comumente criado
para fins industriais e seus benefícios peculiares, como a biorremediação de resíduos orgânicos, devido à sua capacidade de
converter substratos de resíduos orgânicos em biomassa contendo proteína bruta de alta qualidade variando entre 35-57%, melhores
perfis de aminoácidos, altas taxas de crescimento e pouco é necessário espaço para a criação12–15. Como a FMB se alimenta de
uma variedade de resíduos orgânicos, é altamente provável que possam adquirir microrganismos (benéficos ou prejudiciais) desses
substratos, que podem ser transferidos para a alimentação animal16–18. As interações entre a microbiota intestinal e o frango
desempenham um papel fundamental no desenvolvimento do hospedeiro, na saúde e nutrição e na segurança alimentar19,20.
Demonstrou-se que as comunidades microbianas do intestino das galinhas poedeiras desempenham papéis vitais na imunidade, no
desempenho fisiológico e no desenvolvimento nutricional, portanto, quaisquer alterações no seu microbioma intestinal podem ter
efeitos adversos na produtividade, na eficiência alimentar e na saúde geral20–22. Portanto, acredita-se que a dieta das galinhas seja
o principal determinante que influencia a composição da microbiota intestinal e, portanto, alterações nos componentes e aditivos da
ração contribuiriam para a variação na composição de espécies e na diversidade do microbioma intestinal23.
Atualmente, extensa pesquisa tem sido dedicada ao valor nutricional da FMB e à otimização das condições de criação, ignorando
o impacto de espécies patogênicas e contaminantes na nutrição animal. Segundo24 , os insetos para alimentação geralmente são
processados com seu conteúdo intestinal que pode abrigar diversos microrganismos transmissíveis cuja microbiota também pode ser
expressa no exoesqueleto. Portanto, as formulações de dietas à base de farinha de insetos são um aspecto crucial pelo qual devem
ser tomadas precauções de segurança para garantir a segurança dos alimentos à base de insetos. A hipótese de trabalho deste
estudo é que a análise das comunidades microbianas poderia levar à identificação de espécies com características únicas que podem
ser isoladas e exploradas para futuras pesquisas. Além de desempenhar um papel importante no seu hospedeiro, fornecendo
proteínas, a inclusão de larvas de FMB na dieta poderia ter um efeito melhorado no intestino e na saúde geral do frango25. O objetivo
deste estudo foi avaliar a diversidade bacteriana presente no intestino das frangas poedeiras após serem alimentadas com dietas
com vários níveis de inclusão de farinha de larva de soldado negro (BSFL) e também avaliar as comunidades microbianas entre as
diferentes seções intestinais.

Materiais e métodos
Declaração ética. Todos os experimentos foram conduzidos com estrita adesão às diretrizes e procedimentos
experimentais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Organização de
Pesquisa Agrícola e Pecuária do Quênia (KALRO) - Instituto de Pesquisa em Ciências Veterinárias (VSRI); código
de aprovação nº: KALRO—VSRI/IACUC019/30082019. Confirmamos que todos os experimentos foram realizados
em conformidade com as diretrizes ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

Criação de frangos e formulações dietéticas. As galinhas foram criadas na Unidade de Pesquisa Avícola em KALRO, localizada
em Naivasha, condado de Nakuru, Quênia (Lat 0,6835° S, longitude 36,4012° E), conforme descrito por26. Um total de 250 pintinhos
poedeiras ISA Brown de um dia de idade foram adquiridos da Kenchic Limited, Nairobi. Todos foram mantidos em chocadeira e por
um período de 14 dias, as aves jovens receberam dieta controle (taxa de inclusão de FM de 100%) e água ad libitum. Após os 14
dias, as aves foram mantidas em baias com 5 frangos cada e distribuídas aleatoriamente em um dos cinco tratamentos dietéticos.
Cada configuração experimental foi replicada 9 vezes. Eles foram criados por 20 semanas e as aves tiveram acesso diário a ração e
água limpa ad libitum. As aves foram todas vacinadas seguindo um programa conforme mostrado na Tabela S1. Todos os ingredientes
necessários para a formulação dos diversos tipos de dieta tanto para os pintinhos (Tabela 1) quanto para os produtores (Tabela 2)
foram adquiridos e formulados conforme descrito por26.
As larvas de BSF foram obtidas no Centro Internacional de Fisiologia e Ecologia de Insetos (icipe), Nairobi, Quênia. As larvas foram
colhidas no 5º ínstar e secas em estufa a 120 °C utilizando uma estufa de secagem com circulação de ar quente.

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Tipos de dieta

Ingredientes (%) Dieta 1 (controle) Dieta 2 Dieta 3 Dieta 4 Dieta 5

Germe de milho 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0

Polard (trigo) 19,0 19,0 19,0 19,0 19,0

Refeição de grãos de soja

13,0 13,0 13,0 13,0 13,0

Farinha de peixe 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0

Soldado negro fy larvas 0,0 2,5 5.5 7,5 10,0

Calcário 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Fosfato dicálcico 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Sal iodado (NaCl) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

Pré-mistura de camada 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Tabela 2. Composição alimentar das dietas formuladas fornecidas a galinhas poedeiras de crescimento por um período de doze
(12) semanas26. Conteúdo de pré-mistura de super camada por 2,5 kg: Vit. (Vitamina) A: 8.000.000 UI/kg, Vit. D3: 2.000.000 UI/
kg, Vit. E: 3000 mg, Vit. K3: 2.000 mg, Vit B2: 3.500 mg, Ácido Pantotênico: 6.600 mg, Niacina: 20.000 mg, Ácido Fólico: 550 mg, Vit. B12: 6 mg, Cloreto de
colina: 200.000 mg, Lisina: 350 mg, Metionina: 120 mg, Manganês: 63.000 mg, Ferro: 23.000 mg, Zinco: 63.000 mg, Cobre: 14.000 mg, Cobalto: 1.000 mg, Iodo:
2.000 mg , Selênio: 100 mg e BHT: 120.000 mg. Abreviatura: BSFL- larvas de soldado negro. FM- farinha de peixe Dieta 1—0% BSFL, Dieta 2—25% BSFL e 75%
FM, Dieta 3—50% BSFL e 50% FM, Dieta 4–75% BSFL e 25% FM e Dieta 5—100% BSFL.

(Henan Forchen Machinery, Luoyang, Henan, China) e moído em pó que foi misturado com outras matérias-primas para formulação de
dieta. Uma dieta padrão de farinha de peixe convencional (FM) comercializada serviu como dieta controle (T1): 100% FM+0% BSFL,
enquanto as outras 4 dietas foram compostas por: (T2): 25% BSFL+75% FM; T3: 50% BSFL+50% FM; T4: 75% BSFL+25% FM e T5:
100% BSFL+0% FM. As galinhas foram criadas em condições ambientais adequadas, com boa iluminação, temperatura mantida a 30±1
°C e umidade a 70±2% seguindo protocolos e diretrizes conforme instruções da Federação das Sociedades de Ciência Animal27 até
que as galinhas estivessem prontas para a coleta de amostras.

Coleta de amostras. Com 20 semanas de idade, um subconjunto de 75 galinhas foi selecionado aleatoriamente, sendo
utilizadas 15 galinhas por tratamento para coleta de amostras. Os frangos foram abatidos profissionalmente e todo o
intestino foi colhido assepticamente de cada frango. Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor, o estresse e o
desconforto nos animais. As amostras foram extirpadas das 8 seções principais do intestino, incluindo esôfago, papo,
proventículo, moela, duodeno, íleo, intestino grosso e ceco. As amostras foram então colocadas em tubos Eppendorf
limpos e armazenadas a 4 ° C em gelo para transporte para a Unidade de Patologia de Artrópodes em icipe, Quênia, para análise poste

Extração de DNA genômico e amplificação de 16S rRNA. O conteúdo intestinal foi amostrado a partir dos tecidos epiteliais internos
do intestino e utilizado para extração de DNA genômico usando o kit Isolate II Genomic Extraction (Bioline, Londres, Reino Unido)
seguindo as instruções do fabricante. A concentração e a qualidade do DNA foram determinadas usando um espectrofotômetro nanodrop
2000/2000c (Termo Fischer Scientifc, Wilmington, EUA) e aqueles com boa faixa de qualidade de 1,8 a 2,0, com base em A260nm/
A280nm foram selecionados para análises metagenômicas de 16S. O sequenciamento do gene 16S rRNA bacteriano de comprimento
total de ~ 1500 pb foi realizado usando o dispositivo Oxford Nanopore Technologies (ONT) Minion usando células R9.4.1 fow e as
bibliotecas foram preparadas com DNA reunido para multiplexação usando o kit de código de barras 16S SQK-16S024. A preparação
da biblioteca com etapa de PCR foi conduzida usando os seguintes componentes: 10 pmol ÿL-1 de cada código de barras 16S, 10 ng
ÿL-1 de modelo de DNA, 0,625 U ÿL-1 de DNA polimerase MyTaq (Bioline) e reação 5×MyTaq tampão (dNTPs 5 mM, MgCl2 15 mM,
estabilizador e intensificador)
(Biolina). As reações foram preparadas em um volume total de reação de 50 µL e executadas em um termociclador gradiente Master
Cycler Nexus (Eppendorf, Alemanha), sob as seguintes condições: desnaturação inicial por 2 min a 95 °C, seguida de 35 ciclos. de
desnaturação por 30 s a 95 °C, recozimento por 40 s a 55 °C, extensão por 1 min a 72 °C e uma etapa final de extensão de 10 min a 72
°C. As bibliotecas foram então purificadas usando um kit Bioline seguindo as instruções do fabricante e reunidas antes de serem
carregadas nas células de fluxo para sequenciamento Minion.

Sequenciamento e análise de dados. As execuções de sequenciamento foram feitas por 4 h com chamada de base ao vivo realizada
usando a ferramenta Albacore (v2.3.4) no software Minknow (v 20.10.3) na nuvem ONT. As execuções de sequenciamento geraram
arquivos FASTQ que foram carregados no software EPI2ME v 2020.11.19 (https://epi2me.nanoporetech.
com) para identificação qualitativa de espécies em tempo real a partir de amostras metagenômicas. O fluxo de trabalho FASTQ — 16S
(v 2020.04.06) no EPI2ME foi usado para caracterizar as leituras e atribuir taxonomia ao nível do gênero usando NCBI como banco de
dados de referência e gráficos de abundância cumulativa relativa foram gerados. Um limite mínimo de abundância de 0,5% foi utilizado
para selecionar os táxons mais abundantes e aqueles que estavam abaixo deste limite foram colapsados em outros. No entanto, o
EPI2ME é uma ferramenta limitada, uma vez que não fornece parâmetros de diversidade, como diversidade alfa e beta. Assim, o pipeline
QIIME2—v 2020.828 foi usado para processamento adicional para gerar as leituras necessárias para estatísticas de diversidade
bacteriana. No pipeline QIIME2, os adaptadores foram cortados usando a ferramenta trimmomatic (v 0.39) e as leituras foram
demultiplexadas usando a ferramenta ONT porechop (v0.2.4). As leituras demultiplexadas foram verificadas para sequências quiméricas
usando a ferramenta VSEARCH — Qiime2 e as sequências quiméricas encontradas

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Figura 1. Um gráfico de barras empilhadas mostrando (A) Composição taxonômica cumulativa no nível do Filo; e B)
Prevalência de todos os filos táxons observados em perfis intestinais de poedeiras alimentadas com larvas de soldados negros.

foram filtrados usando a ferramenta UCHIIME. As leituras foram então alinhadas usando MAFFT e taxonomia atribuída usando o banco de dados SILVA
132 como banco de dados de referência. As OTUs foram geradas a partir das leituras usando um limite de similaridade de 97%. As leituras foram
normalizadas e rarefeitas para profundidades de amostragem uniformes e a diversidade alfa e beta calculada. A diversidade alfa foi calculada usando o
índice de Shannon e Chao1 no pacote phyloseq em R29.
O teste de Kruskal-Wallis foi aplicado para verificar as diferenças de diversidade alfa entre os tratamentos. Para calcular a diversidade beta microbiana,
foram realizadas análises UniFrac não ponderadas e amostras de distâncias UniFrac visualizadas em gráficos de PCoA. A análise multivariada da
diversidade beta foi verificada utilizando PERMANOVA não paramétrica utilizando o pacote Adonis em R com 999 permutações (P<0,05).

Resultados
Composição da abundância bacteriana. Foram geradas cerca de 400.064 leituras, das quais 338.087 leituras passaram na
filtragem de qualidade e foram classificadas com uma média de 15.500 leituras por tratamento. Os filos mais abundantes e
prevalentes observados em todos os grupos de tratamento incluíram Firmcutes (90%) seguido por Bacteroi-detes (7%) e
porções menores de Proteobacteria (2%) e Actinobacteria (1%) (Fig. 1A, B). Caracterizamos 38 gêneros principais com
abundância relativa de 0,5% e gêneros com abundância relativa <0,5% foram agrupados em 'outros' (Fig. 2). A abundância
relativa cumulativa em nível de gênero mostrou que Lactobacillus (93%), que está associado ao filo Firmicutes, foi o gênero mais
predominante em todos os grupos de tratamento, seguido por Bacteroides (4%), que está associado ao filo Bacteroidetes
( Figura 2). Houve um aumento significativo nas bactérias benéficas como Lactobacillus, Bacteroides, Blautia e Enterococcus
(Fig. S1). Esse aumento foi observado à medida que aumentava o nível de inclusão de farinha de larvas de FMB na dieta. No T5
que tinha 100% de BSF, os níveis de bactérias benéficas aumentaram consideravelmente (Fig. S1A). No entanto, algumas
leituras correspondentes a possíveis bactérias patogénicas clínicas, como Campylobacter, Clostridia, Staphylococcus e
Streptococcus, estavam presentes principalmente em T4 e T5, embora em quantidades muito baixas, inferiores a 1%, o que é
permitido de acordo com as directrizes de segurança alimentar do Kenya Bureau of Standards. (KEBS). Em T3, os patógenos
clínicos eram mínimos, portanto as bactérias benéficas eram excedentes (fig. 2).

As espécies de Lactobacillus foram as bactérias mais abundantes que dominaram todas as partes do intestino das galinhas, incluindo o esôfago,
papo, proventrículo, moela, íleo, intestino grosso e ceco. Te ceca foi o segmento mais diversificado e foi dominado pelo filo Firmicutes, enquanto os
intestinos delgado e grosso tiveram a menor diversidade e foram colonizados por Proteobacteria (Figs. 3, S3).

Diversidade alfa e beta. A diversidade alfa foi avaliada pelo índice de Shannon e mostrou que a dieta T5 que continha 100% de FSC era o grupo mais
diverso, enquanto T3 e T4 que tinham 50 e 70% de FSC, respectivamente, apresentavam a menor diversidade (Fig. 4). O índice de riqueza Chao1
mostrou que T5 (100% BSF) teve a maior riqueza de espécies e a contagem lida mais abundante, com mais de 600 espécies identificadas.

A diversidade beta que foi calculada utilizando o método da distância unifrac não ponderada indicou que o tratamento dietético não afetou
negativamente a diversidade das comunidades microbianas que pareciam todas agrupadas.
Apenas pequenas diferenças foram observadas na composição microbiana e abundância entre os diferentes tratamentos dietéticos (Fig. 5).

Um diagrama de Venn mostrou que 48 gêneros de bactérias eram comuns em todos os cinco tratamentos. Te 100% BSF
o tratamento (T5) teve os gêneros mais exclusivos totalizando 290 (Fig. 6).

Discussão
Compreender a modulação da comunidade microbiana intestinal por fatores como a dieta é crucial como um componente essencial para a saúde das
galinhas20,30. A farinha de larvas de soldado negro (BSFL) é uma alternativa promissora e sustentável à cara farinha de peixe na ração de galinhas Layer
e um estudo feito por26 confirma que a substituição da farinha de peixe

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Figura 2. Composição da abundância cumulativa de bactérias Unidades taxonômicas operacionais identificadas em nível de gênero
nos diferentes tratamentos dietéticos formulados a partir de alimentos à base de larvas de soldados negros.

com a BSFL não inclui o crescimento global e o desempenho económico do frango Poedeira. Este estudo teve como objetivo analisar
os efeitos da alimentação com farinha de soldado negro fy (BSF) na composição microbiana intestinal de frangas poedeiras usando
sequenciamento Oxford Nanopore 16S. Aqui observamos que a substituição parcial da farinha de peixe convencional por dietas à
base de BSFL teve uma influência positiva nas comunidades microbianas intestinais das frangas poedeiras.
Este relatório está relacionado com um estudo anterior realizado por25 que relatou que a inclusão de farinha à base de FSB nas
dietas de galinhas poedeiras não teve um efeito negativo na sua nutrição e na composição da microbiota intestinal. Alta riqueza e
diversidade microbiana foram observadas em dietas que apresentavam altas concentrações de FMB, especialmente na dieta de
tratamento que tinha 100% de inclusão de FMB. Vários estudos relataram recentemente que uma alta diversidade bacteriana tende
a estar associada a um trato gastrointestinal saudável, o que melhora o estado geral de saúde das aves25,31. Portanto, a galinha
poedeira alimentada com BSFL em nosso estudo pode ter uma comunidade microbiana intestinal mais saudável, uma vez que a
riqueza e diversidade de espécies foi maior do que a dieta convencional de farinha de peixe padrão.
Identificamos em todas as dietas de tratamento que os filos de bactérias mais predominantes incluíam Firmicutes (90%),
Bacteroidetes (7%), Proteobacteria (2%) e Actinobacteria (1%). Também foram observadas porções menores de Cianobactérias,
Deferribacteres, Spirochaetes, Tenericutes e Verrucomicrobia. Nossos resultados apoiam relatórios anteriores mostrando Firmicutes,
Bacteroidetes, Proteobacteria e Actinobacteria como estando entre os filos dominantes em todas as partes do trato gastrointestinal
das galinhas19,21,32. O filo Firmicutes representa as classes de bactérias mais benéficas que são importantes tanto em animais
quanto em humanos, incluindo Lactobacillales, Bacillales, Clostridia e Veillonellales33. Os gêneros mais abundantes observados em
todos os tratamentos dietéticos foram principalmente Lactobacillus, Enterococcus e Blautia que estão associados ao filo Firmicutes
e Bacteroides que estão associados ao filo Bacteroidetes. No entanto, as dietas com inclusão de farinha de BSF apoiaram as
mesmas comunidades microbianas que a dieta padrão de farinha de peixe, tanto a nível de filo como de género, com apenas alguns
táxons mudando em abundância.
Um aumento significativo nas bactérias do ácido láctico (Lactobacillus, Enterococcus e Bacteroidetes) foi observado nas dietas que
tinham uma maior concentração de BSF, implicando assim que os alimentos à base de larvas de soldados negros (BSFLF) podem
ter o potencial de aumentar as atividades probióticas em a tripa da galinha. Sabe-se que as bactérias do ácido láctico (LABs)
produzem bacteriocinas que inibem as bactérias patogénicas no intestino, pelo que podem ser utilizadas como indicadores de um
intestino saudável31.
Em todo o intestino, a maior diversidade de bactérias foi observada no ceco, enquanto a menor diversidade foi registrada no
esôfago, proventículo e intestino delgado. Essa baixa densidade pode ser devida ao curto tempo de passagem por essas partes e à
diluição da digesta no intestino delgado22. Lactobacillus, da família Lac-tobacillaceae, foi observado como o táxon mais dominante
em todos os tratamentos dietéticos e todas as partes do intestino com as maiores contagens lidas foram registradas na colheita e no
ceco. Esta família de bactérias são comensais benéficos que foram extensivamente estudados nas indústrias de alimentos e
medicamentos, tanto em humanos quanto em animais34.
As espécies de Lactobacillus, sendo um componente intrínseco da microbiota intestinal, são agora reconhecidas como os candidatos
probióticos mais eficazes. Foi relatado que essas bactérias produtoras de ácido láctico trazem vários benefícios à saúde humana,
alguns dos quais incluem estimulação de respostas imunológicas, atividade anticâncer, prevenção e tratamento de doenças
inflamatórias35, alívio da intolerância à lactose, atividade antimicrobiana.

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Figura 3. Gêneros de bactérias identificados em todos os segmentos intestinais de galinhas poedeiras alimentadas com larvas de
soldados negros.

contra patógenos resistentes e infecções virais respiratórias36. Espécies de Lactobacillus foram identificadas como produtoras de ácidos
láctico e acético que ajudam a reduzir o valor do pH no intestino e a competir com potenciais patógenos por nutrientes através de interações
competitivas diretas, suprimindo assim o potencial de colonização de alguns dos principais patógenos34. Além disso, os Lactobacillus têm
sido utilizados como alternativas aos antibióticos promotores de crescimento em aves e como suplementos alimentares para melhorar o
desempenho do crescimento23. Isto pode reduzir a administração de antibióticos na alimentação em sistemas de produção avícola. Os
antibióticos têm sido amplamente utilizados como agentes promotores de crescimento na produção avícola e isto levou-os a estar sob
intenso escrutínio devido aos seus efeitos adversos, tais como o aumento da emergência de bactérias patogénicas resistentes e o risco de
transferência zoonótica de agentes patogénicos resistentes para os seres humanos37. Lactobacillus está sendo considerado uma
alternativa segura aos antibióticos devido ao seu modo de ação como probiótico em animais. Na saúde das aves, os probióticos foram
identificados como tendo efeitos benéficos sobre a saúde intestinal.

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Figura 4. Medida de diversidade alfa utilizando índice de Shannon e índice de riqueza Chao1 mostrando amostras de acordo
com tratamentos dietéticos.

Figura 5. Gráfico de diversidade beta PCoA baseado no método de dissimilaridade de distância unifrac não ponderada entre
os diferentes tratamentos dietéticos. [PERMANOVA] R-quadrado: 0,11509; Valor de p>0,05.

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Figura 6. Diagrama de Venn mostrando as Unidades Taxonômicas Operacionais compartilhadas e únicas identificadas
entre tratamentos com T5 tendo as espécies únicas mais identificadas.

alterações histológicas, desempenho de crescimento, imunomodulação, bem como melhoria das características sensoriais da
carne de aves38. Alayande et al.39 relataram em seus estudos que Lactobacillus estimula o crescimento de micróbios benéficos
em animais prevenindo a colonização de patógenos entéricos através de sua capacidade de produzir substâncias antimicrobianas.
Esses resultados são semelhantes a um estudo realizado por40 que observou que o uso de Lactobacillus como probiótico na
produção de suínos melhorou o desempenho do crescimento com aumento das taxas de crescimento e taxas de conversão
alimentar. Esses vários estudos mostram que o Lactobacillus como probiótico tem um grande potencial como alternativa aos
agentes antibióticos na produção avícola. Bacteroides, Enterococcus e Blautia também foram identificadas como bactérias
benéficas abundantes em nossas amostras e seu papel na degradação de polissacarídeos para produzir ácidos graxos de
cadeia curta (AGCCs), como ácido acético, butirato, propionato e lactato, foi bem documentado33. Sabe-se que estes SCFAs
reduzem bactérias indesejáveis e prejudiciais, inibindo patógenos sensíveis a ácidos e promovendo o crescimento da mucosa,
estimulando a proliferação de células epiteliais intestinais. Também atuam como fonte de energia e estabilizam os níveis de
glicose nas aves41.
Notavelmente, algumas bactérias patogênicas do gênero Campylobacter foram identificadas, incluindo espécies de Campy-
lobacter jejuni, Campylobacter lari, Campylobacter coli e Campylobacter upsaliensis. Bactérias Campylobacter foram observadas
nos cecos de galinhas poedeiras alimentadas com dieta 4 (T4) e 5 (T5) que apresentavam 75% e 100% de BSF,
respectivamente, sugerindo que o soldado negro fy pode atuar como um vetor mecânico transmitindo as cepas patogênicas
para o frango através da ração em altas concentrações. No entanto, a abundância das bactérias detectadas estava entre os
níveis permitidos conforme estabelecido pelo Comité de Projectos de Normas, desenvolvido por42 sobre a utilização de insectos para aliment
A partir de um estudo recente conduzido por18 sobre a dinâmica microbiana do soldado negro criado em diferentes substratos
orgânicos, a bactéria Campylobacter foi identificada como uma das espécies prevalentes no intestino de soldados negros não
processados. Campylobacter estão associados ao filo Proteobacteria e são as principais bactérias patogênicas identificadas em
aves que em grandes quantidades podem causar campilobacteriose em humanos43. Como resultado, recomendamos o uso de
substratos seguros e estéreis na criação de BSF para alimentação, a fim de eliminar tais contaminantes que podem ter impacto
nas vantagens do uso de larvas de BSF na produção avícola.

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Conclusões
Nosso estudo foi capaz de desvendar várias bactérias importantes na saúde avícola e os dados demonstraram que a farinha de larvas de
soldado negro é uma alternativa válida de proteína animal para substituir a farinha de peixe na alimentação de aves. Estas bactérias
benéficas poderiam ser ainda mais exploradas na indústria avícola para produzir probióticos e prebióticos para melhorar a saúde e nutrição
das aves. No entanto, havia vestígios de bactérias patogénicas nocivas que podem ter sido colhidas nos substratos de criação. Portanto, a
escolha do substrato orgânico utilizado na criação de BSFL é crucial para minimizar a transmissão vertical de patógenos que podem
representar riscos à saúde das aves e dos consumidores.
Outras técnicas de processamento pós-colheita das larvas do substrato devem garantir que todos os agentes patogénicos sejam
completamente eliminados para limitar a sua transferência para a cadeia de valor dos alimentos para animais. A inclusão de farinhas à base
de insetos na dieta das aves deve ser considerada após o estabelecimento de medidas de segurança, como melhores técnicas de
processamento e armazenamento, esterilização de substratos orgânicos antes da criação da BSF e métodos adequados de formulação de
dieta para eliminar contaminantes microbianos e produzir rações que garantam a contaminação microbiana. segurança das populações de aves de capoei

Disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados gerados e/ou analisados durante o presente estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação
razoável.

Recebido: 7 de março de 2022; Aceito: 19 de setembro de 2022

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Reconhecimentos
Reconhecemos com gratidão a Sra. Esther K. Sumbule pela criação e fornecimento da galinha poedeira usada neste estudo. Agradecemos
também ao Sr. Fidelis L. Ombura e à Sra. Maureen A. Ong'ong'e pela assistência técnica na realização dos experimentos de laboratório.
Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Mark Wamalwa por seus insights sobre a análise de dados. Reconhecemos o apoio financeiro da
Agência Norueguesa para a Cooperação para o Desenvolvimento, da Secção de Investigação, Inovação e Ensino Superior. Subsídio N.º
RAF-3058 KEN-18/0005 (CAP-África), Organização Holandesa para a Investigação Científica, WOTRO Ciência para o Desenvolvimento Global
(NWO-WOTRO)
(ILIPA—W 08.250.202), o Centro Canadense de Pesquisa para o Desenvolvimento Internacional (IDRC) e o Centro Australiano de Pesquisa
Agrícola Internacional (ACIAR) (INSFEED—Fase 2: Cultivate Grant No: 108866-001) e a Fundação Rockefeller (SiPFeed— Subvenção nº:
2018 FOD 009) e o prêmio Food Planet Prize da Fundação Curt Bergfors por meio do Centro Internacional de Fisiologia e Ecologia de Insetos
(icipe). Também reconhecemos plenamente o apoio do financiamento principal do icipe fornecido pelo Gabinete de Relações Exteriores, da
Commonwealth e de Desenvolvimento do Reino Unido (FCDO); a Agência Sueca de Cooperação para o Desenvolvimento Internacional (Sida);
a Agência Suíça para o Desenvolvimento e Cooperação (SDC); a República Federal Democrática da Etiópia; e o Governo da República do
Quénia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta e análise de dados, na decisão de publicação ou na
preparação do manuscrito. Portanto, as opiniões aqui expressas não refletem necessariamente a opinião oficial dos doadores.

Contribuições do autor
CMT, EWN e FMK conceberam o experimento; CMT, EWN e FMK projetaram o experimento; software, EWN e FMK; investigação, CMT, EWN
e FMK; recursos, CMT.; redação – preparação do rascunho original, JLB, CMT, EWN e FMK; redação – revisão e edição, JLB, CMT, EWN e
FMK; visualização, JLB, CMT, EWN e FMK; supervisão, JLB, CMT e FMK; administração de projetos, CMT; aquisição de financiamento, os
autores da CMT Te leram conjuntamente e deram seu consentimento para a versão publicada do manuscrito.

Interesses competitivos
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Informações adicionais
Informações Complementares A versão online contém material suplementar disponível em https://doi.org/
10.1038/s41598-022-20736-0.

Correspondências e solicitações de materiais devem ser endereçadas à FMK

Informações sobre reimpressões e permissões estão disponíveis em www.nature.com/reprints.

Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações
institucionais.

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