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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E

TECNOLOGIA GOIANO – IF GOIANO - CAMPUS RIO VERDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROQUÍMICA

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO ÓLEO ESSENCIAL

DA CASCA DA FRUTA CITRUS RETICULATA

Autora: Anne Caroline da Silva Duarte Oliveira

Orientadora: Dra. Cassia Cristina Fernandes Alves

RIO VERDE – GO
Novembro – 2020
 ii

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E

TECNOLOGIA GOIANO – IF GOIANO - CAMPUS RIO VERDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROQUÍMICA

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO ÓLEO ESSENCIAL

DA CASCA DA FRUTA CITRUS RETICULATA

Dissertação apresentada, como parte das

exigências para obtenção do título de MESTRE
EM AGROQUÍMICA, ao Programa de Pós-
Graduação em Agroquímica do Instituto Federal
de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano –
Campus Rio Verde - Área de concentração
Agroquímica

Autora: Anne Caroline da Silva Duarte Oliveira

Orientadora: Dra. Cassia Cristina Fernandes Alves

RIO VERDE – GO
Novembro – 2020
 iii

Repositório Institucional do IF Goiano - RIIF Goiano

Sistema Integrado de Bibliotecas

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CIENTÍFICAS NO REPOSITÓRIO INSTITUCIONAL DO IF GOIANO

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permissão assinada abaixo, em formato digital para fins de leitura, download e impressão, a
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[ x Dissertação [ ] Capítulo de Livro
]
[ ] Monografia – Especialização [ ] Livro
[ ] TCC - Graduação [ ] Trabalho Apresentado em Evento
[ ] Produto Técnico e Educacional - Tipo:
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Nome Completo do Autor: Anne Caroline da Silva Duarte Oliveira

Matrícula: 20182033103I0015
Título do Trabalho: Caracterização química e atividades biológicas do óleo essencial da
casca da fruta citrus reticulata
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Rio Verde, GO, 26/01/2021.

Local Data

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Ciente e de acordo:

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 iv

SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DE

EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL DE
EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA GOIANO

Documentos 72/2020 - NREPG-RV/CPG-RV/DPGPI-RV/CMPRV/IFGOIANO

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO ÓLEO ESSENCIAL DA

CASCA DA FRUTA
DE CITRUS RETICULA TA
Autora: Anne Caroline da Silva Duarte
Oliveira Orientadora: Cassia Cristina
Fernandes Alves

TITULAÇÃO: Mestre em Agroquímica - Area de Concentração Agroquímica

APROVADA em 30 de novembro de 2020.
Prof. Dr. Eugenio Miranda Prof. a Dr. a Erika Crispim
Resende
Sperandio Avaliadora externa - IF Goiano /
Avaliador externo - IF Goiano / Campus Iporá
Polo de Inovação
Prof. a Dr. a Adriane da Silveira Gomes Prof. a Dr. a Cassia Cristina
Avaliadora externa - IF Goiano / Fernandes Alves
Campus Iporá Presidente da Banca - IF Goiano /
Campus Rio Verde

Documento assinado eletronicamente por:

• Erika Crispim Resende, PROFESSOR ENS BASICO TECN TECNOLOGICO, em 01/12/2020
• Adriane da Silveira Gomes, PROFESSOR ENS BASICO TECN TECNOLOGICO, em 30/11/2020
• Eugenio Miranda Sperandio, 2019102331540209 - Discente, em 30/11/2020 11:54:03.
• Cassia Cristina Fernandes Alves, PROFESSOR ENS BASICO TECN TECNOLOGICO, em 30/11/2020

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(64) 3620-5600
 v

AGRADECIMENTOS

Quero agradecer primeiramente a Deus, que me deu forças para eu continuar e chegar até
aqui.

A minha mãe Ada Jeane, que têm sido meu suporte durante toda essa caminhada, e eu não
teria conseguido nada disso sem ela. Você é meu exemplo.

A minha melhor amiga e parceira de vida, Kerollin Hanay, por muitas vezes me ajudar a
continuar quando eu queria desistir me apoiando, comemorar cada passo comigo, obrigada por estar
sempre ao meu lado.

A minha orientadora Dra. Cassia Fernandes, eu não tenho como agradecer por todo apoio,
você é uma pessoa incrível, pela qual eu tenho muita admiração. Ao professor Mayker Dantas que me
coorientou e sempre esteve disposto a me ajudar.

A todos os alunos e colegas do Laboratório de Produtos Naturais, Ao Instituto Federal Goiano

Campus Rio Verde e ao Programa de Pós-Graduação em Agroquímica pela oportunidade.
 vi

BIOGRAFIA DO AUTOR

Anne Caroline da Silva Duarte Oliveira, filha de Ada Jeane da Silva Duarte e Elziron
Messias de Oliveira, nasceu em 12 de maio de 1997 na cidade de Iporá-GO. Graduou-se em
Licenciatura em Química no Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano - Campus
Iporá, e em setembro do mesmo ano ingressou no Programa de Pós-Graduação em Agroquímica
nível Mestrado no Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano – Campus Rio
Verde.
 vii

ÍNDICE

Página
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 1
1.1 FAMÍLIA RUTACEAE…………………………………………………………………….. 1
1.2 ÓLEOS ESSENCIAIS DOS CITROS………………………………………………………. 2
1.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DOS
CITROS……………………………………………………..…………………………………... 3
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................ 4
2. OBJETIVOS.............................................................................................................................. 7
2.1 Geral........................................................................................................................................ 7
2.2 Específicos.............................................................................................................................. 7
3. CAPÍTULO I............................................................................................................................ 8
3.1 INTRODUÇÃO…………………………………………………………………………….. 8
3.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO…………………………………………………………… 9
3.3 CONCLUSÕES……………………………………………………………………………... 9
3.4 SESSÃO EXPERIMENTAL……………………………………………………………….. 13
3.4.1 MATERIAL DA PLANTA……………………………………………………………… 13
3.4.2 EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL………………………………………………….. 13
3.4.3 IDENTIFICAÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO DE CASCA DE FRUTA DE C. RETICULATA
(OE-CR)…………………………………………………………………………………… …… 14
3.4.4 ENSAIO LARVICIDA………………………………………………………………………14
3.4.5 ENSAIO ANTILEISHMANECIDA…………………………………………………………15
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………………………. 16
4 CAPÍTULO II………………………………………………………………………………….. 18
4.1 INTRODUÇÃO……………………………………………………………………………… 18
4.2 MATERIAL E MÉTODO…………………………………………………………………. 20
4.2.1 MATERIAL DA PLANTA……………………………………………………………….. 20
4.2.2 EXTRAÇAO DO ÓLEO ESSENCIAL………………………………………………… 20
4.3 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO PELO MÉTODO DE DIFUSÃO EM DISCO.. 21

4.4 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO PELO MÉTODO DE DIFUSÃO EM DISCO POR

EVAPORAÇÃO…………………………………………………………………………….. 22
4.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO…………………………………………………………. 22
4.6 CONCLUSÕES………………………………………………………………………….. 27
 viii

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………………… 28
4.7 CONCLUSÕES GERAIS………………………………………………………………… 31
 ix

ÍNDICES DE TABELA
Capítulo I
Tabela 1. Composição química do óleo essencial da casca da fruta da Citrus reticulata (CR-
OE)…………………………………………………………………………………………… 16
Tabela 2. Atividade Antileishmanicida do óleo essencial da casca da fruta do Citrus Reticulata (CR-
OE)…………………………………………………………………………………………… 17
 x

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Árvore pertencente a fámilia Rutaceae e ao genero Citrus Reticulata............................ 1
Figura 2. Percentual de inibição do crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum de
diferentes doses do óleo essencial da casca de Citrus Reticulata (CR-EO) através do método de
difusão em
disco……………………………………………………………………………………………...23
Figura 3. Percentual de inibição do crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum de
diferentes doses do óleo essencial da casca de Citrus Reticulata (CR-EO) através do método de
difusão em disco por evaporação do
OE..............................................…………………………………………………………………24
 xi

LISTA DE ABREVIAÇOES

OEs Óleos Essenciais

OE-CR Óleo Essencial Citrus Reticulata
CG-FID Cromatografia gasosa-detecção de ionização de chama
CG-EM Cromatografia gasosa-espectrometria de massa
DMSO Dimetilsulfóxido
CL50 Concentração letal a 50%
BDA Batata dextrose agar
 xii

RESUMO

OLIVEIRA, A. C. S. D. Insituto Federal de Educação, Ciencia e Tecnologia Goiano – Campus Rio

Verde, novembro de 2020. Caracterização e Atividades Biológicas do óleo essencial da casca da
fruta Citrus Reticulata. Orientadora: Dra. Cássia Cristina Fernandes Alves. Coorientadores: Dra.
Elizabeth Josefi e Dr. Mayker L. Dantas Miranda.

Óleos essenciais (OE’s) são produtos naturais extraídos de plantas através de diversos métodos de
extração, como por exemplo, hidrodestilação. Frutas cítricas, que são muito ricas em óleos
essenciais, pertencem a família Rutaceae que possui diversas espécies que pertencem ao genero
“Citros”, como por exemplo o limão (Citrus Limon), a laranja (Citrus Sinensi) e a mexerica (Citrus
Reticulata). Os OE’s proveniente dessas espécies são conhecidos por possuírem atividades
biológicas, como, antibacteriana, larvicida e antifúngica. Assim, o objetivo deste trabalho foi a
extração do OE da casca da fruta da mexerica cheirosinha (Citrus Reticulata) para a avaliação de
suas atividades biológicas e químicas. O óleo essencial da mexerica (OE-CR) foi extraído por
hidrodestilação e a identificação dos componentes químicos presentes foi realizada por
cromatografia gasosa com detector de chama (CG-FID) e por cromatografia em fase gasosa
acoplada ao detector de massa (CG-EM). A atividade biológica in vitro foi testada como larvicida,
Aedes aegypti, e anti-Leishmanicida, Leishmania amazonensis. A atividade antifúngica do OE-CR
foi avaliada pelo método de difusão em disco e pelo método de evaporação do óleo essencial frente
ao fungo Sclerotinia Sclerotiorium. A análise química revelou treze compostos identificados no óleo
essencial da casca da fruta e representam 97,8% do total dos componentes do óleo. O OE-CR
apresentou alta atividade contra formas promastigotas de Leishmania amazonensis e revelou
também alta atividade larvicida contra larvas de terceiro instar de Aedes aegypti. Na atividade
antifúngica o OE-CR apresentou alta inibição do crescimento mycelial do fungo testado para o
método de difusão em disco. O método de evaporação também apresentou atividade, porém, menor
quando comparada ao de difusão.
 xiii

PALAVRAS-CHAVES: Atividade antifúngica, atividade antileishmanecida, atividade larvicida,

limoneno.

ABSTRACT

OLIVEIRA, A. C. S. D. Goiano Federal Institute of Education, Science and Technology - Rio Verde
Campus, November 2020. Characterization and Biological Activity of the essential oil of the fruit
peel Citrus Reticulata. Advisor: Dra. Cássia Cristina Fernandes Alves. Co-advisor: Dra. Elizabeth
Josefi and Dr. Mayker L. Dantas Miranda.

Essential oils (EO's) are natural products extracted from plants through various extraction methods,
such as hydrodistillation. Citrus fruits, which are very rich in essential oils, belong to the Rutaceae
family, which has several species that belong to the genus “Citros”, such as lemon (Citrus Limon),
orange (Citrus Sinensi) and tangerine (Citrus Reticulata). The OE's from these species are known to
have biological activities, such as antibacterial, larvicidal and antifungal. The objective of this study
was the OE extraction from the peel of the cheirosinha tangerine (Citrus Reticulata) fruit to evaluate
its biological and chemical activities. The essential oil of the tangerine (CR-EO) was extracted by
hydrodistillation and the identification of the chemical components present was carried out by
chromatography in gas phase (CG-FID) and gas chromatography mass spectrometry (CG-EM). The
biological activity in vitro was studied to larvicide, Aedes aegypti, and anti-Leishmania, Leishmania
amazonensis. The antifungal activity of the OE-CR was evaluated using the disk diffusion method
and the fumigation method against the fungus Sclerotinia Sclerotiorium. The chemical analysis
revealed thirteen compounds identified in the fruit's peel oil and represent 97.8% of the total
components of the oil. The CR-EO showed high activity against promastigote forms of Leishmania
amazonensis and also revealed high larvicidal activity against third instar larvae of Aedes aegypti. In
antifungal activity, the OE-CR presents high mycelial growth inhibition by the disk diffusion method.
The evaporation method showed less activity when compared to the diffusion method.

KEY WORDS: Antifungal activity, anti-aging activity, limonene, larvicidal activity.

xiv
 1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Família Rutaceae

As plantas têm sido utilizadas com fins medicinais desde o início da
civilização humana com a finalidade de prevenção, tratamento e cura de diversas
doenças. A família Rutaceae consiste aproximadamente de 150 gêneros e 1.600
espécies, distribuídas amplamente em regiões tropicais, subtropicais e temperadas do
mundo. O Citrus é um gênero que compreende aproximadamente 70 espécies que são
ricas em flavonoides, óleos voláteis, cumarinas e pectinas (Carvalho, et al., 2013).

Figura 1. Frutos pertencentes a árvore da fámilia Ruataceae e ao gênero Citrus

Reticulata (FONTE: https://www.safarigarden.com.br/muda-de-mexerica).
A família rutaceae é caracterizada por árvores ou arbustos aromáticos,
algumas vezes espinescentes; com folhas alternas ou ocasionalmente opostas, folhas
compostas ou raramente simples, sem estípulas e com pontuações translúcidas no
limbo. Destaca-se o gênero Citrus (laranjas, limões e limas) pela notável importância
econômica. Entretanto, outras espécies apresentam potencial farmacêutico, madeireiro
e ornamental (Buril, Thomas & Alves, 2014).
O principal centro de diversidade da família Rutaceae é a Australásia, e os
centros secundários estão no sul da África e na América Tropical. Na região
 2

Neotropical ocorrem a cerca de 52 gêneros, e no Brasil 32 gêneros e 195 espécies

(BFG, 2015), com diversidade concentrada na floresta Atlântica e na Amazônia. Na
Serra dos Carajás foram registradas 20 espécies de Rutaceae, pertencentes a 15
gêneros, porém apenas oito delas (em seis gêneros) ocorrem sobre substrato de canga
(Piranni & Devecchi, 2018).
O crescimento da produção nas indústrias de alimentos tem causado aumento
de resíduos dos citros (cascas e sementes). Esses resíduos são mais frequentemente
descartados, causando problemas de contaminação ambiental pois eles têm maior
probabilidade de serem degradados por microrganismos.
A família Rutaceae contém vários metabólitos secundários, especialmente
cumarinas, alcaloides, triterpenos, limonoides e flavonoides e muitos desses
metabólitos apresenta atividades, incluindo larvicida, antibacteriana e antifúngica
(Duarte,et al., 2019).

1.2 Óleos essenciais dos citros

Os óleos essenciais que são nomeados como óleos voláteis, óleos aromáticos,
óleo etéricos são um dos componentes importantes dos produtos químicos vegetais.
Esses óleos originados de plantas aromáticas podem ser encontrados em toda a planta
ou em órgãos como folhas, frutas, casca, eles são misturas complexas de compostos
orgânicos voláteis produzidos como metabólitos secundários nas plantas. Eles são
constituídos por hidrocarbonetos (frequentemente mono e esquiterpenos) e compostos
oxigenados (álcoois, ésteres, éteres, aldeídos, cetonas, lactonas, fenóis e éteres de
fenol) (Bozkur et al., 2017). Espécies do gênero Citrus foram destacadas porque são
ricas em óleos essenciais que são muito versáteis e frequentemente usados como
aromatizantes em diversos produtos, como bebidas, sabonetes, cosméticos e produtos
domésticos (Lemes et al., 2017).
Por seus valores nutricionais e aromas agradáveis, alguns sucos de frutas
cítricas são utilizados como bebida funcional. Limonoides são os principais
compostos encontrados nas cascas de frutas cítricas, e produzem o sabor amargo e o
aroma das raspas
Eles são misturas naturais complexas de substâncias lipofílicas, que podem
conter a cerca de 20-60 componentes em diferentes concentrações. Eles são
caracterizados por dois ou três componentes principais (limoneno, p-cimeno e o-
 3

cimeno) em concentrações razoavelmente altas (20-70%) em comparação com outros

compostos presentes em pequenas quantidades (Palazollo, et al., 2013).
Os efeitos farmacológicos dos principais constituintes dos OEs foram
focalizados por muitos grupos de pesquisa em nos últimos anos. Podendo ser
destacadas suas atividades antioxidante, anticanceriana e anti-inflamatório. (Lenardao,
et al., 2016).

1.3 Atividade biológica dos OEs dos citros

OEs e extratos obtidos de muitas destas plantas ganharam recentemente
grande popularidade e interesse científico. Na maioria das plantas os compostos
fenólicos são classificados e são reconhecidos como GRAS (Generally Regarded As
Safe - Geralmente Considerado Como Seguro), portanto, podem ser usados para
impedir o crescimento de muitos microrganismos patogênicos e deteriorantes em
alimentos (Velazquez-Nunes,et al., 2013).
Os OEs cítricos podem ser usados como fungicidas naturais e estão presentes
em grandes quantidades no flavedo das frutas cítricas. Seus constituintes voláteis são
uma mistura de monoterpeno (limoneno) e sesquiterpeno, hidrocarbonetos e seus
derivados oxigenados, como aldeídos, cetonas, ácidos, álcoois e ésteres, o conteúdo
depende do cultivar cítrico específico, bem como da extração e métodos de separação
(Tao, Jia & Zhou, 2013).
A aplicação de conservantes antifúngicos para inibir o crescimento de fungos
e produção de micotoxinas durante os processos alimentares foi considerada como
uma das estratégias eficazes para melhorar a segurança da cadeia de mantimentos de
alimentos. Agentes antifúngicos naturais, como alguns óleos essenciais (OEs),
receberam atenções crescentes, como alternativas possíveis para combater fungos,
aproveitando assim ao máximo os componentes dos citros para desenvolver novos
produtos e melhorar a utilização e o valor agregado (Wang et al., 2019), pois os
fungos patogênicos e toxigênicos são controlados principalmente por fungicidas
sintéticos, mas seu tratamento pode ser frequentemente problemático por sua natureza
residual e alta toxicidade para mamíferos (Singh et al., 2010).

Outra aplicação para OEs de frutas cítricas é como agentes de controle de

larvas de mosquitos, uma vez que estes constituem uma rica fonte de compostos
bioativos que são biodegradáveis e não tóxicos para a saúde humana, tornando-os
 4

produtos potencialmente adequados para aplicação. Na verdade, pesquisadores têm

relatado a eficácia dos óleos essenciais de plantas usados contra larvas de mosquitos
(Mdoee, et al., 2014).
Leishmaniose, uma infecção parasitária causada por protozoários do gênero
Leishmania. A cerca de 350 milhões de pessoas em todo o mundo correm o risco de
contrair uma das formas da doença, e a cerca de 2 milhões novos casos ocorrem
anualmente, principalmente entre os mais pobres populações em países em
desenvolvimento (Kauffman,et al., 2019). Estudos vêm sendo realizados para
utilização de OEs e extratos de plantas contra as formas da Leishmaniose (Howell,et
al., 2015; Islamuddin,et al., 2015; Marques,et al., 2011; Cardoso,et al., 2015;
Andrade,et al., 2018).
S. sclerotiorum é um patógeno altamente prejudicial com diversos modos de
infecção e alimentação estilo de vida dupla do biotrófico e do necrotrófico. Ele ataca
as plantas hospedeiras por meio de ascósperos que podem ser descarregado a força
para cima da apotécia pelo o ar, ou pelo micélio decorrentes de tecido infectado ou de
escleródios germinados no solo (Xia,et al., 2020). Com intenção de manejo do
fitopatógeno na agricultura, vem se buscando alternativas aos fungicidas tradicionais
que acabam causando grande impacto ambiental e na saúde humana. Uma das opções
é a utilização dos OEs e extratos de plantas bioativas que possuem efeito inibitório
para os fitopatógenos e que sejam menos agressivos para o meio ambiente e saúde
humana (Fontana,et al., 2020).

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 7

2. OBJETIVOS

2.1. Geral
Identificar os compostos do óleo essencial da casca da mexerica cheirosinha
(citrus reticulata) e analisar suas atividades biológicas.

2.2. Específicos
• Realizar extração do óleo essencial da casca da fruta Citrus reticulata;
• Identificar a composição química do óleo essencial da casca da fruta Citrus
Reticulata;
• Avaliar as atividades leishmanicida e larvicida in vitro do óleo essencial da
casca da Citrus Reticulata (OE-CR);
• Avaliar a atividade antifúngica do OE-CR da casca da fruta frente a
Sclerotinia sclerotiorum.
 8

3. CAPÍTULO I
(Normas de acordo com a revista Brazillian Archives of Biology and Tecnology)

Óleo essencial de casca da fruta Citrus reticulata: composição

química, atividades larvicida e antileishmanicida in vitro
Resumo
Estudos realizados investigaram a composição química e as atividades biológicas dos
óleos essenciais de casca de frutas, folhas e flores de diferentes espécies de citros.
Este trabalho tem como objetivo investigar a composição química, as atividades
larvicida e leishmanicida do óleo essencial da casca da fruta Citrus reticulata (OE-
CR). O OE-CR foi obtido por hidrodestilação em aparelho do tipo Clevenger, e a
composição química analisada por GC-MS e GC-FID. Limoneno (85,7%), ɣ-
terpineno (6,7%) e mirceno (2,1%) foram os principais componentes identificados.
OE-CR apresentou atividade contra formas promastigotas de Leishmania
amazonensis (IC50 = 8,23 µg / mL). O CR-OE revelou também para a atividade
larvicida contra larvas de terceiro instar de Aedes aegypti a concentração letal (CL50
= 58,35 µg / mL) e 100% de mortalidade a 150 µg / mL. Neste estudo os OEs
apresentaram atividades larvicidas e contra formas promastigotas de Leishmania
Amazonensis.
Palavras-chave: Aedes aegypti; limoneno; doença viral; Leishmania amazonensis;
doença parasitária.

3.1. Introdução
A preocupação com controle e combate ao mosquito Aedes aegypti, principal
vetor de transmissão da grave doença hemorrágica conhecida como dengue, é latente
(Wankhar et al., 2015). O número de casos de dengue abrange a cerca de 400 milhões
de ocorrências por ano. Nos últimos 50 anos esta doença chegou a ser endêmica em
128 países, incluindo outros 36 países que eram considerados livres da doença. As
maiores prevalências são observadas em países das Américas, Ásia e África,
resultando na exposição de 3.97 bilhões de habitantes ao risco de infecção (Brady et
al., 2012). Além dos vírus da dengue, o mosquito é vetor pode transmitir outras
doenças conhecidas no mundo como a Chikungunya e a Zika (Neves et al., 2017). A
leishmaniose é outra doença de preocupação mundial, também causada pela picada do
vetor infectado conhecido como “mosquito palha” (straw mosquito) (Silva et al.,
 9

2020). Estima-se que a cada ano surjam 2 milhões de novos casos de leishmaniose e
que no mundo inteiro existam 15-20 milhões de pessoas que vivem com a doença
(Crevelin et al., 2019). Na busca por plantas com potencial terapêutico, as espécies do
gênero Citrus além de possuirem importância econômica, são também produtoras de
óleos essenciais bioativos com elevado valor para perfume, comida, e indústrias de
bebidas (Dosoky et al., 2018). Os óleos essenciais (OEs) e extratos da folha da Citrus
reticulata e casca do fruto possuem várias aplicações biológicas tais como
antimicrobiano, antioxidante, anti-inflamatório, anticancerígeno, antiproliferativo,
anti-fibrose pulmonar, hipoglicêmico, inseticida e é também útil nos cuidados de pele
(Hamdan et al., 2016; Apraj & Pandita, 2016). Neste contexto, este estudo visou
avaliar a composição química, larvicida e atividades anti-Leishmania amazonensis do
óleo essencial da casca da fruta de C. reticulata (OE-CR). Até agora, a avaliação da
atividade larvicida da OE-CR contra larvas do terceiro estágio de A. aegypti não foi
relatada na literatura.

3.2. Resultados e discussão

Os compostos voláteis foram identificados por cromatografia gasosa-detecção de
ionização de chama (CG-FID) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (CG-
EM). Treze compostos foram identificados no óleo da casca da fruta e representaram
97,8% do total dos componentes do óleo. Os principais compostos encontrados em
OE-CR foram limoneno (85,7%), ɣ-terpineno (6,7%) e mirceno (2,1%) (Tabela 1).
Relatórios anteriores de óleos essenciais de cascas de frutas de outras amostras de C.
reticulata, mostraram que terpenos limoneno, sabineno, linalol, ɣ-terpineno, octanal e
capraldeído foram seus principais constituintes (Hamdan et al., 2016; Martins et al.,
2017). OEs de diferentes espécies de Citrus mostra semelhança química e
predominância do monoterpeno limoneno, e estas características são enfatizadas por
Bozkurt et al. (2017). Alta concentração de limoneno (74,38%) também foi
identificada nas cascas de C. reticulata cultivada na Espanha (Espina et al., 2011). É
digno de nota destacar um estudo recente realizado com dez espécies de Citros, que
reforça a presença de compostos de limoneno em OE-CR (González-Mas et al.,
2019).
Para o OE-CR foi investigado sua atividade larvicida contra larvas de terceiro
estágio de A. aegypti. Inicialmente, as larvas em contato com o OE-CR apresentaram
movimentos acelerados. Porém, com a exposição prolongada, passaram a apresentar
 10

tremores e movimentos lentos ou letárgicos, mesmo quando estimulados

artificialmente. O OE-CR também causou o escurecimento de todo o corpo larval. As
doses de 12,5, 25, 50 e 100 µg / mL resultaram em 10,2, 25,1, 51,7 e 85,3% de larvas
mortas, respectivamente, enquanto 150 µg / mL garantiram 100% de mortalidade. O
LC50 de CR-OE foi de 58,35 µg / mL. Os óleos essenciais de várias espécies de Citros
já foram testados contra larvas de A. aegypti, entretanto, este é o primeiro promissor
relato para C. reticulata. Pode-se mencionar que a atividade larvicida ou inseticida já
foi avaliada para os OEs de C. sinensis, C. limon, C. grandis, C. aurantifolia, C.
hystrix, C. maxima e C. medica (Araújo et al., 2016; Gomes et al., 2019; Sarma et al.,
2017; Sarma et al., 2019; Soonwera, 2015). Essa alta atividade larvicida pode ser pela
alta concentração de limoneno (CL50 = 27 mg / L) um inseticida botânico patenteado
como agente ativo integrante de formulações larvicidas (Dias et al., 2014).
Em relação a atividade leishmanicida, OE-CR se revelou bastante promissor
contra as formas tripomastigosta de L. amazonensis (IC50 = 8.23 µg/mL) (Tabela 3).
Vários autores reportam que OEs com valores de IC50 < 10 µg/mL são considerados
altamente ativos (Silva et al., 2020; Almeida et al., 2019; Alcoba et al., 2018). Esta
mesma faixa de valores de IC50 que consideram EOs como altamente ativos é descrita
por Estevam et al. (2016), ao estudarem os OEs das folhas secas de C. limonia e C.
latifolia. Destacando que o resultado encontrado no presente estudo demostrou que o
OE-CR precisou de concentração menor do que quando comparado com o resultado
descrito por Monzote et al. (2019), uma vez que o valor de IC50 de CR-OE obtido de
forma comercial foi de 70.7 µg/mL. Este fato nos leva a questionar a natureza de OEs
comercializados de maneira não regulamentada. Por outro lado, a alta atividade
leishmanicida de CR-OE encontrada no presente trabalho, pode ser também
justificada pela presença do limoneno, um monoterpeno que exibe ação leishmanicida
contra parasitas do gênero Leishmania (Arruda et al., 2009)

3.3. Conclusões
O presente estudo descreveu a composição química do OE-CR, no qual foram
identificados treze compostos, além de mostrar sua atividade larvicida contra larvas
de Aedes aegypti e formas promastigotas anti-Leishmania amazonensis. A presença
de limoneno como principal composto no OE-CR poderia explicar essa atividade
larvicida e leishmanicida. Esta comunicação é o primeiro relatório sobre a avaliação
larvicida de OE-CR.
 11

Agradecimentos
Os autores agradecem à FAPEG e IF Goiano - Campus Rio Verde, pelo apoio
financeiro.
Referências
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MATERIAL SUPLEMENTAR

3.4 Sessão Experimental

3.4.1 Material da planta
Os frutos maduros foram adquiridos em supermercados locais da cidade de
Rio Verde – GO.

3.4.2 Extração de óleo essencial

O óleo essencial (OE) foi extraído da casca do fruto de C. reticulata (OE-CR)
por hidrodestilação por 1 h em aparelho do tipo Clevenger. A hidrodestilação foi
realizada em triplicata. Para tanto, a casca da fruta foi dividida em três amostras de
300 g e 500 mL de água destilada foram adicionados a cada amostra. O conteúdo foi
então transferido para um balão de 3 L e iniciado o processo de extração. Após
decorrido o tempo de extração o hidrodestilado foi então levado para a realização da
separação do OE e água utilizando diclorometano. Após a separação do OE, os
 14

vestígios de água remanescentes foram removidos com sulfato de sódio anidro,

seguido de filtração. Os OE foram armazenados em frasco âmbar e mantidos em
geladeira a 4°C até a análise.

3.4.3 Identificação química do óleo de casca de fruta de C. reticulata (CR-EO)

CR-OE foi dissolvido em éter etílico e analisado por cromatografia gasosa-
detector de ionização de chama (CG-FID) e cromatografia gasosa-espectrometria de
massa (GC-MS) usando os sistemas Shimadzu QP5000 Plus e GCMS2010 Plus
(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). A temperatura da coluna no GC-FID foi
programada para aumentar de 60 a 240°C a 3°C / min e foi mantida a 240°C por 5
min; o gás transportador era H2 a uma taxa de fluxo de 1,0 mL / min. O equipamento
foi configurado para operar no modo de injeção; o volume de injeção foi de 0,1 µL
(proporção de divisão de 1:10) e as temperaturas do injetor e do detector foram de 240
e 280°C, respectivamente. As concentrações relativas dos componentes foram obtidas
normalizando as áreas dos picos (%). As áreas relativas consistiram na média de
análises de GC-FID em triplicata. As condições de CG-EM e a identificação de óleos
essenciais foram realizadas seguindo a metodologia proposta por Lemes et al., (2018).
A identificação dos componentes voláteis do óleo essencial de C. reticulata (Tabela 2)
foi baseada em seus índices de retenção em uma coluna capilar Rtx-5MS (30 m X
0,25 mm; 0,250 µm) nas mesmas condições operacionais usadas para GC em relação
a uma série homóloga de n-alcanos (C8-C20). As estruturas foram combinadas por
computador com Wiley 7, NIST 08 e FFNSC 1.2, e seus padrões de fragmentação
foram comparados com dados da literatura (Adams, 2007).

3.4.4 Ensaio larvicida

Larvas de A. aegypti foram obtidas no Laboratório de Patologia Tropical e
Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, UFG, Brasil. O ensaio larvicida foi
realizado de acordo com um método previamente relatado (Mesquita et al., 2018), da
seguinte forma: as larvas foram mantidas em bandejas de plástico sob temperatura
controlada (26 ± 2°C) e umidade (70-80%) até atingirem o terceiro estágio final do
instar. Além disso, 10 larvas foram transferidas para copos plásticos com capacidade
de 50 mL, cada um contendo 10 mL de água mineral e ração para peixes triturada
(TetraMin Tropical Flakes), seguida da adição de 100 μL de solução de OE-CR em
dimetilsulfóxido (DMSO) (25-500 μg / mL). Após 24 horas, o número de larvas
 15

mortas foi contado e a porcentagem letal calculada. Todos os experimentos foram

realizados em quintuplicata, incluindo um tratamento de controle negativo com
DMSO, água mineral, larvas e ração para peixes moída. As atividades larvicidas
foram relatadas como concentração letal a 50% (CL50), representando a concentração
em microgramas por mililitro que causou 50% da mortalidade larval, dentro de um
intervalo de confiança de 95%. Os dados de mortalidade foram avaliados por análise
probit (Finney, 1971). Os dados de mortalidade foram tratados pelo software Polo
plus® (Robertson et al., 2003) com intervalo de confiança de 95% e valores de P
<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

3.4.5 Ensaio antileishmanicida

Para avaliar a atividade antileishmanicida, as formas promastigotas de L.

amazonensis (MHOM / BR / PH8) foram mantidas em meio de cultura RPMI 1640
(Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 UI / mL) e
estreptomicina (100 μg / mL). Posteriormente, a cerca de 1 x 106 parasitas foram
distribuídos em placas de 96 poços e o OE-CR previamente dissolvido em
dimetilsulfóxido 100% (DMSO, solução estoque 100 mM) (Synth) foram adicionados
em concentrações de 6,25 a 100 μg / mL ao culturas. Anfotericina B (Sigma Aldrich,
pureza de 97%) em concentrações variando de 0,011 a 0,19 μg / mL foi adicionada às
culturas e usada como controle positivo. As culturas foram incubadas em incubadora
BOD (Quimis) a 25°C por 24 h, e a atividade antileishmania foi determinada
verificando se o crescimento das formas promastigotas foi inibido, conforme revelado
pela contagem do número total de promastigotas vivos no Câmara de Neubauer
(Global Glass - Porto Alegre, BR) com base na motilidade flagelar. Foi usado meio
RPMI 1640 (Gibco) contendo 0,1% de DMSO (Synth) (concentração mais alta). Os
resultados foram expressos como a média da porcentagem de inibição do crescimento
em relação ao controle negativo (0,1% DMSO).

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chromatography/mass spectrometry. Carol Stream, Illinois, USA: Allured
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 16

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Tabela 1. Composição química do óleo essencial da casca da fruta da Citrus

reticulata (CR-OE).

TRmin Compostos RIexp RIlit %RA

6,28 α-Tujeno 852 851 0,2
9,09 -Pineno 935 934 0,6
10,78 Sabineno 975 974 0,5
11,57 Mirceno 993 991 2,1
13,82 Limoneno 1039 1039 85,7
14,32 Trans--ocimeno 1051 1050 0,7
14,81 -terpineno 1062 1062 6,7
18,59 Óxido de Limoneno 1132 1133 0,5
19,31 Citronelal 1158 1158 0,1
21,13 -Terpineol 1184 1185 0,1
24,12 Geraniol 1254 1255 0,1
24,86 Geranial 1271 1270 0,2
37,92 Óxido de Cariofileno 1581 1581 0,3
Total 97,8
Concentrações (µg/mL) ± Desvio Padrão

TRmin: tempo de retenção; RIexp: Índice de retenção relativO para n-alcanos (C8–
C20) na coluna Rtx-5MS; RIlit: Índice de retenção de Kovats (valores da literatura).
 17

Tabela 2. Atividade Antileishmanicida do óleo essencial da casca da fruta do Citrus

Reticulata (CR-OE).

*Controle Positivo: Anfotericina B 1μg/mL; Controle Negativo: Medip RPMI + 0.1% DMSO

IC50
100 50 25 12.5 6.25
(µg/mL)
OE-CR 100±0,00 100±0,00 64,86±5,98 58,14±7,69 47,92±4,86 8,23±1,10
0,19 0,095 0,047 0,023 0,011
Amph. B* 44,38±0,53 36,89±0,79 33,61±0,62 29,02±1,85 23,50±1,58 0,25±0,39
 18

4. CAPÍTULO II

Atividade antifúngica in vitro do óleo essencial da casca de Citrus Reticulata

sobre o crescimento do fungo Sclerotinia sclerotiorum

RESUMO

Os óleos essenciais estão presentes nas plantas como produtos naturais sendo

constituídos por compostos orgânicos voláteis. As propriedades destes compostos

voláteis vêm sendo estudadas e exploradas nestes últimos anos descobrindo suas

atividades como antifúngica, antimicrobiana e antiparasitária. O patógeno Sclerotinia

sclerotiorum têm sido grande causador de perdas de colheitas e armazenamentos de

diversos alimentos. Este estudo visou a avaliação do efeito do óleo essencial da casca

da fruta Citrus Reticulata (Rutaceae) (OE-CR) contra o crescimento micelial do

Sclerotinia sclerotiorum, que atinge várias espécies e subespécies de plantas. O óleo

essencial da Citrus Reticulata foi obtido por hidrodestilação por aparelho Clevenger e

a atividade antifúngica in vitro mostrou que OE-CR na dose de 300 µL inibiu 97% do

crescimento do fungo Sclerotinia sclerotiorum. Os resultados obtidos mostraram que

o OE-CR possui grande potencial de inibição para este patógeno.

Palavras-Chave: Sclerotinia sclerptiorium, Patógeno, Rutaceae,

4.1 Introdução

S. sclerotiorum é um patógeno altamente prejudicial com diversos modos de

infecção. Ele ataca as plantas hospedeiras por meio de ascósporos que podem ser

descarregados à força para cima da apotécia para o ar, ou pelo micélio decorrentes de

tecido infectado ou de escleródios germinados. Quando ascósporos pousam em

tecidos suscetíveis do hospedeiro, eles podem germinar em condições favoráveis e

 19

iniciar um novo ciclo de infecção (Xia, et al., 2020). Assim, o fungo pode

permanecer viável no solo sob condições adversas por até 10 anos por causa da

formação de escleródios que são estruturas de resistência (Krause-Sakate et al., 2016;

Choi et al., 2017). Diversos estudos vêm sendo realizados com a intenção de descobrir

meios de combater o crescimento micelial do fungo. Para o tratamento do fungo,

várias estratégias têm sido aplicadas contra os patógenos transmitidos pelo solo para

reduzir a sobrevivência das estruturas fúngicas em repouso, como escleródios. Uma

alternativa, quando viável, é o uso do método da solarização. Essa metodologia

consiste na eliminação do escleródio através do calor, tornando-os inviáveis, este

método é mais eficiente quando os escleródios estão na camada superficial do solo.

Sprays fungicidas podem prevenir a infecção por ascósporos; no entanto, pela

dificuldade do spray em alcançar a penetração necessária para atingir a cultura, a

doença ainda pode ocorrer (S. Soylu, H. Yigitbas, 2007).

O gênero Citrus da família Rutaceae inclui a cerca de 17 espécies

distribuídas pelas regiões tropicais e temperadas (Chutia et al., 2008). Elas são as

frutas mais produzidas e consumidas no mundo. O Brasil ocupa primeiro lugar na

produção mundial e na exportação de suco de laranja, sendo o Estado do Rio Grande

do Sul um importante produtor. Ao longo do cultivo e do processamento dos citros,

são geradas toneladas de resíduos de baixo valor comercial, mas com grande potencial

de aproveitamento dentro da indústria de alimentos (Gerhardt & Carin, 2012).

O processamento de frutas engloba a produção de suco integral e

concentrado, frutas congeladas e polpas, geleias e xaropes, frutas desidratadas, entre

outros produtos. Grande quantidade de resíduos é gerada durante o processamento, e

representa alto custos com destinação adequada, como transporte e tratamentos

aplicados para reduzir os danos ao ambiente. No entanto, este cenário foi alterado pela
 20

inclusão de processos que utilizam esses resíduos como matéria-prima para a

obtenção de novos produtos. Antes, os resíduos de processamento de frutas

representam quantidade relevante significando riscos ambientais graves, mas também

representam perda expressiva de nutrientes com alto valor biológico (Okino-Delgado,

Prado & Fleuri, 2018)

Óleos essenciais de plantas aromáticas e medicinais geralmente exibem uma

gama diversificada de atividades biológicas, pois possuem vários constituintes ativos

que atuam por meio de vários mecanismos de ação. Os óleos essenciais das cascas de

Citrus têm uma variedade impressionante de usos em alimentos, medicamentos entre

várias outras aplicações (Dias, et al., 2020). Por isso, o interesse em extratos de

plantas e principalmente óleos essenciais como potenciais agentes antimicrobianos

para o uso na preservação de alimentos, proteção de cultivos e aplicações

farmacológicas aumentou durante a última década. Deste modo, o desenvolvimento

deste trabalho visou a análise da aplicação do OE da casca da fruta Citrus reticulata

através de dois métodos diferentes para a inibição do crescimento micelial do fungo

Sclerotinia sclerotiorum.

4.2 Material e método

4.2.1 Material da planta

Os frutos maduros foram adquiridos nos mercados locais da cidade de Rio

Verde – GO.
4.2.2 Extração do óleo essencial

O óleo essencial (OE) foi extraído da casca do fruto de C. reticulata (CR-OE)

por hidrodestilação por 1 h em aparelho do tipo Clevenger. A hidrodestilação foi

realizada em triplicata. Para tanto, a casca da fruta foi dividida em três amostras de
 21

300 g e 500 mL de água destilada foram adicionados a cada amostra da casca. Após a

coleta manual do OE, os vestígios de água remanescentes foram removidos com

sulfato de sódio anidro, seguido de filtração. O cálculo do rendimento OE foi baseado

no peso da casca expresso como média da análise em triplicatas. Os OE’s foram

armazenados em frasco âmbar e mantidos em geladeira a 4°C até a utilização. A

composição química do óleo essencial foi realizada no trabalho anterior.

4.3 Atividade antifúngica in vitro pelo método de difusão em disco

Os ensaios foram realizados no Laboratório de Microbiologia do IF Goiano –

Campus Rio Verde. Para a análise da atividade antifúngica do OE-CR foi utilizado o

método de difusão em disco descrito por Xavier et al. (2016), com modificações, e o

teste foi realizado com quatro repetições de OE-CR puro com as doses de 50 μL, 100

μL, 150 μL, 200 μL e 300 μL. Após a solidificação do meio BDA os óleos essenciais

foram adicionados e homogeneizados na superfície do meio com o auxílio de uma

espátula Drigalski. Posteriormente, discos de meio BDA de 5 mm de diâmetro com

micélios de 10 dias de idade do fungo Sclerotinia sclerotiorium foram colocados no

centro das placas contendo o OE disperso e também as placas de controle sem OE. O

crescimento micelial foi medido diariamente, até que o fungo crescesse totalmente nas

placas de controle. O tratamento foi realizado em quadruplicata e o delineamento

experimental inteiramente ao acaso. Os dados foram submetidos à análise de variância

(ANOVA) e as médias dos tratamentos avaliadas pelo teste de Tukey com nível de

significância de 5% pelo software R.

A porcentagem de inibição do crescimento micelial (ICM) foi calculada pela

seguinte fórmula
 22

4.4 Atividade antifúngica in vitro pelo método de difusão em disco

por evaporação do OE

Neste procedimento foram dispersas em papel de filtro o OE-CR que foi

colocado na tampa da placa de petri deixando a mesma virada para baixo com o ágar

solidificado e previamente inoculado na parte de cima da placa. O teste foi realizado

com quatro repetições para os volumes de 50 μL ,100 μL, 150 μL, 200 μL e 300 μL

de OE-CR. O método consiste na dispersão do OE via volatilização no ambiente para

a atividade microbicida. Tendo em vista a volatilidade apresentada pelos constituintes

dos óleos essenciais, este método pode ser utilizado para avaliar o efeito dos vapores

do óleo essencial sobre o crescimento e/ou inibição de microrganismos.

4.5 Resultados e discussão

Patógenos de plantas que causam doenças são responsáveis por grandes danos

de rendimento em muitos cultivos economicamente importantes. O uso de

agroquímicos na fumigação do solo, aplicação foliar ou tratamento de sementes é a

estratégia mais comum para gerenciamento de doenças de plantas, entretanto, por

causa dos efeitos adversos de pesticidas na saúde humana e no meio ambiente, os

consumidores estão cada vez mais exigindo produtos que sejam livre de resíduos

químicos tóxicos (Sharma, et al., 2019).

Portanto, a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial da casca de Citrus

Reticulata, foi avaliada contra o fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum. OE-

CR inibiu o crescimento micelial de S. sclerotiorum através de doses do óleo puro. As

percentagens de inibição do crescimento micelial (ICM) do óleo essencial da casca de

Citrus Reticulata através do método de difusão e evaporação do OE, são mostradas na

figura 1 e figura 2 respectivamente.

 23

Figura 2 – Percentual de inibição do crescimento micelial (IMG) de Sclerotinia sclerotiorum de

diferentes doses do óleo essencial da casca de Citrus Reticulata (OE-CR) através do método de difusão
em disco. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey.
Óleos essenciais e seus componentes estão ganhando interesse crescente

como recurso natural alternativo às drogas sintéticas, particularmente contra agentes

microbianos por causa do seu status relativamente seguro e ampla aceitação pelos

consumidores e sua exploração para uso por seu potencial multifunctional (Zarai et al.,

2011).

Extratos de espécies cítricas são fontes bem conhecidas de compostos

biofuncionais com efeitos de promoção da saúde. Em particular, os óleos essenciais

são conhecidos por sua atividade antibacteriana pelo alto teor de terpenos (Usach et al,

2020).

Numerosos óleos essenciais foram testados para atividade in vivo e atividade

antimicótica in vitro e alguns demonstraram possuir potenciais agentes antifúngicos.

Seu mecanismo de ação parece estar predominantemente na membrana da célula

 24

fúngica, interrompendo sua estrutura causando vazamento e morte celular; bloqueando

o síntese de membrana; inibição da germinação de esporos, proliferação de fungos e

respiração celular (Silva, et al., 2012).

Os resultados das análises de inibição do crescimento micelial demonstraram

atividade antifúngica in vitro promissora para o OE-CR extraído da casca da fruta. Os

resultados demonstraram que em 150, 200, 300 µL obteve 88%, 92% e 97% de

inibição, respectivamente. Comprovando assim, que a partir do volume de 100 µL de

OE-CR apresenta alta toxicidade para o patógeno S. sclerotiorum.

A atividade antifúngica in vitro contra o patógeno S. sclerotiorum também

foi realizada através do método de difusão em disco por fumigação. Os resultados

estão demonstrados abaixo na Figura 3.

Figura 3 – Percentual de inibição do crescimento mycelial (IMG) de Sclerotinia sclerotiorum

de diferentes doses do óleo essencial da casca de Citrus Reticulata (CR-EO) através do método

de difusão em disco por evaporação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si

pelo teste de Tukey.

 25

Pesquisas visando o controle alternativo, através do emprego de óleos

essenciais e extratos vegetais têm aumentado consideravelmente nos últimos anos e

revelado seu potencial, pois, algumas plantas apresentam diversas substâncias em sua

composição química, muitas delas com potencial fungicida, as quais devem ser

estudadas para utilização direta do produtor rural, bem como para servir de matéria-

prima para formulação de novos produtos (Kreyci et al., 2018). Em estudo Chee &

Lee (2009) verificou a atividade antifúngica do limoneno que é o componente

majoritário do OE-CR. Como está apresentado na tabela abaixo:

Tabela 2. Composição química do óleo essencial da casca da fruta da Citrus

reticulata (CR-OE).

RTmin Compostos RIexp RIlit %RA

6.28 α-Tujeno 852 851 0.2
9.09 -Pineno 935 934 0.6
10.78 Sabineno 975 974 0.5
11.57 Mirceno 993 991 2.1
13.82 Limoneno 1039 1039 85.7
14.32 Trans--ocimeno 1051 1050 0.7
14.81 -terpineno 1062 1062 6.7
18.59 Óxido de Limoneno 1132 1133 0.5
19.31 Citronelal 1158 1158 0.1
21.13 -Terpineol 1184 1185 0.1
24.12 Geraniol 1254 1255 0.1
24.86 Geranial 1271 1270 0.2
37.92 Óxido de Cariofileno 1581 1581 0.3
Total 97.8
RTmin: tempo de retenção; RIexp: Índice de retenção relative para n-alcanos (C8–
C20) na coluna Rtx-5MS; RIlit: Índice de retenção de Kovats (valores da literatura)

Concentrações (µg/mL) ± Desvio Padrão

Potenciais antifúngicos de diversos tipos de óleos essenciais vêm sendo

analisados por diversos pesquisadores, pois, os compostos naturais das plantas

também são opção para o tratamento de diversos patógenos e podem ser uma opção
 26

mais segura, do que produtos químicos sintéticos. Com estes resultados pode-se

observar que há atividade antifúngica em ambos os métodos, porém, o método de

difusão em disco que tem o contato direto do óleo com o patógeno, demonstrou ser

mais eficaz.

Não está claro, exatamente como os compostos voláteis estão inibindo o

crescimento de fungos, mas, alguns estudos sugerem que pelo alto índice de natureza

lipofílica do micélio junto com grande área de superfície em relação ao volume de um

fungo, vapores de óleos essenciais podem atuar principalmente por acúmulo no

micélio (Massoud, et al., 2012).

A utilização do método de evaporação de OEs para o controle de fitopatógenos

é promissora, principalmente por poder ser aplicado nos grãos após a colheita, pois,

estando armazenados em um local fechado, pode-se realizar a volatização do OE por

todo o ambiente aumentando então as chances de contato do OE com o fitopatógeno,

porém, pelos OEs serem compostos voláteis, fotossensíveis e termossensíveis

tornando um desafio esta aplicação. Assim, novos métodos vêm sendo estudados com

o intuito de encontrar maneiras de liberar o OE no ambiente de maneira controlada e

mantê-lo por mais tempo sem o perigo de degradação. Recentemente, nanopartículas

poliméricas (NP) foram desenvolvidas para encapsulação do OE, protegendo-as com

boa estabilidade, entrega controlada, biodisponibilidade e eficácia aprimorada.

Óleos essenciais ou extratos de diversas espécies foram avaliadas tendo seu

efeito comprovado contra fitopatógenos, como o E. Staigiriana (Correa, et al., 2019),

A. cacans, A. coriacea, A. crassiflora, A. sylvatica e A. dioica (Zanella et al., 2015),

Citrus reticulata, Citrus sinensis e Citrus deliciosa (Dias et al., 2019), demonstrando

assim a eficiência da utilização de OE e extratos como alternativa aos fungicidas de

origem química. O forte efeito inibitório sobre a pectina metil-esterase e celulase, que
 27

são enzimas que fazem parte do mecanismo de patogenicidade de alguns

microrganismos, indicaram que essas duas enzimas são alvos para monoterpenos

(Gehan, Rasoul & Abdelgaleil, 2012).

4.6 Conclusões

Com este estudo foi concluido que o OE-CR apresentou atividade antifúngica

in vitro contra o fungo S. sclerotiorum bastante satisfatória para o método de difusão

em disco. Os resultados demonstraram que OE-CR possui grande potencial de

inibição para ser usado contra o patógeno, e por ser agente de origem natural se torna

ótima opção para uso substituindo os antifúngicos de origem química sintética.

Agradecimentos

O autor é grato à FAPEG, CNPq, CAPES e ao IF GOIANO, pelo suporte financeiro.

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 31

5 CONCLUSÕES GERAIS

De acordo com os resultados obtidos concluiu-se que:

• Os compostos majoritários presentes no OE-CR foram: Limoneno (85,7%), ɣ-

terpineno (6,7%) e mirceno (2,1%);

• O OE-CR na atividade larvicida com as doses de 12,5, 25, 50 e 100 µg / mL

resultaram em 10,2, 25,1, 51,7 e 85,3% de larvas mortas, respectivamente, enquanto

150 µg / mL garantiram 100% de mortalidade;

• Quanto a atividade leishimanicida o OE-CR se revelou bastante promissor contra as

formas tripomastigosta de L. amazonensis (IC50 = 8.23 µg/mL).

• O OE-CR apresentou percentuais de inibição para o fungo Sclerotinia Sclerotiorium

em ambos os métodos de difusão em disco e fumigação, porém, o método de difusão

demonstrou maior inibição sendo de 88%, 92% e 97% para os volumes de OE de 150,

200, 300 µL, respectivamente.

• Têm-se perspectivas futuras da aplicação prática do OE-CR para a utilização in vivo

contra fitopatógenos, utilizando-se de métodos que incorporem o OE e realizem sua

liberação controlada no meio para então analisar sua eficácia.