BMA2
BMA2
BMA2
•DNA genómico
•RNA total e RNA mensageiro
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Porquê isolar DNA?
-Concentração de impurezas:
■inibidores da enzima Taq polimerase
■impurezas ligadas ao DNA e o
tornam indisponível para a reação enzimática
-Integridade do DNA :
• Deteção de infeções:
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http://www.bioteach.ubc.ca/Biomedicine/
Viruses/viralreplication.gif
Síntese de cDNA a partir de mRNA
A síntese de cDNA
(a partir de mRNA ou de RNA total)
O que é o cDNA?
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cDNA= DNA complementar
• O RNA purificado é usado como molde, para a transcrição
reversa, originando o cDNA:
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Como detetar RNA viral numa amostra biológica
Ex: O PCR convencional (ou PCR em tempo real) pode ser utilizado para
detetar a presença de um genoma de vírus, neste caso de RNA
convertido em cDNA, numa amostra de sangue ou qualquer outro tecido
do organismo em causa
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Isolar ácidos nucleicos
Eucariotas
DNA
-Núcleo
-Mitocndria
-Cloroplasto
RNA
-Núcleo
-Citoplasma
Procariotas(todos no mesmo
compartimento)
DNA
-Cromossómico
-Plasmídico
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RNA
Isolar ácidos nucleicos
Tipos de amostra:
-Sangue
-Urina
-células/tecidos
- Cabelo
-Plantas
-Alimentos
-Bactérias
-Leveduras
….
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Isolar ácidos nucleicos
Estrutura da célula
Nota: A quebra das paredes celulares nas leveduras e plantas, pode ser realizada por um processo enzimático ou mecânico
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Processos de disrupção tecidular/celular
Processo Condições Tipo de células/tecido Comentário
típicas Método de
MECÂNICOS eleição *
Homogeneizador de Instruções A maioria dos tecidos
lâminas*(Polytron) equipamento
animais, plantas
Lise celular 2vol água para1 vol Eritrócitos, periplasma E.coli
(Choque osmótico) células pré-lavadas
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Tipos de amostra
Congelada
Dura (osso)
• Congelação e pulverização
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• Armazenamento em solução de estabilização
Fixada em formalina, embebida em parafina
• Há kits específicos
• Desparafinação
• Digestão com proteinase K
• Extração com um solvente orgânico
Células em cultura
• Fácil disrupção
• Ressuspensão em solução de lise, por vortex,
sonicação ou pipetagens vigorosas
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Sangue
• Há kits específicos
• Lise dos eritrócitos
• Recolha dos leucócitos e disrupção em
tampão de lise
Bactérias e leveduras
• Há kits específicos
• Necessidade de degradar a parede celular
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1- Trituração mecânica: disrupção do tecido
4- Purificação
5- Quantificação
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2- Dissolução das membranas citoplasmática e nuclear
-detergentes
-sais
-pH alcalino (~8)
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Ex. de um tampão de lise:
4- Purificação
5- Quantificação
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3- Separação das impurezas
Separar o solúvel (DNA ou RNA) do insolúvel (restos celulares
e proteínas desnaturadas) por:
– Centrifugação
ou
– Filtração
4- Purificação
os ácidos nucleicos ainda estão associados a restos proteicos
e/ou sais:
– solventes orgânicos(fenol, clorofórmio) e
precipitação com álcool e sal
– colunas (base dos kits)
– processos magnéticos
– processos enzimáticos 25
Solventes orgânicos e precipitação com álcool e sal
Método:
-Demorado; trabalhoso; difícil de automatizar; reagentes tóxicos
-Rendimento e pureza inferiores aos dos kits comerciais
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Porque força iónica precipita os ác. nucl. em etanol?
-Os iões Na+ ligam-se aos grupos fosfato do DNA e do RNA, neutralizando
a carga elétrica das moléculas
• Processos Magnéticos
- Esferas magnéticas revestidas
– Sílica
Grande rendimento e pureza (kits comerciais – Charge Switch,
Wizard, MagAttract) 28
•Processos enzimáticos
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Lavagem dos ácidos nucleicos e eluição:
• Eluição ou dissolução:
-DNA em TE (Tris-EDTA) ou outro tampão de baixa força
iónica,
-RNA em água (livre de nucleases, tratada com DEPC) ou
um tampão de baixa força iónica
• Espectrofotometria (+ comum)
– Absorvância a 260 nm
• Fluorímetria
– Hoechst Dye
– PicoGreen
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Espectrofotometria
• Quantificação
• Avaliação da Pureza
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Extração de RNA: cuidados dobrados
• É difícil trabalhar com RNA:
-quimica e biologicamente mais lábil que o DNA
-instável; RNases ubíquas
-não há maneira de o amplificar
http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?7020
http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture9/AMG5.1a.gif
vantagens:
-para amostras de grande ou pequena dimensão
-pode ser modificado para amostras/ tecidos particulares.
desvantagens:
-fenol e clorofórmio: tóxicos
-se ficarem como contaminantes, o fenol e o clorofórmio podem
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comprometer passos subsequentes.
•Purificação em fase sólida (Kits comerciais):
Vantagens:
- procedimento rápido
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http://www.eandkscientific.com/files/images/Nucleospin_RNAII.gif
Inativação das RNases no isolamento de RNA
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Fontes de RNases
•Contaminantes provenientes do ar
• Mãos sem luvas
• Água e tampões autoclavados
• Células vivas, tecidos
• Pontas e tubos
• Superfícies do laboratório
• Amostras de RNA
• preps de plasmídeos
• Pipetas usadas em procedimentos
que usaram RNase
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Como evitar RNases
• Manter os recipientes fechados
•Usar água tratada com DEPC
• Usar luvas
• Manter áreas só para trabalhar com RNA
• Usar material estéril de plástico, descartável,
livre de RNases
• Colocar o material de vidro a 180°C, 8h ou
tratá-lo com 0.1% dietil-pirocarbonato (DEPC)
•Não pode ser usado com tampões com grupos amina, porque
reage com estas (Tris etc.)
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Outros inibidores das RNases (menos tóxicos)
M- Marcador de PM
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Isolamento de mRNA poli-A: só para mRNA eucariótico!
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NOTA: O RNA poli-A/mRNA pode ser isolado a partir de preps de RNA total
Kits comerciais para isolar RNA
mRNA
•Kit Qiagen: com oligotex
Pequenos RNAs:
• miRNA, siRNA, snRNA, e snoRNA
RNA Viral
• extracção de amostras biológicas livres de células(lise das
partículas virais)
RNA Total
• Plantas, Fungos, Bactérias;
• Sangue total, saliva;
•tecidos fixados em formaldeído ou
paraformaldeido ou parafinados;
• Tecidos ricos em fibra ou tecidos gordos.
• Espectrofotometria
- Absorvância a 260 nm e A260/A280
- Requer espectrofotómetro (pode ser nanodrop)
- DNA, proteínas, nucleótidos livres também absorvem a 260nm
- Menos sensível que outros métodos.
• Fluorimetria
- Corante especial (RiboGreen, Sondas Moleculares)
- Mais sensível que a espectrofotometria
- Menos sensível a proteína e nucleótidos livres
- Contaminação com DNA pode dar leituras falsas
- Requer fluorímetro.
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Avaliação da qualidade do RNA
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Quantificação/avaliação da qualidade do RNA
- RT-PCR qualitativo
- Ensaios de proteção à ribonuclease
Armazenamento
• -80°C ou azoto liq.
• Mais estável em NH4OAc/etanol.
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• Aliquotar as soluções de RNA .
Bibliografia recomendada:
•[2] Gautam, Akash. author.; Springer Link (Online service)” DNA and RNA Is
olation Techniques for Non-Experts”2022; Springer Nature eBook
(https://rmit.alma.exlibrisgroup.com/discovery/fulldisplay?docid=alma9922096428001341&context=L&vid=61RMIT_INST:RMITU
&lang=en&search_scope=EverythingNOTresearch&adaptor=Local%20Search%20Engine&tab=AllNOTresearch&query=sub,exa
ct,Molecular%20biology,AND&mode=advanced&offset=50)
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