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    Aula Engenharia Genetica Biomedicina 1216312497601938 8

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    Milosi09
    O documento discute os fundamentos da engenharia genética, incluindo: 1) O que é engenharia genética e como envolve a manipulação de material genético in vitro; 2) Os processos de clonagem molecular como isolamento de DNA, criação de bibliotecas genômicas e de cDNA, e PCR; 3) As ferramentas da engenharia genética incluindo enzimas de restrição, vetores e células hospedeiras.

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    Attribution Non-Commercial (BY-NC)
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    O documento discute os fundamentos da engenharia genética, incluindo: 1) O que é engenharia genética e como envolve a manipulação de material genético in vitro; 2) Os processos de clonagem molecular como isolamento de DNA, criação de bibliotecas genômicas e de cDNA, e PCR; 3) As ferramentas da engenharia genética incluindo enzimas de restrição, vetores e células hospedeiras.

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    O documento discute os fundamentos da engenharia genética, incluindo: 1) O que é engenharia genética e como envolve a manipulação de material genético in vitro; 2) Os processos de clonagem molecular como isolamento de DNA, criação de bibliotecas genômicas e de cDNA, e PCR; 3) As ferramentas da engenharia genética incluindo enzimas de restrição, vetores e células hospedeiras.

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    Fundamentos de

    Engenharia Genética
    Prof. Dr. Eduardo Honda

    Porto Velho
    2008
    Dogma Central da Biologia Molecular
    O que é Engenharia Genética?
    É um conjunto de tecnologias que permitem a
    manipulação (modificação) de material genético in
    vitro

    Também conhecida como Tecnologia do DNA


    Recombinante

    Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes,


    recombinação de genes, ou DNA de diferentes
    espécies, e transferência de genes de uma espécie
    para outra, contornando o processo reprodutivo
    Clonagem Molecular

    Para se estudar um determinado gene que


    codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá-lo.
     
    Clonagem = fazer várias cópias idênticas

    Clonagem de DNA  isolar um fragmento


    específico de DNA do cromossomo, introduzi-lo
    num vetor capaz de replicá-lo, e fazer milhões
    de cópias idênticas
     
    Clonagem Molecular

    Isolamento de Novos organismos que produzem


    enzimas de interesse Biotecnológico.
    Clonagem Molecular- Isolamento
    Gênico

    Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA.


    Isolamento do DNA- PCR

    Desnaturação do DNA Fita-Dupla


    Isolamento do DNA- PCR

    Após vários ciclos...

    Amplificação do Fragmento gênico desejado !!!


    Isolamento de DNA e Biblioteca
    de cDNA
    As bibliotecas de DNA representam, teoricamente,
    todo o material genético de um organismo clonado
    em um vetor  

    Tipos:

    A) Genômica: - clonado diretamente do genoma.

    B) cDNA:- feita a partir de mRNA .


    Isolamento de DNA- Biblioteca
    genômica
    Extração do DNA Genômico;

    Clivagem com enzimas de restrição;

    Ligação dos Fragmentos nos vetores;

    Transformação Celular;

    Replicação do vetor.
    Biblioteca de cDNA

    - mRNA de um tipo
    celular específico;

    - “primer” de oligo dT e
    transcriptase reversa;

    - DNA Polimerase I e
    dNTPs;

    - Clonagem em um vetor
    de escolha
    Clonagem Molecular- Requerimentos
    1) Método para clivar o DNA alvo;
    2) Método para juntar 2 moléculas de DNA
    covalentemente (inserto + vetor)- LIGAÇÃO!
    3) Célula hospedeira;
    4) Método para introduzir moléculas de DNA para
    dentro da célula hospedeira que as possa duplicar;
    5) Método para selecionar moléculas de DNA
    quimérico ou recombinantes;
    6) Métodos para o screening da característica
    procurada .
    Geração de moléculas
    recombinantes

    - Clonagem Molecular -
    CLONAGEM
    Ligação de extremidades compatíveis
    Sítio
    Múltiplo
    de
    Clonagem
    (Polylinker)
    As
    endonucleases
    de Restrição

    Clonagem
    Orientada
    As “Ferramentas”
    1) Enzimas

    2) Vetores

    3) Células hospedeiras
    ENZIMAS
    Enzimas de Restrição
    São endonucleases que clivam o DNA
    em seqüências específicas chamadas
    sítio de restrição.

    Quebram a ligação fosfodiéster

    Os sítios de restrição são, geralmente,


    seqüências palindrômicas (mesma
    seqüência nos dois sentidos)
    Enzymes for DNA manipulation –
    restriction enzymes

    Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
    Enzimas de Restrição
    • Endonucleases sítio-específicas
    isoladas de procariotos EcoRI metilase
    • Protegem a bactéria do ataque de
    vírus (fagos)
    • Protegem seu próprio DNA
    metilando-o no sítio de restrição
    • Enzimas do tipo II são as mais
    utilizadas em Biologia Molecular

    Classes of Restriction Enzymes


    cleavage occurs 400-7000 bp
    Type I from recognition site
    cleavage occurs adjacent or
    Type II within recognition site
    cleavage occurs 25-27 bp
    Type III from recognition site
    DNA Ligase
    Promover a união de moléculas de DNA
    pela formação de uma ligação
    fosfodiéster entre uma extremidade 3’-
    OH e outra 5’-PO4.
    DNA Polimerases
    Polimerizam a molécula de DNA a
    partir de uma extremidade 3´-OH e
    usando uma das fitas do DNA como
    molde.

    Exe: Taq polimerase


    Transcriptase reversa

    Polimeriza uma fita de DNA a partir


    de um molde de RNA

    Isolada dos retrovírus

    Aplicação: síntese de cDNA


    VETORES
    Os Vetores
    São moléculas de DNA que irão propagar o
    DNA clonado.
     
    Características desejadas:

    •Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;

    • Marca genética para selecionar a célula contendo o


    vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);

    •Sítios de clonagem únicos.


    Plasmídios Tipos de vetores
    Bacteriófagos (fagos)

    Cosmídios

    Cromossomos artificiais de levedura (YAC)

    Vetores especiais para plantas, células de


    insetos e mamíferos
    Plasmídios
    Moléculas de DNA fita dupla circulares e de
    replicação autônoma (ORI);

    Têm marcas de seleção para resistência a


    antibióticos ou complementação auxotrófica.
    Sequências
    de DNA de
    um vetor
    de
    expressão
    de E. coli
    Vetores de expressão
    Transformação Bacteriana

    Células podem ser selecionados em placas com antibiótico.


    Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.

    Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
    O gene da beta-galactosidase é interrompido quando um fragmento de DNA é clonado.
    O substrato "X-gal“ fica azul se o gene da beta-gal permanece intacto, isto é a enzima
    está ativa. As colônias brancas na presença de X-gal significa a presença de DNA
    recombinante no plasmidio.
    Bacteriófagos

    Infectam células de E. coli e o DNA


    se duplica na célula hospedeira.

    Ex: Fago 
     
    Vetores baseados no fago 
    Foram retirados 20 Kb do genoma do fago
    necessários para integração/excisão para
    serem substituídos por DNA exógeno e
    formar um genoma de 50 Kb que é
    empacotado in vitro.

    Genomas maiores ou menores não são


    empacotados.

    Ciclo lítico compulsório


    Clonando no
    Fago λ
    Cosmídios
    • São plasmídios contendo as extremidas “cos” do
    fago λ

    • Capacidade de clonagem: 40 Kb
    Cromossomos artificiais
    CÉLULAS HOSPEDEIRAS
    Células
    Características:
    hospedeiras

    Permitir a duplicação do vetor;

    Permitir a seleção do vetor (sensibilidade a drogas ou


    auxotrofia);

    Não pode representar perigo ao meio ambiente;

    Não deve modificar o DNA exógeno;

    Podem ser procariotos (E. coli) ou eucariotos (leveduras,


    células vegetais, cultura de células de insetos e mamíferos).
    Métodos de introdução do DNA na
    célula hospedeira
    Transformação com cloreto de cálcio (bactérias);

    Transdução (fagos empacotados in vitro);

    Transfecção (células de mamíferos);

    Eletroporação (leveduras e bactérias);

    Biolística ou “bombardeamento” (plantas);

    Microinjeção (ovos e oócitos).


    Inserindo genes nas células

    O canhão gênico é uma


    nova forma de
    transformação celular.

    Esta arma usa uma


    particula de
    bombardeamento -
    Biolística
    Microinjeção

    Adapted from Human


    Genetics, Ricki Lewis
    Transformação Bacteriana

    Células podem ser selecionados em placas com antibiótico.


    Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.

    Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
    Clonando no
    Fago λ
    Seleção de clones recombinantes
    resistência e sensibilidade a
    antibióticos;

    requerimentos nutricionais
    (auxotrofia);

    formação de placas de lise


    Screening
    Identificação de um
    clone de interesse

    - hibridação com sonda radioativa


    - anticorpo específico
    Aplicações da
    Engenharia Genética
     Análise da estrutura/função de genes
     Produção de proteínas de interesse
    industrial e terapêutico
     Engenharia proteica
     Criação de organismos transgênicos
     Terapia gênica
     Diagnóstico molecular (doenças
    parasitárias e genéticas)
     Teste de paternidade / medicina
    forense
     Arqueologia molecular / evolução
    Plantas Transgênicas
    Animais Transgênicos
    Microinjeção de DNA no núcleo de ovo
    fertilizado de camundongo - gene do
    fator de crescimento humano
    Biofármacos Recombinantes
    Terapia Gênica
    Adição do gene
    terapêutico

    Substituição do gene
    terapêutico
    Uso de vírus
                                                           

                            

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