TL4.

A diversidade microbiana no Mundo que nos rodeia

Introdução às Ciências Biológicas
Janeiro 2023
Catarina Faleiro nº105956 І Beatriz Vaz nº105907 І Joana Gonçalves nº107080

Resumo
No mundo que nos rodeia há uma grande quantidade e variedade de
microrganismos. Como tal é importante estudar os vários microrganismos que nos
rodeiam, para que os possamos compreender e aos seus mecanismos.
Um dos objetivos desta experiência foi analisar as possíveis morfologias de colónias
microbianas ao nível das suas formas, margens e superfícies. Para tal, inocularam-se
12 placas de Petri, duas com uma amostra recolhida de uma bancada com recurso a
um cotonete, e as restantes com uma amostra proveniente de solo.
O outro objetivo foi estudar o efeito de agentes antimicrobianos no crescimento das
colónias de fungos e bactérias. Com esse propósito, utilizaram-se antibiogramas para
estudar a suscetibilidade e resistência de microrganismos aos antibióticos ampicilina e
gentamicina, ao antifúngico fluconazol e ao etanol.
Como não é possível contar o número de microrganismos presentes numa amostra,
foi necessário diluir a amostra inicial, através de diluições em série, e, em seguida,
determinar, não o número de indivíduos, mas o número de CFUs (Unidades formadoras
de colónias). As CFUs permitem calcular aproximadamente a quantidade de
microrganismos numa amostra inicial. Com a realização dos cálculos necessários, foi
possível chegar à conclusão que, na amostra inicial, havia 655000 CFUs/ml de solo, e
chegar ao seu real significado.
Um dos grandes desafios que se enfrenta nos dias de hoje é relativo à resistência
que bactérias e fungos desenvolvem aos agentes antimicrobianos. Nesse sentido, foram
realizados os cálculos necessários para encontrar as MICs 50 para dois tipos de
antifúngicos, o Caspofungina e Fluconazol. A partir desses cálculos foi possível concluir
que a nível clínico nenhum dos antifúngicos é adequado para o tratamento da infeção
causada pelas estirpes de C.glabrata.

Introdução
A microbiologia é a ciência que estuda os microrganismos, isto é, organismos que
apenas podem ser visualizados com recurso a ferramentas de ampliação, como o
microscópio. Os microrganismos podem ser agrupados em vírus, bactérias, fungos,
protozoários e algas. Atualmente, estes estão envolvidos em processos de produção de
fármacos, sendo utilizados na produção de vacinas e medicamentos. As atividades e
interações bióticas dos microrganismos podem causar alterações químicas no meio.

Os microrganismos constituem 60% da biomassa total e têm um impacto em várias

áreas da vida humana. Existem microrganismos no corpo humano que são essenciais
à saúde do Homem. Por outro lado, há microrganismos que são responsáveis por certas
doenças. Os microrganismos denominados de patogénicos (ou micróbios) têm o
potencial para causar doenças.
 No laboratório deve-se trabalhar em condições de assepsia, de modo a não
contaminar as culturas em estudo com organismos do meio e a também não contaminar
o meio exterior com os microrganismos em análise. Assepsia é o processo que mantém
um ambiente sem microrganismos. Note-se que não deve ser confundido com a
esterilização, que é processo que destrói os microrganismos (através de agentes
químicos ou físicos).

Para o estudo de microrganismos em laboratório, é necessário a inserção dos

mesmos ou suspensões destes no meio de cultura, isto é, é preciso proceder à sua
inoculação. Os meios de cultura estimulam o crescimento de microrganismos,
fornecendo os nutrientes e condições necessárias. Estes meios podem ser líquidos ou
sólidos.

Os microrganismos podem ser encontrados como células únicas ou como colónias.

Nas colónias, a taxa de crescimento microbiano é influenciada pelo oxigénio e nutrientes
disponíveis, portanto relaciona-se inevitavelmente com o meio de cultura. Deste modo,
na parte mais externa da colónia haverá mais oxigénio e nutrientes e por isso o
crescimento de microrganismos será mais intenso. À medida que se avança para o
centro da colónia, o crescimento será naturalmente mais lento, dado a menor
quantidade de oxigénio e nutrientes acessíveis, uma vez que nesta zona (devido à
presença de um maior número de microrganismos) o oxigénio e nutrientes estarão mais
distribuídos e a eliminação de produtos metabólicos tóxicos é mais moroso.

O desenvolvimento de colónias permite caracterizar a aparência das mesmas,

possibilitando por vezes a identificação de microrganismos (e/ou, por exemplo, verificar
a existência de vários microrganismos diferentes numa população microbiana), pois
constatam-se colónias com morfologias distintas. Assim, as colónias têm diferentes
morfologias que podem ser influenciadas pelas condições de crescimento e tipo de
meio. Estas podem ser descritas e consequentemente classificadas através de três
critérios: forma, superfície e margem. Note-se que para ser possível determinar
competentemente a morfologia das colónias é essencial que estas se encontrem bem
separadas.

Os microrganismos são bastante mutáveis (a nível fisiológico e bioquímico), o que

lhes confere uma fácil adaptação a variações do meio em que se encontram. Desta
forma, uma mesma espécie pode ser bastante diversa, contendo várias estirpes. A
resistência antimicrobiana (RAM) é um problema que tem vindo a ser cada vez mais
preocupante, dado que os medicamentos atualmente disponíveis estão a deixar de ser
eficazes no tratamento de infeções. Os microrganismos vão se adaptando
progressivamente a fármacos antimicrobianos (nomeadamente, antibióticos,
antifúngicos ou antivirais).

De acordo com o EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility

Testing), ao se sujeitar um microrganismo a um agente microbiano podemos obter
resultados distintos tendo em conta a probabilidade de os microrganismos serem
eliminados pelo agente microbiano. No caso de a probabilidade ser elevada, o
microrganismo é considerado suscetível. Se esta for baixa, então o microrganismo é
resistente. Os microrganismos resistentes à maioria dos agentes antimicrobianos são
referidos como ultrarresistentes.

A Concentração Inibitória Mínima (MIC) é a concentração mais baixa de um

antimicrobiano que inibe o crescimento visível de microrganismos. É expresso em mg/L
(μg/mL). Assim sendo, é uma ferramenta muito útil para verificar a eficácia
antimicrobiana de novos (ou já desenvolvidos) fármacos. Os valores de MIC permitem
determinar se um microrganismo patogénico é suscetível ou resistente a um produto
antimicrobiano. Portanto, antibióticos potentes têm valores de MIC baixos e à medida
que os microrganismos se tornam menos suscetíveis a um antibiótico, os valores de
MIC vão aumentando. Os valores que determinam se um microrganismo é suscetível
ou resistente denominam-se por “break-points” e podem ser bastante úteis para
determinar as concentrações apropriadas exigidas no produto final.

Discussão e resultados

Morfologia das colónias

Na placa com o meio PDA+CT (Figura 1.1) (agar de dextrose de batata e antibiótico
clorotetraciclina), registou-se o crescimento de colónias, aproximadamente, redondas,
com superfície concêntrica e margens suaves.

Na placa com o meio TSA (agar triptona de soja) (Figura 1.2), registou-se o
crescimento de colónias irregulares com margens irregulares, mais concretamente,
lobadas e, também colónias punctiformes com margens suaves. Quanto à superfície
das colónias, esta pode ser considerada suave em ambos os casos.

Nas placas de Petri inoculadas com a amostra obtida com o cotonete (Figura 2) não
se registou o crescimento de quaisquer colónias de microrganismos. Estes resultados
podem ser devidos a uma má técnica na recolha da amostra, ou a erros durante a
repicagem, nomeadamente a sua incorreta realização ou a não asseguração das
condições de assepsia durante o processo.

1.1 1.2

Figura 1: PDA+CT (1.1) e TSA (1.2)

 2.1 2.2
Figura 2: PDA+CT (2.1) e TSA (2.2)

O meio de cultura PDA é propício ao crescimento de fungos, devido ao seu pH

moderadamente ácido e ao seu baixo conteúdo nutricional. Além disso, foi adicionado
a este meio o antibiótico clorotetraciclina, que inibe o crescimento de bactérias,
tornando este meio de cultura ainda mais seletivo.
O meio de cultura TSA é um meio de crescimento não seletivo, rico em triptona e
peptona (proteínas), nutrientes e com um pH neutro. Este meio suporta o crescimento
da maioria das bactérias (Gram positivas e negativas), bem como de muitas leveduras
e fungos.

Já nas placas da amostra de solo foi registado um crescimento pouco acentuado de

colónias que pensamos serem de fungos no meio PDA (Figura 1.1), enquanto no meio
TSA se registou um enorme crescimento, que cremos ser maioritariamente composto
por bactérias (Figura 1.2).

Efeito de agentes antimicrobianos no crescimento de colónias de fungos e

bactérias

Um antibiograma é um método utilizado para observar as taxas de suscetibilidade

e monitorizar as tendências de resistência de comunidades microbianas relativamente
a certas substâncias.
Neste trabalho pretende-se avaliar o efeito que os antibióticos (ampicilina e
gentamicina), o antifúngico (fluconazol) e o etanol têm no crescimento das populações
microbianas presentes na amostra de solo recolhida pelo nosso grupo. Para tal, foi
utilizado o método de difusão em disco, que se baseia na capacidade das substâncias
presentes nos discos se difundirem através no agar (meio de cultura), inibindo assim o
crescimento dos microrganismos sensíveis em torno do disco. A suspensão de células
da amostra de solo inicial foi adicionada a um meio de cultura PDA+CT e a outro TSA.
Foram também realizadas diluições em série do inóculo inicial, com razões 1:10, 1:100
e 1:1000, e inoculadas em meios de cultura TSA.

A ampicilina e a gentamicina são antibióticos, pelo que inibem o crescimento de

bactérias. A ampicilina perturba a síntese da parede celular das bactérias e a
gentamicina interfere na síntese proteica realizada nos ribossomas bacterianos.

O fluconazol é um antifúngico, isto é, impede o crescimento de fungos, mais

concretamente, interfere na formação da sua membrana celular.
 O etanol, também conhecido como álcool etílico, pode ser utilizado como
antisséptico, uma vez que promove a dissolução da bicamada fosfolipídica da
membrana de microrganismos e desnatura as suas proteínas, causando a morte dos
organismos. O etanol é eficaz contra a maioria das bactérias, fungos e vírus.

Na placa com o meio PDA+CT (Figura 3.1) registou-se o crescimento de colónias

de fungos, apesar de ter sido reduzido, em volta de todos os discos. Este resultado era
esperado para os discos de ampicilina e gentamicina, visto que são antibióticos. Como
as colónias não são bacterianas, não seria de esperar um efeito significativo. Contudo,
era esperada a formação de um halo de inibição em volta do disco de fluconazol, que é
um antifúngico, o que não se verificou. Este resultado indica que talvez os fungos
presentes na amostra sejam resistentes a este antifúngico, ou que, a concentração do
mesmo não tenha sido suficiente para inibir o crescimento das colónias. Também era
provável verificar-se uma inibição do crescimento das colónias em torno do disco de
etanol. Contudo, o etanol não afeta todos os fungos, pelo que o resultado obtido indica
que, provavelmente, este não seja eficaz contra o tipo de fungos em análise, ou que o
álcool, responsável pela ação antimicrobiana, tenha evaporado.

Nas placas da suspensão inicial B (Figura 3.2) e B1 (Figura 4.1) no meio TSA foi
registado o crescimento de colónias bacterianas. Este crescimento foi mais acentuado
na placa da suspensão inicial B (Figura 3.2), o que era de esperar visto que a placa B1
(Figura 4.1) foi inoculada com uma diluição (1:10) da primeira placa. A ampicilina e a
gentamicina são antibióticos pelo que era previsível o não crescimento de bactérias à
volta destes discos. De facto, verificou-se a formação de um halo de inibição na zona
do disco de gentamicina. Porém em torno do disco de ampicilina tal não se verificou,
talvez por este antibiótico não ser muito eficaz contra as bactérias em estudo, ou a
concentração do mesmo não ter sido suficiente. Do mesmo modo, era provável que o
etanol impedisse o crescimento das colónias. Como tal não aconteceu, é possível que
o etanol não seja eficaz contra os microrganismos em estudo nestas placas, ou que o
álcool, responsável pela ação antimicrobiana, tenha evaporado. Relativamente ao disco
de fluconazol, verificou-se que o antifúngico não teve efeito antibacteriano, como era
suposto, visto que este composto inibe o crescimento de fungos e não de bactérias.

Nas placas de TSA com as diluições 1:100 (Figura 4.2) e 1:1000 (Figura 4.3) não se
registou um crescimento microbiano substancial, não permitindo a análise dos efeitos
dos agentes antimicrobianos.

3.1 3.2
Figura 3: PDA+CT e suspensão inicial B (3.1) e TSA e suspensão inicial B (3.2)
 4.1 4.2 4.3
Figura 4: TSA + diluição 1:10 (4.1); TSA + diluição 1:100 (4.2); TSA + diluição 1:1000 (4.3)

Cálculo CFUs
Pretendemos calcular o crescimento de bactérias nos meios de PDA+CT e TSA a
diferentes diluições, sem a atuação de substâncias inibidoras de crescimento, as quais
se encontram nos antibiogramas. CFUs corresponde ao número de colónias que se
formam por ml do meio de cultura, multiplicado pelo fator de diluição (Equação 1). Não
foi possível utilizar todas as placas para o cálculo de CFUs, sendo usada apenas a placa
TSA diluição 1:100 (Figura 5.2). Nesta foi possível contabilizar o número de colónias
que se encontravam dentro do intervalo desejado (de 30 a 300). As placas PDA+CT
sem diluição, TSA sem diluição (Figura 2.2) e TSA diluição 1:1000 (Figura 5.3) não
apresentaram crescimento, indicando que a técnica não foi realizada de forma correta.
Além disso, PDA+CT é um meio de cultura bastante seletivo o que pode vir a indicar
que a presença de fungos na amostra seria bastante reduzida. Nas placas de TSA sem
diluição (Figura 2.2) e TSA diluição 1:1000 (Figura 5.3), como o meio TSA não se revela
seletivo, seria de esperar o crescimento microbiano. No entanto, este não foi observado,
o que indica que não foram mantidas as condições de assepsia durante o procedimento.
A placa de TSA diluição 1:10 (Figura 5.1) apresentou crescimento, mas devido à
incorreta agitação feita com as esferas, o crescimento não foi uniforme por toda a placa,
tornando os microrganismos incontáveis.

5.1 5.2 5.3

Figura 5: TSA + diluição 1:10 (5.1); TSA + diluição 1:100 (5.2); TSA + diluição 1:1000 (5.3)
 CFUs é um método utilizado para quantificar a quantidade de células vivas
presentes numa amostra. Quando é feita a contagem do número de colónias é preciso
ter em conta que têm de estar contido num intervalo limitado, neste caso entre 30 e 300.
Isto porque o excesso de colónias provoca a saturação, o que impede que outras
colónias cresçam, prejudicando os resultados. Para obter um número de colónias dentro
do intervalo desejado é utilizado o método de diluição em série. Após o cálculo de CFUs
conseguimos concluir qual a quantidade de células vidas por ml. Na tabela 1 encontra-
se um resumo dos resultados que obtivemos. Que nos permite concluir que havia
655000 células vivas por ml de solo.

Equação geral utilizada para o cálculo de CFUs/ml:

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ó𝑛𝑖𝑎𝑠 ∗ 𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜
𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 1:
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜 𝑒𝑚 𝑚𝑙

Cálculo de CFUs
1. TSA diluição 1:100
131 ∗ 100
= 262000 𝐶𝐹𝑈⁄𝑚𝑙
0,05

2. Multiplicação pelo volume total de suspensão:

(262000 𝐶𝐹𝑈𝑠 ⁄𝑚𝑙) ∗ 10 𝑚𝑙 = 2620000 𝐶𝐹𝑈𝑠
3. Número esperado de CFUs por ml de solo, sendo que a amostra recolhida
tinha 4,0 ml de solo:
2620000 𝐶𝐹𝑈𝑠
= 655000 𝐶𝐹𝑈𝑠 ⁄𝑚𝑙
4,0 𝑚𝑙

Número de colónias CFUs/ml

PDA+CT sem diluição Incontável (Não houve -
crescimento)
TSA sem diluição Incontável (Não houve -
crescimento)
TSA diluição 1:10 Incontável (Mau -
espalhamento)
TSA diluição 1:100 131 262000 CFUs/ml
TSA diluição 1:1000 Incontável (Não houve -
crescimento)
Tabela 1: Número de colónias contadas e valores de CFUs/ml calculados

Cálculo MICs50
O valor calculado para MIC 50 irá corresponder à concentração mínima a partir
da qual 50% do crescimento de população microbiana é inibido. O cálculo das MICs 50
para as diferentes estirpes de C.glabrata, com atuação de diferentes concentrações de
antifúngicos, irá permitir que tiremos conclusões no que diz respeito à eficácia do
antifúngico para o combate da infeção.
Para efetuarmos o cálculo das MIC 50, teremos de ter em conta o valor da
densidade ótica (DO) medida sem a atuação do antifúngico, que corresponde ao
crescimento fúngico sem a atuação do inibidor, coluna RPMI. A DO da coluna RPMI foi
dividida por 2, permitindo obter a DO que corresponde a metade do crescimento do
antifúngico. Posteriormente, este valor foi comparado com os valores obtidos nos poços
que contém antifúngico em diferentes concentrações. Sendo que, a menor
concentração que se registar uma DO menor ou igual ao valor calculado, corresponde
à MIC 50.
Na tabela 2 encontra-se o resumo das observações que realizamos em relação
à atuação do antifúngico Fluconazol nas diferentes estirpes de C.glabrata. Levando-nos
à conclusão, que a estirpe A apresenta resistência ao antifúngico Fluconazol, sendo que
a MIC 50 é 64 mg/L que é o valor break-point. Também as estirpe B e D serão
resistentes, pois a MIC 50 será para um valor superior a 64 mg/L. A estirpe C de
C.glabrata apresenta um valor de MIC50 de 16 mg/L tendo uma resistência intermédia
ao Fluconazol. C.glabrata apresenta elevada tolerância ao Fluconazol, sendo que a
classificação mínima tabelada é a intermédia.

Concentração
Estirpe de
mínima inibidora de MIC 50
C.glabrata
50% do crescimento
1,605
A = 0,803 64 mg/L
2
nenhuma concentração terá
1,556
B = 0,778 uma inibição de crescimento
2 de 50% ou mais
1,420
C = 0,710 16 mg/L
2
nenhuma concentração terá
1,390
D = 0,695 uma inibição de crescimento
2 de 50% ou mais
Tabela 2: Resumo da comparação dos valores das densidades óticas dos poços com
diferentes concentrações de antifúngico e a concentração mínima inibidora de 50% do
crescimento, para determinar a MIC 50.

Na tabela 3 está resumida as observações que fizemos no que diz respeito à

atuação do antifúngico Caspofungina nas diferentes estirpes de C.glabrata. Que nos
permitiu concluir, tendo em conta que a MIC 50 de todas as estirpes A, B, C e D, foi 0,5
mg/L, que todas elas são resistentes ao antifúngico Caspofungina. Pois o valor de
break-point tabelado para a resistência de C.glabrata à Caspofungina é este ser maior
ou igual a 0,5mg/L.

Concentração
Estirpe de
mínima inibidora de MIC 50
C.glabrata
50% do crescimento
 1,687
A = 0,844 0,5 mg/L
2
1,430
B = 0,715 0,5 mg/L
2
1,183
C = 0,592 0,5 mg/L
2
D 1,360
= 0,680 0,5 mg/L
2
Tabela 3: Resumo da comparação dos valores das densidades óticas dos poços com diferentes
concentrações de antifúngico e a concentração mínima inibidora de 50% do crescimento, para
determinar a MIC 50.

A nível clínico estirpes A, B e D apresentam uma grande resistência ao

antifúngico Fluconazol, a estirpe C apresenta resistência intermédia. Todas as estirpes
de C.glabrata em estudo apresentam resistência ao antifúngico Caspofungina. Em suma
podemos concluir que nenhum do antifúngicos em estudo é adequado para o controlo
de infeção causadas pelas estirpes A, B, C e D de C.glabrata.
Concluímos também que na estirpe C com a atuação de Fluconazol existe uma
incongruência que pode indicar algum erro experimental, pois seria expectável a
diminuição da DO com o aumento a concentração de antifúngico, no entanto, não foi o
que aconteceu. A DO do poço com concentração de 16mg/L é inferior à DO do poço
com concentração com concentração de antifúngico de 32mg/L. Também na estirpe D
se verifica uma contradição pois ocorre um grande aumento da DO do poço com
concentração de antifúngico 32mg /L comparativamente com a DO do poço com
64mg/L. Isto pode ser explicado por possível contaminação das pontas para as pipetas
automáticas fora da zona estéril.
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