MICOLOGIA E VIROLOGIA

CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS

Larissa Oliveira Daneluz

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Olá!
Você está na unidade Introdução à micologia. Conheça aqui a micologia, aprendendo sobre as características

gerais dos fungos, adquirindo conhecimento a respeito da importância dos fungos para as Ciências Biomédicas,

taxonomia, classificação e biologia fúngica, ressaltando aspectos relacionados ao diagnóstico laboratorial dos

principais fungos causadores de doenças no homem. Aprenda sobre as drogas antifúngicas e sobre o diagnóstico

micológico das infecções causadas por fungos utilizando as principais técnicas de identificação laboratorial de

fungos filamentosos, fungos dimórficos e leveduras, para que você obtenha embasamento teórico e prático na

área de micologia.

Bons estudos!

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1 História da micologia
Para iniciarmos o estudo sobre a micologia, é interessante entendermos a história geral e como ela surgiu, bem

como o que ela estuda e sua importância para as ciências biomédicas. Vamos nessa?

A história da micologia vem do século XVIII, quando a busca para entender as doenças microbianas se

intensificou e começaram a encontrar os reais motivos que explicassem algumas doenças. Nessa época, um

pesquisador de origem italiana se destaca, conhecido como Agostino Bassi (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 20).

Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 20), Bassi foi um pesquisador apaixonado pela área da micologia e contribuiu

para o esclarecimento de doenças microbianas de maneira fundamental, e é por esse motivo que ele é

conhecido como o “Pai da Micologia Médica”.

Durante muito tempo, a micologia dentro das ciências biomédicas teve pouca expressão em virtude da falta de

diagnósticos adequados e, portanto, do baixo desenvolvimento da área. Quando Linneu classificou os seres

vivos de forma sistematizada, eles foram divididos em dois grandes grupos, conhecidos por reinos: Reino

Animal e Reino Vegetal. Porém, como novos seres foram sendo descobertos e a ciência começou a evoluir de

forma exponencial, alguns desses não entravam nos requisitos propostos por Linneu, para fazerem parte

somente desses dois reinos e, então, essa classificação teve que ser amplificada. Assim, dois novos reinos foram

adicionados: o Reino Protista e Reino Monera (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 23).

No entanto, os fungos ainda faziam parte do reino vegetal, provavelmente por apresentarem características

semelhantes aos vegetais. Assim, a micologia acabava sendo um subtópico da botânica. Em pleno caos, de muitas

novas espécies com estruturas diferentes às espécies vegetais, em 1969, Whittaker e colaboradores, percebendo

que os fungos não possuiam todas as características semelhantes aos vegetais, resolveram criar um novo reino, o

Reino Fungi. Essas características diferentes eram de não possuirem clorofila, possuírem parede de quitina e

não de celulose e também por armazenarem glicogênio e não amido, como os vegetais (SIDRIM; ROCHA, 2004,

p. 24).

Ainda, em 1978, um pesquisador chamado Carl Woose propôs uma classificação baseada na homologia de

sequência do DNA ribossomal desses organismos. Por causa dessa classificação, os procariontes foram

divididos em dois domínios: Bacteria e Archae. Já os eucariontes foram separados nos domínios chamados de

Eukarya (formado pelos reinos Protista, Chromista, Fungi, Plantae e Animalia) (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 24).

Agora que você, estudante, conheceu um pouco de onde surgiu a divisão dos reinos de acordo com as

características comuns à eles e percebeu em qual reino a micologia se aplica, vamos adentrar no estudos dos

fungos?

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A micologia, ou seja, o estudo dos fungos, é uma ciência muito ampla, que não se restringe a estudar somente um

tópico. Dentro dela existem muitas subáreas, todas focadas nas possíveis aplicações e importância dos fungos.

Existe a micologia médica, micologia vegetal, micologia industrial e entre várias outras.

No nosso caso, na área da ciência biomédica, falaremos bastante a respeito da micologia médica, uma vez que o

estudo de fungos que causam doenças e os métodos de diagnóstico laboratorial se fazem importantes para sua

profissão.

Em relação a importância dos fungos na nossa vida, podemos citar três grandes áreas principais: ecologia,

indústria e alimentação e médica.

Como importância ecológica, podemos citar que os fungos participam de toda decomposição da matéria

orgânica, juntamente com as bactérias, ou seja, reduzem a compostos mais simples dos restos de alimentos e

seres mortos na natureza. Além disso, atuam na reciclagem dos elementos químicos na natureza,

devolvendo ao meio ambientes os elementos essenciais para os seres vivos.

Como importância industrial e alimentícia, as leveduras são as responsáveis por realizar o processo de

fermentação de pães e bebidas alcoólicas, bem como queijos. E, ainda, alguns tipos de fungos são utizados

diretamente como alimentos, como os cogumelos champignons, shitake e shimeji, muito utilizados na cultura

oriental e apreciados em muitos outros países.

Como importância médica, como já citado, eles são importantes pelas enzimas que produzem, as quais são

utilizadas para produção de fármacos que levam à possibilidade de servirem como antibióticos, impedindo o

crescimento e desenvolvimento de bactérias patogências a pessoas e animais.

Assista aí

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1.1 Biologia dos fungos

Você certamente já notou, ao se deparar com um pão mofado, que ele estava cheio de pontinhos pretos, certo?

Ou, ainda, já visualizou uma parede esverdeada mofada. Ou até mesmo já comeu queijo, tomou cerveja com os

amigos comemorando algo. Você sabia que os fungos são grandes responsáveis por esses produtos? Eles se

apresentam de diferentes formas, mas todos fazem parte do grande Reino Fungi. Vamos conhecer um pouco

desse grande grupo?

Os fungos são conhecidos pela população como mofos e bolores. Porém, quase sempre são lembrados somente

como danosos, seja causando problemas de saúde como alergias e micoses em pessoas e animais, ou parasitando

plantas. Ou, ainda, lembramos deles causando estragos em materiais, seja por deterioração ou por somente dar

aquele aspecto esverdeado e envelhecido nos objetos arquitetônicos. Além disso, estima-se que milhares de

doenças causadas por fungos em plantas economicamente importantes levem à um prejuízo de mais de um

bilhão de dólares por ano (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 330).

Figura 1 - Laranja com bolor

Fonte: Shutterstock, 2020

#PraCegoVer: Na imagem temos cinco laranjas e uma delas está com bolor, demonstrando que a mesma possui

fungos. Essa é uma das formas que os fungos podem se apresentar na natureza, na deterioração de matéria

orgânica, fazendo com que esse alimento deva ser descartado.

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No entanto, eles podem e são muito benéficos. Existem muitas vantagens geradas pelos fungos, porém, elas não

são tão divulgadas quanto os prejuízos. Todos os dias somos beneficiados por produtos originados direta ou

indiretamente de fungos, conhecidos como biofábricas excelentes.

Os fungos são organismos eucarióticos, ou seja, seres que apresentam uma membrana nuclear que envolve o

núcleo, o qual é definido e possui o material genético, formado pelos cromossomos e o nucléolo.

Esses organismos podem ser unicelulares (possuem uma única célula), ou multicelulares (possuem mais de

uma célula). Eles são seres heterotróficos, o que significa que não possuem pigmentos fotossintéticos capazes

de absorver energa luminosa como forma de síntese de compostos orgânicos. A maioria dos fungos possui sua

parede celular composta por quitina (polissacarídeo presente em artrópodes) e α-glucano. Como exemplos de

fungos multicelulares (os bolores) e podemos citar os fungos filamentosos, como os cogumelos. Já como

fungos unicelulares, temos as leveduras (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 41).

Além disso, é válido ressaltar que, dentro do grupo de fungos filamentosos, existe uma variação que são os

chamados fungos dimórficos, os quais se apresentam sob ambas as formas, dependendo principalmente da

temperatura, mas sob influência também do teor de CO2 e condições nutricionais (ANVISA, 2016, p. 2).

Fique de olho
Estima-se que, atualmente, existem aproximadamente cerca de 1,5 milhões de espécies de
fungos, e somente cerca de 69.000 espécies são conhecidas pelos especialistas da área, os
micologistas. Infelizmente, devido à ação predatória do meio ambientes, algumas espécies
acabam sendo extintas antes de serem descobertas e analisadas, causando prejuízo
imensurável para o equilíbrio ecológico, além de se limitar a possibilidade de conhecimento
acerca do potencial biotecnológico e biomédico dessas espécies.

Assista aí

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A maioria dos fungos que conhecemos se origina nos esporos (quando a reprodução é sexuada) ou nos conídios

(quando a reprodução é assexuada). Para que essa germinação aconteça, é necessário condições específicas,

como calor e umidade (MOLINARO et al., 2009, p. 400).

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O resultado dessa germinação é a formação de filamentos finos, que se chamam tubos germinativos. Esses

tubos então vão se ramificando em vários sentidos e acabam formando uma grande massa filamentosa,

formando o que chamamos de micélio, o qual constitui o sistema vegetativo (importante para a absorção

nutricional do fungo e desenvolvimento do mesmo) (MOLINARO et al., 2009, p. 400).

Existem também uma variedade de filamentos mais simples que, em conjunto, formam o micélio, os quais

chamamos de hifas. As estruturas reprodutivas são denominadas de corpo de frutificação e essa normalmente é

a estrutura visível a olho nu nos fungos.

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1.2 Nutrição e metabolismo dos fungos

Conforme já falamos anteriormente, os fungos não possuem clorofila e, por isso, o substrato que ele se

encontra necessita fornecer todas as substâncias que ele precisa para sobreviver, o que obriga os fungos a

viverem em estado de saprofitismo, parasitismo, simbiose ou mutualismo. De acordo com Molinaro e

colaboradores (2009, p. 402 e 403) sendo assim, podemos dividi-los em alguns grupos principais, tais como

• Saprófitas obrigatórios

São fungos que vivem exclusivamente em matéria orgânica morta, não parasitando organismos vivos.

• Parasitas facultativos ou saprófitas facultativos

São aqueles fungos que causam doenças ou vivem em restos orgânicos, de acordo com as circunstâncias

que se encontram.

• Parasitas obrigatórios

São os fungos que vivem exclusivamente atacando organismos vivos.

Para que cresçam e se desenvolvam, várias espécies não precisam de luz, já outras necessitam, para formar suas

estruturas de reprodução, podendo ser consideradas fototróficas (as quais buscam a luz). A temperatura ideal

para o desenvolvimento dos fungos se encontra entre 0º a 350°C, mas o ótimo para a maioria fica entre 20º a

300°C e a umidade ideal fica em torno da saturação (MOLINARO et al., 2009, p. 403). Ou seja, os fungos

conseguem crescer e se desenvolver numa ampla faixa de temperatura, sendo considerados então cosmopolitas

, pois estão presentes em qualquer parte do planeta, distribuindo-se no solo, no ar, na água, nos animais, nos

vegetais, na matéria em decomposição, nos produtos de alimentação e entre outros.

Assista aí

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2 Taxonomia e Classificação dos fungos
A taxonomia dos fungos é dividida, de forma tradicional, em características citológicas e morfológicas. É

importante que você saiba que essa taxonomia atualmente pode ir mudando novas características serem

adicionadas, com o desenvolvimento de técnicas bioquímicas e moleculares, como forma de auxiliar a

identificação das espécies fúngicas. Técnicas como as baseadas na Reação de Cadeia da Polimerase (PCR),

sequenciamento de DNA, isoenzimas e cromatografia são bons exemplos de possibilidades de identificação

de novas espécies fúngicas (MOLINARO et al., 2009, p. 403).

Dividimos, então, o reino Fungi em sete filos: Chytridiomycota, Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota,

Microsporídia, Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota, e um grupo, os fungos anamórficos. Este último

grupo não possui valor taxonômico, sendo seus membros relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota

(MOLINARO et al., 2009, p. 403). Não se assuste com os nomes, logo falaremos de cada filo!

2.1 Filo Chytridiomycota

De acordo com Molinaro e colaboradores (2009, p. 404), esses são fungos saprófitos aquáticos, sendo poucos

marinhos e muitos de água doce. Um exemplo de fungo desse filo é Chytriomyces sp.

Segundo Silva e Coelho (2009, p. 10) a maior parte desse tipo de fungo quitridiomicetos são saprófitos,

existindo também espécies parasitas de plantas, animais e outros fungos. Quando são hospedeiros de vegetais,

eles parasitam plantas superiores, musgos e fitoplancton. Em animais podem parasitar nematóides, rotíferos,

mosquitos e besouros.

2.2 Filo Neocallimastigomycota

Representantes desse filo são encontrados no trato digestivo de mamíferos herbívoros e bem possivelmente em

demais ambientes terrestres e aquáticos que sejam anaeróbicos. Exemplo desse filo são os Neocallimastix sp

(MOLINARO et al., 2009, p. 404).

2.3 Filo Blastocladiomycota

Representantes desse filo são assexuados, habitam locais restritos de água e parasitam principalmente insetos.

Exemplo desse filo são os Allomyces sp. e Coelomomyces sp (MOLINARO et al., 2009, p. 404).

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2.4 Filo Microsporídica

Representantes desse filo não possuem mitocôndria na sua estrutura celular, além de serem parasitas

obrigatórios de animais e, normalmente, hospedarem-se em peixes e insetos (MOLINARO et al., 2009, p. 404).

2.5 Filo Glomeromycota

Representantes desse filo são fungos filamentosos de micorrizas arbusculares, ou seja, participam de uma

relação mutualistíca com algumas plantas. Exemplos são o Mucor sp. e Glomus sp. (MOLINARO et al., 2009, p.

404 e 405).

2.6 Filo Ascomycota

Esse é o maior grupo do reino Fungi, representando quase 75% de todos os fungos já descritos

taxonomicamente. Representantes desse filo são fungos saprófitas, cosmopolitas e são parasitas especialmente

de algumas plantas. Além disso, podem viver em associação mutualística com algas unicelulares formando o que

chamamos de líquens. Exemplos são o Eurotium sp. e Emericella sp. (MOLINARO et al., 2009, p. 405).

Segundo Silva e Coelho (2009, p. 13) também existem ascomicetos parasitas de vegetais, os quais representam

um grande problema econômico para muitos países, uma vez que por exemplo a espécie Cryphonectria parasítica

ataca folhas de castanheiras, o que acaba comprometendo seu crescimento e prejudicando as plantações.

Os fungos comestíveis, conhecidos como morchelas, e também as trufas, são ascomicetos. Apreciadores

procuram, e muito, o ascoma de Morchella esculenta e o cultivo dessa espécie só foi possível de ser realizado em

1983, não permitindo produção em escala industrial, o que torna essa espécie mais desejada ainda (SILVA;

COELHO, 2009, p. 13).

Outra espécie de ascomiceto muito desejada por apreciadores é a espécie Tuber melanosporum é uma trufa

comestível. Essa espécie é micorrízica das raízes de carvalho e mantém seus ascomas sob o solo, liberando seus

esporos quando apodrecem ou são destruídos por animais (SILVA; COELHO, 2009, p. 13).

A maioria das leveduras também são ascomicetos unicelulares, e elas irão se dividir em diferentes 60 gêneros

com aproximadamente 500 espécies conhecidas.

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2.7 Filo Basodiomycota

Os fungos desse filo são saprófitos e cosmopolitas. São os cogumelos que tanto conhecemos. Exemplos desses

fungos são Agaricus sp. e Rhodotorula sp. (MOLINARO et al., 2009, p. 406).

Portanto, dentro desse filo estão os fungos conhecidos popularmente como cogumelos e orelhas de pau, outros,

chamados de fungos gelatinosos, gasteromicetos, ferrugens e carvões, e ainda espécies unicelulares. Na

maioria, são fungos terrestres, existindo também muitas espécies parasitas (ferrugens), e, ainda, espécies que se

formam de forma liquenizada. Estão por toda parte e são facilmente vistos em bosques, na natureza, em

gramados e locais com umidade, devido ao fato de possuirem um considerável tamanho (SILVA; COELHO, 2009,

p. 14).

Figura 2 - Cogumelos na natureza

Fonte: Juddy Kennamer, Shutterstock, 2020

#PraCegoVer: Na imagem temos cogumelos crescendo em um solo recoberto de grama provavelmente bem

úmido.

Fique de olho
No filo Basodiomycota, existem muitos fungos que produzem fungos de cogumelos
comestíveis. Porém, é muito importante que você saiba que não se deve utilizar diretamente
cogumelos retirados da natureza para alimentação, sem uma análise prévia de especialistas.
Isso porque existem muitas espécies tóxicas para o corpo humano e somente especialistas
teriam embasamento para analisar corretamente se a espécie é comestível ou poderia causar
algum malefício para a saúde da pessoa ou animal.

Sendo assim, recomenda-se sempre comer somente cogumelos comercializados, pois esses já

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 Sendo assim, recomenda-se sempre comer somente cogumelos comercializados, pois esses já
passaram por análise e produção especializada.

2.8 Fungos Anamórficos

Os fungos desse grupo estão relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota e. por esse motivo, não foram

classificados como um filo específico, pois possui sequências gênicas comparadas com esses dois. São

cosmopolitas, saprófitos e parasitam especialmente animais e plantas. Os exemplos mais comuns são Aspergillus

sp e Penicillium sp (MOLINARO et al., 2009, p. 406).

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3 Drogas Antifúngicas
Cada vez mais as ciências biomédicas buscam novos tipos de fármacos antifúngicos, buscando atender as

demandas cada vez maiores da micologia médica. As drogas antifúngicas surgiram muito depois das drogas

antibacterianas, uma vez que os fungos, ao contrário das bactérias, são eucarióticos. Esse fato faz com quem

terapias antifúngicas levem à efeitos colaterais e dificulte os estudos de novos possíveis fármacos (SIDRIM;

ROCHA, 2004, p. 50).

O primeiro composto utilizado como antifúngico foi o iodeto de potássio. Esse composto químico, por mais que

a micologia tenha se desenvolvido nos últimos anos, continua sendo a primeira escolha para tratamento de

esporotricose ((SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 50).

No início da década de 1950, a nistatina tomou importância para tratar infecções causadas por leveduras, como

aqueleas relacionadas com Candida spp. e ela é muito utilizada até hoje para tratar infecções de pele e mucosas

em geral. Em 1956, surgiu a anfotericina B e assim as micoses tiveram um grande avanço no que tange à

possibilidade de tratamento, uma vez que fora somente essa droga capaz de terminar com as infecções fúngicas

mais profundas (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 50).

O grande “boom” da micologia no que tange ao descobrimento de novas drogas antifúngicas fora a partir de

1965, com o benzimidazol e a partir dele, novos compostos conhecidos como miconazol, cotrimazol, econazol,

isoconazol, ticonazol, cetoconazol, oxioconazol. E anos depois, da década de 1990, com derivados desses

compostos, como fluconazol, itraconazol, voriconazol, ravuconazol e entre outros.

Em resumo, as drogas antifúngicas podem ser divididas em duas categorias principais:

Agentes originados de micro-organismos

Como, por exemplo, a nistatina e anfotericina B.
Agentes químicos
Como, por exemplo, o iodeto de potássio, derivados azólicos, alilaminas, derivados morfolínicos e equinocandinas.

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4 Laboratório de micologia
De acordo com Sidrim e Rocha (2004, p. 63), as atividades dentro de um laboratório que atua com micologia

devem seguir metodologias clássicas e seguir exigências prévias. A colheitas de materiais clínicos é a primeira

etapa do diagnóstico laboratorial e deve ser feita de maneira mais correta possível, uma vez que se não for feita

com cuidado e com técnica, pode inutilizar o material e prejudicar as análises posteriores.

Deve-se sempre questionar o paciente se ele se encontra em utilização de medicação antifúngica e, caso ele

esteja utilizando, deve ser suspenso por um período de 15 dias antes da colheita, se for de uso tópico, e por 1

mês, quando se tratar de drogas de uso sistêmico (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 63).

É importante ressaltar que todo material coletado deve estar acompanhado de uma ficha padrão, contendo

todos os dados pessoais do paciente, bem como os dados clínicos e epidemiológicos. Normalmente, as análises

devem seguir no máximo em 2 horas depois, porém, quando não puder ser realizado nesse período de tempo,

elas podem ser acondicionadas em refrigerador por até 24 horas, exceto em caso de zigomicose.

Primeiramente deve-se realizar uma análise visual da lesão e, posteriormente, a assepsia

Coleta de com álcool isopropílico 70%. A seguir, com auxílio de uma cureta dermatológica ou

escamas lâmina de bisturi, deve-se raspar vigorosamente as bordas das lesões cutêneas ativas

de pele distruibuídas pelo corpo. Esse material deve ser acondicionado em uma placa de Petri

estéreis (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 63).

Normalmente, quando se coleta cabelos, desconfia-se de dermatofitose do couro

cabeludo. Para isso, deve-se coletar pelos e cabelos que tenham probabilidade de estarem
Coleta de
infectados, otimizando o processo de isolamento de fungos dermatofíticos e esses pelos
pelos e
encontram-se nas regiões de alopecia (áreas de rarefação de pelos). Sendo assim, eles
cabelos
devem ser retirados por arrancamentos com auxílio de uma pinça flambada (SIDRIM;

ROCHA, 2004, p. 65).

Para colheita de material das unhas, deve-se sempre possuir como material tesouras de

Coleta de várias dimensões, limas, alicates de unhas e diversas curetas dermatológicas. Quando

unhas coletas, deve-se sempre procurar retirar material da região de progressão e confluência

do tecido doente (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 65).

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 Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 66), sempre que se coletar esse tipo de material, utiliza-
Coleta de
se swab estéril e deve-se coletar, no mínimo, duas amostras de cada lesão. Caso não
mucosas,
orifícios puder levar o material direto para o laboratório, deve-se acondicionar o swab em solução

naturais e salina e mantê-los refrigerados por no máximo 24 horas.

secreções No caso de lesões na boca, deve-se realizar uma raspagem ou biópsia da lesão com cureta
diversas
dermatológica. No caso de lesões na vagina, coletam-se dois swabs, um para confeccionar

lâmina histológica e outro para cultura microbiológica.

Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 66), a metodologia é a mesma preconizada para

Coleta de
sangue hemocultura bacteriana, ou seja, realiza-se assepsia na região, coleta-se de 5 a 10 mL

periférico de sangue e precede-se com as recomendações do meio de cultura utilizado. Para análise

e medula de fungos no sangue, existem atualmente muitos sistemas automatizados, como o ESP
óssea
(Difco), o BacT/Alert (Organon Teknika), o BACTEC e o BACTEC NR.

Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 68), esse tipo de coleta deve ser feito de forma mais
Coleta de limpa possível, ou seja, mas asséptica possível. De preferência, deve-se obter por punção
pus e
de abcessos não abertos após realizar processo de assepsia com álcool 70% ou álcool
líquidos
iodado. Nesse tipo de coleta, entram os líquidos pleural, sinovial, ascítico, os quais devem
patológicos
ser processados imediatamente.

Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 67), a metodologia é a mesma preconizada

Coleta de
normalmente para coleta de urina, porém deve-se ter cudiadosa degermação da região
urina
genitourinária externa com água e sabão neutro antes.

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5 Diagnóstico laboratorial de fungos
Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 69), existem principalmente duas etapas no diagnóstico laboratorial fúngico, a

microscopia e a cultura.

5.1 Exame direto: Microscopia

A microscopia é a primeira etapa do diagnóstico laboratorial micológia, sendo ela considerada o exame direto

nesse caso. Essa primeira etapa vai nos dizer se o material coletado possui ou não estruturas fúngicas e vai

possibilitar uma análise prévia do tipo de fungo que estamos lidando (SIDRIM; ROCHA, 2004, p. 69).

São elas preparações montadas entre lâminas e lamínulas, imersas em alguma substância que facilite a sua

visualização microscópica, como compostos químicos como hidróxido de potássio (KOH), hidróxido de sódio

(NAOH), tinta da China ou K-tinta.

A coloração é muito utilizada nos laboratórios de Micologia para visualização das estruturas vegetativas e

reprodutivas dos fungos, as formas de leveduras, e realizar testes de viabilidade.

Para análise de escamas de pele, pelos, cabelos e unhas coloca-se de 1 a 2 gotas de solução clarificante

(hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio a 40% ou K-tinta) e, sobre estas, algumas escamas ou pelos

/cabelos, ou ainda os fragmentos de unhas. Cobre-se com lamínulas e deve-se aguardar um período de 5 a 20

minutos. Em seguida, deve-se analisar o material em microscópio óptico com objetiva de 40x (SIDRIM; ROCHA,

2004, p. 69).

Para análise de mucosas, oríficos naturais e secreções diversas, como a coleta fora realizada com dois swabs,

somente um é utilizado para preparação da lâmina. Realiza-se um esfregaço, que será corado pela prata-

metenamina e outra lâmina com KOH. O segundo swab é utilizado para realização da cultura (SIDRIM; ROCHA,

2004, p. 70).

No caso de análise de escarro, pus e líquidos patológicos são preparadas três lâminas, uma do tipo lâmina-

lamínula com KOH e as outras com esfregaços para ser corado com prata-metenamina e outro pela Giemsa.

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5.2 Exame microscópico com hidróxido de potássio (KOH)

Realizar técnicas de microscopia com hidróxido de potássio é indicado para pelos, pele, unha, tecido obtido por

biópsia, exsudatos espessos e outros materiais densos. Deve-se adicionar uma gota de KOH (aquoso a 20%) em

uma lâmina de microscopia e sobre esta, uma pequena porção da amostra a ser analisada. Deve-se

imediatamente cobrir a preparação com uma lamínula e, para intensificar a clarificação, pode-se aquecer

ligeiramente, sobre a chama de um bico de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examina-se a preparação após

aproximadamente 20 minutos, em microscópio óptico comum, inicialmente, com objetiva de 10x, seguida de 40x

(ANVISA, 2016, p. 7).

5.3 Exame microscópico com Tinta Nanquim (Tinta da China)

Segundo a Anvisa (2016, p. 7) essa técnica é usada em amostras de líquor, urina, secreções ou exsudatos, para

visualização de leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra o fundo

negro, proporcionado pela tinta. Para realização da técnica, deve-se adicionar uma gota de tinta nanquim e uma

gota do sedimento da amostra centrifugada sobre uma lâmina. Após, deve-se cobrir a preparação com lamínula e

observar ao microscópio óptico (objetivas de 10x e 40 x).

Diferencia-se os tipos celulares pela refringência da parede celular e das inclusões no citoplasma das leveduras,

em relação aos linfócitos, além da presença de brotamentos.

5.4 Exame microscópico com Coloração pelo Método de Gram

Segundo a Anvisa (2016, p. 7), como todos os fungos são caracterizados por serem gram-positivos, utiliza-se esse

tipo de técnica não para diferenciar os organismos, mas, sim, para discriminar elementos fúngicos de artefatos

existentes em urina, secreções e fezes. A amostra deve ser homogeinezada, em movimentos circulares, em uma

lâmina de microscopia, fixada com calor e submetida à coloração.

5.5 Exame microscópico com Coloração Panótica (Giemsa, Leishman ou

Wright)

Segundo a Anvisa (2016, p. 7), esse tipo de técnica é escolhida para pesquisa de Histoplasma capsulatum em

diferentes amostras biológicas: medula óssea, sangue, aspirados e secreção cutânea. Nestes casos, deve-se

fazer um esfregaço semelhante ao usado para coloração de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o

método escolhido.

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6 Exame indireto: Cultura celular
Após o exame direto, a cultura é extremamente necessária para a possibilidade de se isolar e identifiar

corretamente o fungo que estamos lidando. Assim sendo, as amostras devem ser semeadas em diversos meios

de isolamento, sendo eles escolhidos de acordo com os achados micológicos do exame direto ou das

preparações coradas e, também, pelo caso clínico da pessoa ou animal.

Os meios de cultura utilizados na micologia são preparações que devem conter as fontes nutricionais necessárias

para o crescimento e multiplicação dos organismos. Cultivar micro-organismos dentro de uma placa de Petri

pode ter diferentes finalidades, mas mas é importante saber que todo meio de cultura deve suprir as

necessidades mínimas para que in vitro se consiga um ambiente parecido ao que se encontrava o organismo na

natureza (MOLINARO et al., 2009, p. 425). Os meios de cultura mais utilizados na micologia são o Ágar

Sabouraud dextrose (ASD), o Ágar Batata Dextrose, o Ágar Mycosel, o Ágar BHI (ágar infusão de cérebro e

coração), Ágar extrato de malte (MEA).

Segundo a Anvisa (2016, p. 8), a amostra, após o processo de exame direto pode ser usada para isolamento do

agente etiológico fúngico. Para isso, deverá ser semeada em movimentos de estrias (movimentos de “zig-zag”)

sobre a superfície de meios sólidos de cultura, seja em tubos de ensaio ou ainda em placas de Petri, de acordo

com o método de escolha.

De acordo ainda com a Anvisa (2016, p.9), esses meios de culturas, para que se possa isolar primariamente os

fungos a partir de amostras biológicas, podem ser adquiridos prontos ou ainda podem ser produzidos no próprio

laboratório, seguindo a recomendação dos fabricantes. Quando comprados comercialmente, eles vem

desidratados e devem sofrer processo de hidratação, conforme instruções do fabricante, e, assim, o meio deve

ser distribuído, de preferência, em tubos ou placas de Petri e esterilizados por autoclavação.

Quando estamos falando de solidificar um tubo contendo ágar, recomenda-se deixar o mesmo inclinado,

deixando espaço de 3 cm do final do meio até a tampa, para evitar contaminação via meio externo. E quando

necessitarmos isolar um fungo a partir de alguma amostra biológica dentro do laboratório? Para isso, devem ser

utilizados meios não seletivos, que permitam crescimento de fungos patogênicos e bolores de crescimento

rápido, ou seja, fungos que crescem em menos de 7 dias. Esse isolamento é muito importante para diagnóstico

laboratorial das infecções ditas oportunísticas (ANVISA, 2016, p. 9).

O meio dito básico em um laboratório de micologia é o ágar Sabouraud dextrose (ASD), conhecido de ágar

Sabouraud. Na maioria das vezes, deve-se adicionar um antibiótico para impedir o crescimento de bactérias que

prejudicariam o isolamento fúngico (ANVISA, 2016, p. 9).

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7 Identificação de fungos
O profissional responsável por analisar os exames micológicos deve tentar identificar todas as culturas positivas

e emitir o resultado mais correto possível. Na maioria das vezes, o exame microscópico direto da amostra é

suficiente para medidas de controle da infecção, entretanto, outras vezes, o isolamento por meio de cultura e

identificação do fungo são imprenscidíveis para orientar a conduta clínica.

Essa identificação dos fungos deve contemplar o gênero e a espécie. Porém, em alguns casos, devido à

complexidade do exame, não é possível dizer exatamente qual gênero e espécie é aquele fungo, assim nesses

casos somente fala-se o grupo dos fungos (ANVISA, 2016, p. 12).

7.1 Identificação de fungos filamentosos

Segundo a Anvisa (2016, p.16), a identificação de fungos filamentosos baseia-se fundamentalmente na

observação da morfologia da colônia e aspectos microscópicos. A análise da colônia objetiva observar: a cor,

textura, superfície, pigmento difusível no meio de cultura, entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio

contendo a cultura primária do fungo. Porém, o mais correto de se fazer é analisar o chamamos de “colônia

gigante”, ou seja, uma cultura feita no ponto central de uma camada de ágar distribuído em placa de Petri. A

velocidade de crescimento, que pode ser rápida (menor que 7 dias), intermediária (de 8 a 14 dias) ou lenta

(maior que 15 dias) é fundamental para que se possa identificar presuntivamente o fungo.

Mas como sabemos que trata-se de um fungo filamentoso? Normalmente, ao observar microscopicamente,

somente ao observar estruturas típicas, como hifas hialina ou demácia, septada ou cenocítica, forma, disposição e

formação de esporos já são suficientes para podermos concluir que estamos diante de um fungo filamentoso

(ANVISA, 2016, p. 12).

Segundo Almeida (2011, p. 27) uma possibilidade é a técnica de esgarçamento, a qual é sempre utilizada como

primeira tentativa, por ser mais rápida para identificar as colônias filamentosas. As estruturas fúngicas são

quebradas, porém isso torna mais difícil a identificação.

Outra possibilidade de identificação é a de microcultivo em lâmina. No microcultivo em lâmina, as estruturas

permanecem íntegras além de ser utilizado um meio de cultura (ágar batata ou ágar ASD), os quais estimulam a

produção de macro e microconídeos, que na maioria das vezes identificam o fungo (ANVISA, 2016, p. 16;

ALMEIDA, 2011, p. 27-30).

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7.2 Identificação de fungos dimórficos

Fungos dimórficos são aqueles fungos filamentosos que podem, em algumas situações, assumir forma de

levedura. Nessa forma, eles diminuem sua capacidade de filamentação e dividem-se por brotamento e, assim,

suas colônias ficam com aspecto cremoso (ANVISA, 2016, p. 18).

Este tipo fúngico vai ocorrer normalmente sob temperatura acima de 30°C, preferencialmente à 37°C. São fungos

de crescimento lento, na maioria das vezes mais de 15 dias, no primo-isolamento (Histoplasma capsulatum e

Paracoccidioides brasiliensis ou moderado (8 a 14 dias), como Sporothrix schenckii. Para que possamos

identificar esses fungos, devemos comprovar por meio da visualização do e comprovação do dimorfismo e pelo

aspecto microscópico característico de cada fase (ANVISA, 2016, p. 19).

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7.3 Identificação de leveduras

Segundo Sidrim e Rocha (2004, p. 89), em pessoas saudáveis, sabe-se que existe uma população de leveduras em

pleno equilíbrio que fazem parte da flora microbiana normal do organismo. Seu número vai variar de acordo

com o local, mas sempre vai estar em estado de equilíbrio sem causar-lhe dano. Isso quando está tudo certo

com o estado imunológico. Porém, quando estamos com nossas defesas imunológicas descompensadas, esse

número pode variar e elas podem colonizar um local anatômico, gerando infecções e problemas mais graves,

levando a doenças geradas pelas leveduras, como é o caso por exemplo da candidíase, ocasionada pela Candida

spp.

Ao contrário dos fungos filamentosos, a estrutura morfológica das leveduras não apresenta muita diversidade e,

portanto, nem sempre é um parâmetro suficiente para sua identificação. Em determinadas situações, no entanto,

a identificação rápida, simples e presuntiva pode ser feita, e isso vai contribuir significativamente para o

diagnóstico da infecção que acometeu o paciente (ANVISA, 2016, p. 12).

Deste modo, ao observarmos a levedura pelo microscópio e visualizarmos hifas hialinas e ramificadas, é

sugestivo do gênero Candida sps e se, além disso, desenvolver clamidósporos, que são células de reserva, ou

tubos germinativos, em determinadas condições “in vitro”, é identificada como Candida albicans. Outros gêneros

como Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporo, podem ser identificados apenas visualizando sua

morfologia característica (ANVISA, 2016, p. 12).

As outras espécies e gêneros, por sua vez, necessitam de outras análises, como provas bioquímicas para

identificação. No entanto, do ponto de vista clínico, na maioria das vezes não necessita-se saber acuradamente o

tipo da levedura. No caso, essa identificação pode ter interesse epidemiológico. Já quando falamos de leveduras

relacionadas a episódios de infecção hospitalar, há muita preocupação e necessidade de saber qual espécie

estamos lidando (ANVISA, 2016, p. 12).

Mas então, como analisar leveduras? Deve-se realizar plaqueamento de cada colônia morfologicamente diferente

e pura. De cada colônia se faz um repique em ágar ASF para posterior identificação. Importante ponto aqui é que

somente podem ser utilizadas colônias de leveduras obtidas de amostras biológicas, quando estas encontram-se

puras, ou seja, sem contaminação por bactérias ou outras espécies (ANVISA, 2016, p. 12).

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7.4 Identificação de Candida albicans e Candida sp.

Segundo a Anvisa (2016, p. 13), as provas fisiológicas realizadas que são mais comuns e simples para identificar

esse tipo de levedura são: tubo germinativo e filamentação em cultivo em lâmina. No cultivo em lâmina,

avalia-se a capacidade de produção de hifas hialinas ramificadas, que podem se fragmentar em esporos,

denominados artroconídios. Estas hifas ocorrem nos gêneros Geotrichum e Trichosporon. Ao analisar, caso a

levedura forme essas hifas hialinas ramificadas sem fragmentação, provavelmente vai pertencer ao gênero

Candida e se houver formação de clamidósporos característicos, vamos poder dizer que é Candida albicans.

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7.5 Identificação de Cryptococcus

Para identificar esse tipo de levedura, normalmente utiliza-se a pesquisa de cápsula, a qual é uma característica

marcante do gênero Cryptococcus. Essa técnica é realizada com uma gota de tinta nanquim e uma alçada da

cultura. A cápsula, constituída de material polissacarídico, aparece como um halo claro ao redor dos

blastoconídios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lâmina (ANVISA, 2016, p. 13).

Além disso, ainda segundo a Anvisa (2016, p. 13), a prova positiva no teste da Urease é outra possibilidade de

confirmação de Cryptococcus.

Figura 3 - Esquema simplificado para identificação de alguns gêneros de leveduras

Fonte: ANVISA, 2016 (Adaptado)

#PraCegoVer: Na imagem, podemos ver um esquema simplificado para guiar o profissional micologista ao

identificar leveduras.

Segundo Almeida (2011, p. 30), o teste do tubo germinativo é uma prova que vai caracterizar rapidamente a

levedura da espécie Candida albicans. A técnica é bem simples e é basicamente necessário semear um pequeno

inóculo dessa levedura em soro, o qual pode ser de várias espécies animais. Os soros recomendados são o

humano, o fetal bovino ou de cavalo ou albumina de ovo.

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A técnica de microcultivo de leveduras baseia-se no princípio de que elas quando incubadas em meio contendo o

detergente “Tween-80”, podem apresentar a capacidade de filamentar-se, formando pseudo-hifas e/ou hifas

verdadeiras. E isso faz com que, por essas características específicas filamentosas, possa-se sugerir a espécie da

levedura (ALMEIDA, 2011, p. 31).

A técnica de auxanograma (assimilação de carboidratos e nitrogênio), baseia-se, primeiramente, em avaliar a

capacidade que as leveduras possuem de utilizar um carboidrato como única fonte de carbono. Assim, utiliza-se

um meio basal sem carbono, onde a levedura será semeada. Após a semeadura, adiciona-se um carboidrato e

observa-se a capacidade de utilização da fonte de carbono adicionada. Quando esse carboidrato é assimilado

pela levedura, há crescimento desta ao redor da fonte de carbono (ALMEIDA, 2011, p. 34).

Além da capacidade de assimilar carboidratos, analisa-se também a capacidade de assimilar fonte de nitrogênio.

Demonstrando a capacidade que algumas leveduras possuem de assimilar nitrato de potássio (nitrogênio

inorgânico) como uma única fonte de nitrogênio na sua viabilidade biológica (ALMEIDA, 2011, p. 35).

é isso Aí!
Nesta unidade, você teve a oportunidade de:
• conhecer as noções e conceitos fundamentais sobre as característica dos fungos;
• compreender a taxonomia dos fungos, os termos utilizados para categorizar os fungos e quais são os
principais filos;
• obter capacidade de identificar fungos filamentosos e leveduriformes;
• aprender acerca do das drogas antifúngicas, sua história e principais características;
• conhecer as técnicas utilizadas para identificação e diagnósticos laboratoriais de fungos filamentosos,
dimórficos e leveduras.

Referências
ALMEIDA, S. R. de. Apostila de micologia clínica. Faculdade Ciências Farmacêuticas, São Paulo. 2011.

ANVISA. Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Módulo VII 2016.

MOLINARO, E. M. et al. Conceitos e métodos para a formação de profissionais em laboratórios de saúde, v.

4. 2009.

SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos. Guanabara Koogan, 2004.

SILVA, R. R.; Coelho, G. D. Fungos: Principais grupos e aplicações biotecnológicas. São Paulo, 2006.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. Microbiologia. 967 p. 2012.

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