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br

Estratégias para melhorar a eficiência reprodutiva em programas de transferência de

embrião de equinos
Strategies to improve reproductive efficiency in equine embryo transfer programs

Marco Antonio Alvarenga1, Eriky Akio Oliveira Tongu

Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Unesp, Botucatu, SP, Brasil.
1
Correspondência: [email protected]

Resumo

A transferência de embrião (TE) é uma importante biotecnologia aplicada a reprodução equina sendo
comercialmente utilizada no Brasil desde a década de 80. Devido ao seu grande sucesso, o avanço em busca de
melhorias para programas TE vem se tornando cada vez mais importante, procurando solucionar as principais
causas de infertilidade em éguas, assim como melhorar a utilização de éguas idosas e subférteis. O presente
artigo procura abordar os principais problemas relacionados a TE em equinos, assim como buscar estratégias que
visem solucionar ou minimizar fatores que interferem na eficiência reprodutiva.

Palavras chave: éguas idosas, transferência de embriões, equinos.

Abstract

Embryo transfer (ET) is an important biotechnology applied to equine reproduction, and is

commercially used in Brazil since the 1980's. Due its great success, the search for improvements in TE programs
is mostly important for finding the main causes of infertility in mares, as well as improving the use of older and
sub fertile mares. This article aims to address the main problems related to ET in equine, as well as to seek
strategies to solve or minimize factors that interfere in reproductive efficiency.

Key words: old mare, embryo transfer, horses.

Introdução

O interesse nos últimos anos pelo uso da Transferência de Embriões (TE) tem crescido na indústria do
cavalo. Ultimamente, quase a totalidade das associações de criadores de cavalo reconhecem os benefícios da
técnica, permitindo o seu uso. No Brasil, o uso da técnica foi iniciado pelo Médico Veterinário João Junqueira
Fleury comercialmente em 1986 (Lira et al., 2009).
Existe uma grande variedade de raças que utilizam a técnica, sendo as mais atuantes: Mangalarga
Marchador, Campolina, Quarto de Milha e Mangalarga Paulista (Alvarenga e Losinno, 2006). Existem no Brasil
cerca de 30 centros de TE em equinos, parte deles prestador de serviços para terceiros e o restante para uso
exclusivo em animais de um único proprietário. Na raça Quarto de Milha e nas raças de Hipismo as TEs são
tradicionalmente realizadas em centrais de reprodução. Já em outras raças como Mangalarga, as TEs são
realizadas em sua maioria em estruturas montadas no próprio Haras do criador (Alvarenga e Losinno, 2006).
Atualmente o Brasil lidera a produção de embriões equinos respondendo por cerca de 50% dos
embriões transferidos no mundo, produzindo anualmente cerca de 25.000 embriões transferidos (Losinno e
Urosevic, 2015).
A TE, assim como qualquer outra biotecnologia reprodutiva, apresenta algumas limitações. As
principais dizem respeito à eficiência do programa que é comprometida principalmente por três fatores:
dificuldade na indução de superovulação de éguas; elevado percentual de doadoras idosas e éguas problemas e
manipulação inadequada do sêmen. Estes fatores associados ou isolados fazem com que a eficiência de
programas de TE nesta espécie sejam baixas, sendo necessários 2 a 3 ciclos para se obter uma gestação (Squires
et al., 2003; Alvarenga et al., 2008; Squires e Hon 2009; Jacob et al., 2010). Desta forma, os custos para a
produção de um potro proveniente de TE são elevados.
O presente artigo procura abordar os principais problemas relacionados a TE em equinos, assim como
estratégias que procuram solucionar ou minimizar fatores que interferem na eficiência reprodutiva.

Protocolos de superovulação em éguas

O principal obstáculo relacionado a superovulação de éguas está relacionada a refratariedade da égua

aos preparados hormonal à base de hormônio folículo estimulante (FSH) suíno disponíveis comercialmente,
sendo necessário o uso de FSH homólogo para se obter resposta ovariana ao tratamento. Desta forma, o extrato
_________________________________
Recebido: 17 de março de 2017
Aceito: 2 de abril de 2017
 Alvarenga e Tongu. Estratégias para melhorar a eficiência reprodutiva em programas de transferência de embrião
de equinos.

de pituitária equina (EPE) e o FSH equino purificado e mais recentemente o FSH recombinante são os
preparados indicados para induzir-se superovulação na fêmea equina (Alvarenga et al., 2008). Os protocolos
superovulatórios tem se mostrado eficientes em induzir múltiplas ovulações (4 a 5 ovulações/égua), contudo a
recuperação embrionária tem sido baixa, com uma média de 30% embriões/ovulação (Alvarenga, et al., 2008).
Durante o processo de múltiplas ovulações podem ocorrer alguns distúrbios na captação dos ovócitos
para o oviduto em éguas. Em éguas superovuladas com número menor de 3 ovulações, a taxa de recuperação de
ovócitos no oviduto foi similar a obtida no grupo de éguas com ovulações espontâneas. Este fato é
correlacionado a uma provável obstrução da fossa de ovulação provocada pelo sangramento de ovulações
subsequentes (Alvarenga et al., 2008).
Recentemente Nagao et al. (2012), demonstraram que o uso de baixas doses de acetato de deslorelina
próximo ao momento da dominância folicular, induzem com eficiência duplas ovulações em éguas da raça
brasileira de Hipismo e melhoram as taxas de recuperação embrionária.
Segabinazzi et al. (2015) compararam 2 protocolos, o primeiro sem acompanhamento folicular e o
segundo com acompanhamento folicular. No protocolo sem acompanhamento foram utilizadas duas aplicações
de PGF2α com intervalo de 14 dias. O tratamento com acetato de deslorrelina se iniciava 48 horas após a
segunda aplicação de PGF2α, sem qualquer avaliação do status reprodutivo das éguas. Foi então aplicado 125 µg
por via intramuscular (IM) de acetato de deslorelina (Sincrorrelin® - Ouro Fino, Brasil) a cada 12 horas. No
terceiro e quarto dia de tratamento com acetato de deslorelina as éguas foram avaliadas através de palpação retal
e ultrassonografia. Utilizando esse protocolo sem controle folicular 44% das éguas apresentaram duplas
ovulações.
Nos animais que a dinâmica folicular foi acompanhada, apresentaram no mínimo um folículo ≥ 28 mm
durante estas avaliações, o tratamento com acetato de deslorelina foi continuado até a detecção de dois ou mais
folículos ≥ 35 mm ou um ≥ 38 mm e edema endometrial grau 2 (Samper 2008). Quando a ovulação foi induzida
utilizando 750 µg de acetato de deslorelina IM e 1650 UI de Gonadotropina Coriônica Humana (hCG, Vetecort®
- Hertape Calier, Brasil) por via intravenosa (IV) obtendo 91% de duplas ovulações (Segabinazzi et al., 2015).

Utilização de éguas idosas em programas de TE

Diferente de outros animais domésticos, os equinos são mantidos em reprodução por um período longo
de vida. Além disso, não existe uma padronização quanto à classificação das éguas idosas em faixas etárias
como: jovens, intermediárias ou idosas, dificultando a comparação entre os experimentos (Bonin et al., 2010)
Carnevale et al. (1993), descreveram uma taxa de fertilização significativamente maior em éguas jovens
versus éguas idosas no dia 1,5 pós-ovulação (88% em éguas jovens contra 45% em éguas idosas). Quando
comparamos a taxa de recuperação embrionária de éguas jovens com éguas idosas, observamos uma menor taxa
de recuperação (embriões recuperados/ciclo) em égua idosas, 81,5%, 46,2% respectivamente (Alvarenga e
Losinno, 2006).
Segundo Fleury et al. (1998) e (Marinone et al., 2017), pode-se observar um decréscimo maior na
recuperação de embriões em éguas a partir dos 15 anos de idade. Éguas senis possuem um maior intervalo
interovulatório com fase luteal similar, mas com longa fase folicular comparada às éguas jovens. Esse fato é
associado com atraso de 3 dias para emergência do folículo dominante e o crescimento mais lento do folículo
ovulatório (Carnevale et al., 1993).
Embriões produzidos por éguas de idade avançada apresentam maior porcentagem de perda embrionária
entre dois a cinco dias após a fertilização, demonstrando desenvolvimento embrionário mais lento na tuba
uterina. Não são raros os casos em que os embriões chegaram a fase de mórula e migraram para o ambiente
uterino em até 8 dias após a ovulação (Carnevale e Ginther, 1992).
Devido a uma maturação ovocitária mais demorada são encontradas melhores taxa de recuperação
embrionária em éguas com mais de 15 anos em lavados mais tardios realizados nos dias 8,5-9,5-10 (Losinno e
Urosevic 2015). Sabe-se também que éguas idosas apresentam problemas com a maturação folicular que afetam
a maturação do ovócito, o que acarreta problemas na capacidade de desenvolvimento do embrião (Samper et al.,
2007). Em modelos in vivo, foi demonstrado uma relação entre idade cronológica da égua com danos a ovócitos
e embriões em estágios iniciais de desenvolvimento (Carnevale e Ginther, 1995). Essas anomalias no ovócito
tanto em éguas velha quanto em éguas subférteis, podem causar baixas taxas de recuperação embrionária devido
a sua qualidade baixa (Marinone et al., 2017)
A análise morfológica através da microscopia de luz e eletrônica de ovócitos de folículos pré-
ovulatórios de éguas jovens (3-19 anos) e idosas (>19 anos), demonstrou os ovócitos de éguas idosas possuem
um maior número de vesículas no núcleo e no ooplasma, em relação ás éguas jovens. Essa vacuolização foi
relacionada com o acúmulo de danos causados no ovócito (Carnevale, 2008).
Nos ovócitos de éguas idosas há uma expressiva redução de mitocôndrias em relação às jovens, além de
uma maior prevalência de anormalidades estruturais. Os eventos de maturação e mudança na atividade

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de equinos.

mitocondrial durante a maturação do ovócito é um elemento relacionado com a baixa qualidade do mesmo nas
éguas idosas (Rambags et al., 2014).
Especula-se que em éguas velhas, a produção de espécies reativas de oxigênios (reactive oxigen species,
ROS) durante a fosforilação oxidativa constitutiva causa maiores danos cumulativos sobre a membrana
mitocôndrial do ovócito. No entanto, essa lesão só se torna aparente quando a demanda de energia pelo ovócito é
maior comodurante a maturação in vitro. A redução no número de mitocôndrias e a qualidade de ovócitos
maturados de éguas velhas podem ter um efeito negativo sobre a competência do desenvolvimento (Hendriks et.
al., 2012).

O que podemos fazer para aumentar a recuperação embrionária de éguas velhas e/ou subférteis?

Como estratégias para melhorar os índices reprodutivos, é interessante a monitoração minuciosa da fase
folicular por ultrassonografia, inseminação na extremidade do corno e a utilização de meios diluidores de sêmen
com antibiótico. Destaca-se ainda como ferramentas importantes para melhorar os índices reprodutivos:
diminuição do número de inseminações por ciclo, a utilização de sêmen com alta taxa de fertilidade, bem como a
utilização de indutores de ovulação (Alvarenga e Losinno, 2006).
A utilização de plasma rico em plaquetas (PRP) e células-tronco em éguas com cervicite crônica,
endometrite e com desequilíbrio de resposta inflamatória pós-cobertura, vêm crescendo como técnicas
promissoras (Pavão, 2013). A utilização de PRP no útero após a inseminação artificial é capaz de reduzir a
porcentagem de neutrófilos no fluído uterino modulando a resposta inflamatória (Reghini et al., 2016). Quando
utilizado no momento da indução da ovulação, a taxa de prenhez de éguas subferteis aumentou de 20% para 80%
após tratamento com PRP (Metcalf, 2014). Estudo recente demostraram que a utilização de PRP reduziu a
quantidade de células polimorfonucleadas e preveniu o acumulo de líquido intrauterino, não alterando as
quantidades de oxido nítrico após inseminação artificial em éguas com endometrite crônica (Reghini et al.,
2016).
As células tronco têm sido utilizadas experimentalmente com sucesso. As células tronco mesenquimais
(MSC) são injetadas no útero de éguas com alterações fibróticas do endométrio. Pavão (2013) observou uma
redução de 30% de fibrose instalada no útero de éguas tratadas com células tronco. A utilização de MSC no
endométrio é um procedimento seguro que leva a uma leve e transitória resposta inflamatória, não tendo
ocorrência de nenhuma alteração clínica ou reprodutiva mostrando-se uma promissora ferramenta para o
tratamento de fibrose endometrial (Alvarenga et al., 2016a).
Quando éguas deixam de produzir embriões e já foram descartadas outras causas de infertilidade, a
obstrução de oviduto é um diagnóstico diferencial importante. Massas gelatinosas podem ocluir o lúmen do tubo
uterino e impedir que os espermatozóides cheguem ao local de fertilização ou impedir que os embriões cheguem
ao útero. A Protaglandia E2 (PGE2) é secretada pelo embrião equino em formação promovendo a passagem do
embrião para o útero. Administração tópica de PGE2 na superfície do tubo uterino estimula o transporte precoce
do embrião para o útero (Ortis et al., 2013).
A utilização de suplementos vem crescendo nos últimos anos, sendo desenvolvidos para melhorar e
suprir as diferentes necessidades e carências de cada animal, principalmente com idade avançada. Em éguas
senis as concentrações de FSH, LH e P4 são menores quando comparado com éguas jovens. Resende (2014),
demostraram que a suplementação com arginina aumenta as concentrações desses hormônios em éguas senis. O
ômega 3 também atua melhorando o equilíbrio hormonal, além de atuar como anti-inflamatório natural em
inflamações crônicas, antioxidante e imunoestimulante (Lindinger et al., 2017).
Em equinos pode ser observado uma melhora de 20% para 51% as taxas de recuperação de embriões
utilizando ômega 3 (Hembrooke 2008). Estudo recente com novilhas demonstraram que a utilização de ômega 3
auxilia no desencadeamento da ciclicidade em animais pré puberes (Moreira et al., 2016) . Utilizando ratos como
modelo experimental evidenciou que o ômega 3 ajuda a preparar o endométrio, favorecendo um ambiente mais
adequado para implantação do embrião (Sarsmaz et al., 2016).
Além dessas considerações queremos destacar a importância do cuidado no manejo de éguas velhas
doadoras de embrião. Investido em climatização de ambientes, rações e água de altíssima qualidade, tudo isso
para ter animais mais fortes, mais adaptados e em condições de conforto nas regiões onde são criados. São
necessárias alimentações de fácil mastigação e trituração e evitar competição devido a uma grande quantidade de
animais por piquete. Medidas ambientais simples deverão ser tomadas para evitar o estresse calórico como
propiciar sombra nos piquetes. Se não houver disponibilidade de sombra natural, recomenda-se providenciar
estruturas de sombreamento artificial (tela sombrite) para os animais (Dittrichet al., 2010).

Uso de receptoras não ciclantes

O uso da progesterona em éguas receptoras de embriões em anestro ou transicionais no início e final da

estação de monta tem se tornado frequente no Brasil. Este protocolo é importante pois, as éguas doadoras

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de equinos.

começam a ciclar mais precocemente do que as receptoras no início da estação de monta bem como deixam de
ciclar mais tardiamente no final da estação. Nos últimos anos, o ingresso no mercado de novos veículos
biodegradáveis de liberação lenta controlada associados a progesterona que mantêm os níveis plasmáticos por
até 14 dias, com uma única aplicação injetável, permite um melhor manejo deste recurso (Greco et al., 2016).
Rocha Filho et al. (2004) e Testa et al. (2005) avaliaram dois programas de transferência de embriões no
Brasil, os índices de prenhez e a perda embrionária precoce em éguas receptoras não ciclantes (anestro ou
transicionais) tratadas uma vez por semana com progesterona de longa ação (P4 LA). Não foi observada
diferença significativa entre o grupo não ciclante e ciclante demonstrando que este tratamento é seguro na
manutenção de gestação, permitindo a obtenção de altos índices de taxa de prenhez após a transferência de
embriões. Neste protocolo, as éguas em anestro são tratadas inicialmente por 3 dias consecutivos a partir do dia
da ovulação da doadora com estrógeno (2,5 mg de benzoato de estradiol por dia). Sendo iniciado o tratamento
com progesterona de longa duração um dia após a última aplicação de estrógeno. O tratamento com progesterona
é continuado semanalmente até os 120 dias de gestação da receptora. Deve-se estabelecer o dia da progesterona
no programa (exemplo: quarta feira), para que ocorra a supervisão dos tratamentos, pois a falha em uma
aplicação certamente levará a perda da gestação.
Mais recentemente, Greco et al. (2016) demonstraram que a utilização de receptoras cíclicas tratadas
com progesterona (1,5g P4 LA300) em diferentes fases do ciclo estral podem ser utilizadas com taxas
satisfatórias de gestação. Ressalta-se que ao iniciar o protocolo com ciclicas em diestro entre o dia 5 e 14 pós
ovulação a utilização de prostaglandina se faz no necessária no início do protocolo para eliminar o CL presente,
quebrando o ciclo normal da égua.

Manipulação adequada do sêmen e estratégias para melhorar qualidade do sêmen

Podemos apontar como sendo os principais erros cometidos com o uso de sêmen refrigerado no
Brasil: não respeito às regras básicas para processamento (dose, relação dodiluente: Sêmen);utilização de
sistemas de transporte inadequados (temperatura inadequada, não segurança contra estresse calórico
ambiental); não respeito a limitações do próprio garanhão (qualidade do sêmen, resistência ao transporte,
regime de coletas); momento e frequência das IA inadequados (Alvarenga e Losinno 2006; Varner 2016).
Diferentes experimentos foram realizados ao longo dos últimos 10 anos e pouco se evoluiu quanto a
possibilidade de preservar a fertilidade das células espermáticas de equinos por um período de tempo superior a
24 horas de refrigeração (Neuhauser et al., 2017; Gibb Aitken 2016). Certamente alguns reprodutores
apresentam sua fertilidade preservada por até 48 horas de armazenamento, pois similar ao sêmen congelado
existem garanhões mais e menos resistentes ao processo de refrigeração (Alvarenga, et al., 2016b). É importante
enfatizar que as inseminações devem ser realizadas em um período de tempo máximo de 24 horas antes das
ovulações.
Garanhões com baixa resistência a refrigeração, a retirada do plasma seminal é sempre benéfica.
Contudo para cavalos que refrigeram bem a centrifugação não traz nenhum benefício (Ramires et al., 2013).
Para a obtenção de bons índices de fertilidade, o sêmen depois de processado deve ser acondicionado
em recipientes especialmente desenvolvidos para este fim. Recipientes estes que obedeçam às curvas de
refrigeração já determinadas como adequadas. A temperatura de refrigeração ideal é de 5°C, contudo para
determinados garanhões temperaturas próximas de 15°C preservam melhor a motilidade espermática e
fertilidade (Aurich 2005).
Perante o exposto, são indicadas como estratégias para melhorar a eficiência da IA com sêmen resfriado
para garanhões sensíveis ao processo de refrigeração:

 Determinar o melhor regime de coleta semanal para cada garanhão;

 Determinar o melhor diluente;
 Determinar a temperatura ideal de transporte (5 x 15°C),
 Determinar o tempo máximo para transporte;
 Utilizar sistemas de transportes que mantenham temperaturas estáveis mesmo com aumento da
temperatura ambiente;
 Inseminar o mais próximo possível das ovulações;
 Remoção do plasma seminal através da centrifugação.

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