Apostila de Higiene Dos Alimentos

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Universidade de Brasília
Faculdade de Saúde – Departamento de Nutrição

HIGIENE DOS ALIMENTOS I

ROTEIRO PARA AS AULAS PRÁTICAS

Laboratório de Higiene dos Alimentos – UNB


Faculdade de saúde – Departamento de Nutrição
Profas. Eliana e Verônica
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Equipe do Laboratório de Higiene dos Alimentos:

Professoras:

Eliana dos Santos Leandro – Doutora em Microbiologia Agrícola, Universidade Federal


de Viçosa (UFV).

Verônica Cortez Ginani – Doutora em Nutrição Humana, Universidade de Brasília


(UNB).

Bióloga Analista:

Ester Cardoso Paes

Técnico:

Pedro Dantas

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Universidade de Brasília – UNB, campus Darcy Ribeiro


Departamento de Nutrição – Faculdade de Saúde
Brasília – Distrito Federal

SUMÁRIO

1. Normas de segurança no Laboratório de Higiene dos Alimentos

2. Preparo e esterilização de materiais e meios de culturas

3.Análise microbiológica de alimentos: contagem de colônias em placa

4. Análise microbiológica de alimentos: técnica do Número Mais Provável

5. Análise microbiológica de alimentos: Isolamento de bolores e leveduras

6. Análise microbiológica de alimentos: Isolamento de Staphylococcus aureus

7. Avaliação da Contaminação de Superfícies, Ambientes e Manipuladores

8. Procedimentos de higienização de hortaliças

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Normas de seguranças no Laboratório de Higiene dos Alimentos

1. Siga criteriosamente as instruções descritas em cada roteiro de aula prática;

2. Use jaleco em todas as aulas práticas. Seu uso é necessário para a proteção contra
possíveis contaminações e se evitar danos às roupas pelo uso de corantes e outros
reagentes;

3. Utilize sapatos fechados e roupas com um comprimento adequado para se evitar


acidentes e a exposição a possíveis contaminações;

4. Prenda os cabelos longos para se evitar acidentes durante a utilização do bico de


Bunsen e contaminação dos materiais de trabalho;

5. Não coma, beba, fume ou leve qualquer objeto à boca durante a permanência no
laboratório;

6. Lave as mãos antes e após o trabalho prático, aplicando uma solução antisséptica (p.
ex. álcool 70 %), após o procedimento de lavagem;

7. Deixe somente os materiais indispensáveis à execução do trabalho prático sobre a


bancada;

8. Limpe a bancada com solução desinfetante (p. ex. álcool 70 %) antes e após cada
trabalho prático;

9. Culturas e reagentes não devem ser pipetados com a boca, utilize sempre pipetador;

10. Nunca coloque pipetas, alças de inoculação ou qualquer outro material contaminado
sobre a bancada. Flambe a alça de inoculação antes e após o uso. Pipetas ou ponteiras
utilizadas devem ser depositadas em recipientes apropriados com solução desinfetante;

11. Mantenha as culturas tampadas e apoiadas num suporte enquanto não estiverem em
uso;

12. Limpe imediatamente qualquer respingo sobre a bancada, primeiro com papel
toalha, depois com solução desinfetante. No caso de contato da pele com materiais
contaminados, faça, imediatamente, a antissepsia da área afetada;

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13. Notifique, imediatamente, quaisquer anormalidades e acidentes, como quedas,


quebra de materiais ou equipamentos, cortes, queimaduras, etc. para as devidas
providências;

14. Procure deixar a sua bancada sempre limpa e organizada ao final da aula;

15. Culturas viáveis de micro-organismos e qualquer material que venha a ter contato
com células vivas devem ser submetidos a um procedimento de descontaminação
(esterilização) antes de serem descartados no ambiente ou serem lavados para posterior
reutilização.

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Preparo e esterilização de meios de culturas

I. INTRODUÇÃO

presentes, enquanto o meio seletivo


Para realização do cultivo de inibe o crescimento de determinadas
micro-organismos em laboratório espécies, permitindo somente o
(cultivo in vitro) é necessário à crescimento da população desejada.
utilização de um meio propício para seu Quanto à consistência, os meios
crescimento. Os meios de cultura devem de cultura podem ser líquidos (caldos),
proporcionar todos os elementos que sólidos ou semi-sólidos. As preparações
compõem a célula (C, N, S, P,....), e a líquidas são utilizadas em estudos de
sua composição depende da espécie crescimento, em processos de
microbiana que se deseja cultivar. fermentação e na produção de biomassa
Existem meios complexos ou naturais, microbiana; os meios sólidos são
nos quais a composição química não é empregados na contagem, isolamento e
completamente conhecida. Já os meios manutenção de culturas de micro-
sintéticos são preparados a partir de organismos e os meios semi-sólidos são
componentes químicos puros, orgânicos utilizados para a detecção de placas de
e inorgânicos em quantidades definidas. lise em culturas bacterianas infectadas
Dependendo de sua composição por vírus e em estudos de micro-
ou função, os meios de cultura recebem organismos microaerofílicos. O
denominações específicas. O meio principal agente solidificante utilizado
mínimo (MM) é um meio que fornece em microbiologia é o agar, um
somente os nutrientes essenciais ao polissacarídeo derivado de algas que
desenvolvimento do micro-organismo; possui a propriedade de fundir a 96 °C e
os meios diferenciais permitem solidificar a 45 °C. O meio, uma vez
diferenciar as espécies microbianas com sólido é capaz de suportar temperaturas
base em características fenotípicas; o mais elevadas de incubação.
meio de enriquecimento favorece o Para serem utilizados no
crescimento de uma determinada laboratório, os meios de cultura, bem
espécie microbiana em relação a outras como todo o material que entrará em
espécies que porventura possam estar contato com as culturas microbianas,

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deverão estar estéreis. Esterilização é o Nessa aula prática, teremos


processo pelo qual se eliminam todas as oportunidade de preparar meios de
formas vivas presentes em um material cultura líquidos e sólidos e esterilizá-los
ou ambiente. A esterilização de meios em autoclave. O método de esterilização
de culturas e materiais utilizados na de soluções contendo substâncias
rotina microbiológica pode ser realizada termolábeis por filtração também será
pelo calor úmido (autoclave), calor seco demonstrado. Além disso, serão
(estufa) ou por filtração. A escolha de preparados materiais (ponteiras,
um ou outro método de esterilização eppendorffs, etc), e também será
depende basicamente do tipo de demonstrado o procedimento de
material a ser esterilizado, levando-se descontaminação e descarte de resíduos
em consideração ainda fatores como contaminados.
tempo, custo, segurança e equipamentos
disponíveis.

II. OBJETIVOS
1. Preparar os meios de cultura: caldo LST, EC e agar padrão;
2. Executar esterilização dos meios em autoclave (calor úmido);
3. Observar outra forma de esterilização (filtração);
4. Demonstrar o procedimento de descontaminação e descarte de resíduos
contaminados.

III. MATERIAL
Reagentes: caldo LST, EC e Agar padrão.
Equipamentos e utensílios: espátulas, vidrarias (pipetas, provetas, béqueres,
erlenmeyers), filtro Millipore, balança, autoclave, lamparina.

IV. PROCEDIMENTOS
A. Preparo dos meios de cultura

Preparo do Agar padrão

1. Pesar 1,75 g de meio de cultura Agar padrão em um becker, e adicionar 100 ml de


água destilada;

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2. Avalie o pH do meio utilizando fitas de papel indicador ou potenciômetro. Ajuste o


pH do meio para aproximadamente 6,8-7,0, adicionando NaOH ou HCl 0,1 molar;

Preparo do meio LST

1. Pesar 3,56 g do meio LST em um becker, e adicionar 100 ml de água destilada;


2. Avalie o pH do meio utilizando fitas de papel indicador ou potenciômetro. Ajuste o
pH do meio para aproximadamente 6,8-7,0, adicionando NaOH ou HCl 0,1 molar.

Preparo do meio EC

1. Pesar 3,7 g do meio LST em um becker, e adicionar 100 ml de água destilada;


2. Avalie o pH do meio utilizando fitas de papel indicador ou potenciômetro. Ajuste o
pH do meio para aproximadamente 6,8-7,0, adicionando NaOH ou HCl 0,1 molar.

B. Preparo de material novo para cultivo de micro-organismos

Observe a demonstração dada pela professora quanto ao preparo de ponteiras,


eppendorffs, pipetas de vidro e placas de petri para esterilização.

C. Esterilização dos meios de cultura

1. Complete o nível de água da autoclave;

2. Introduza o material a ser esterilizado;

3. Feche a autoclave conforme recomendação do fabricante;

4. Inicie o aquecimento;

5. Abra a válvula de equalização para remoção de ar, o que se garante deixando o vapor
sair continuamente por 5 minutos. Desse modo, obtém-se uma atmosfera saturada de
vapor de água no interior da câmara de esterilização;

6. Feche a válvula de equalização;

7. Verifique pelo manômetro a elevação da pressão da autoclave. Após atingir 15


Ib/pol2 (1 atm), comece a contar o tempo de esterilização que, nesse caso, será de 15
minutos;

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8. Terminado o tempo de esterilização, desligue o aquecimento e espere a autoclave


esfriar até que o manômetro alcance o valor zero. Abra a tampa da autoclave. Os meios
que contêm agar devem ser preferencialmente vertidos em placas de Petri estéreis, em
capela de fluxo laminar, logo após serem retirados da autoclave, evitando a sua
solidificação no erlenmeyer.

D. Outros métodos de esterilização

Observe a demonstração dada pela professora quanto ao uso de membranas


filtrantes, bico de bunsen e lamparina.

E. Procedimentos de descontaminação e descarte de resíduos contaminados

Neste procedimento a professora mostrar procedimentos de descontaminação de


materiais contaminados com micro-organimos e descarte de meios de culturas
contaminados e de alguns materiais plásticos descartáveis.

V. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. PELCZAR, M., CHAN, E. C. S., KRIEG, N. R. Microbiologia, Conceitos e
Aplicações. São Paulo. Makron Book do Brasil, 1996, v.1, 524p.

SEELEY, Jr, H. W., VanDEMRK, P. J. Microbes in Action. A laboratory manual of


Microbiology. Freeman, 1981, 385p.

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Análise Microbiológica de Alimentos: Contagem de Colônias em Placas

I. INTRODUÇÃO
(2) no método de mistura em
A contagem de colônias em
agar (pour plate), a alíquota de até 1 mL
placas é o método convencional mais é depositada na placa esterilizada e
comum de determinar o número de vazia, o meio de cultura com agar,
micro-organismos. Baseia-se no fundido e mantido a 45 °C, é vertido
pressuposto teórico de que uma célula sobre ela e misturado. A incubação das
microbiana ou um grupo de células placas invertidas é iniciada após a
viáveis (Unidades Formadoras de solidificação do meio. Após o tempo
Colônias – UFC) dá origem a uma adequado de incubação, as colônias são
colônia que se desenvolve na superfície contadas. Para computar o número final
ou no meio do agar na placa de Petri. de micro-organismos por mL ou por
Para garantir a contagem, a amostra grama de alimento, considera-se
original precisa ser corretamente alíquota e a diluição usada.
diluída, semeada nas placas e incubada A contagem de colônias em
por um tempo determinado. A placas pode ser adaptada para diversos
composição do meio, suas propósitos. Sua utilidade depende de se
características (ex. pH) e as condições definirem os meios e condições de
de incubação (temperatura, tensão de incubação para permitir crescimento dos
O2) determinam os micro-organismos micro-organismos visados. A contagem
que irão se desenvolver e formar de bactérias mesófilas aeróbias em
colônias. placas é tomada como padrão higiênico
Duas técnicas são comumente para muitos alimentos. O método a ser
usadas para contagem de colônias de utilizado hoje é o de contagem padrão
micro-organismos em alimentos. (1) No em placas, onde é detectado o número
método de semeadura em superfície de bactérias aeróbias ou anaeróbias
(spread plate) uma alíquota de 0,1 mL facultativas e mesófilas presentes tanto
de uma diluição é espalhada com alça sob forma vegetativa quanto esporulada.
de Drigalsky sobre a superfície do meio
com agar e a placa é incubada invertida;

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II. OBJETIVOS
- Introduzir métodos de contagem de colônias em agar.

III. MATERIAL
Amostra de alimentos:
Meios e soluções: etanol 70 %, tubos e erlemneyers com solução salina 0,85 %, tubos e
placas com agar padrão para contagem em placa (PCA).
Utensílios e equipamentos: lamparina, pipetador automático, pipetas de vidro, alça de
Drigalsky, bisturi ou faca estéril.

IV. PROCEDIMENTO
1. Usar técnica asséptica durante procedimentos de manuseio do alimento;

2. Desinfetar a superfície de trabalho com 70 % de etanol;

3. Antes de abrir qualquer embalagem, limpar a área em volta do local de onde será
retirada a amostra, usando etanol 70 %;

4. Alimentos líquidos e semi-líquidos devem ser homogeneizados invertendo ou


agitando a embalagem rapidamente 25 vezes. Retirar a alíquota a ser analisada 2,5 cm
abaixo da superfície;

5. Amostras desidratadas devem ser misturadas assepticamente com uma colher


esterilizada.

6. Sólidos e semi-sólidos devem ser pesados (25g) e diluídos em 225 ml de solução


salina 0,85 %. Homogeneizar por 2 minutos.

Diluição

Proceder a diluição da amostra e o plaqueamento, simultaneamente. Tomar o


cuidado de homogeneizar as diluições, agitando o frasco 25 vezes em 7 segundos.

Método de Superfície (Spread plate)

1. Marcar as placas contendo agar PCA com a identificação da amostra e a diluição a


ser plaqueada;

2. Transferir 0,1 ml de cada diluição para placa contendo agar padrão para contagem
(PCA) e previamente identificas;
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3. Espalhar a amostra sobre a superfície da placa com uma alça de Drigalsky flambada
em álcool. Flambar a alça novamente antes de espalhar a diluição seguinte. Começar da
diluição mais elevada. Deixar a placa pelo menos 15 minutos;

4. Incubar as placas, invertidas, a 35 °C por 48 horas;

5. Contar as colônias conforme normas dadas.

Método Pour Plate

1. Marcar as placas com a identificação da amostra e a diluição a ser plaqueada;

2. Usar uma pipeta para a transferência, de 1 ml de cada diluição para as placas;

3. Verter o agar (15 mL) liquefeito, a 45 °C, em cada placa, assepticamente. Mover a
placa sobre a bancada, em rotação no sentido horário e, em seguida anti-horário, com
cuidado de não espalhar o meio nas bordas da placa. Deixar solidificar.

V. RESULTADOS

1. Contagens de micro-organismos pelo método “Pour plate”.

Diluição

Duplicata 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Média

UFC/ ml ou g

2. Contagem de micro-organismos pelo método “Spread plate”.

Diluição

Duplicata 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Média

UFC/ ml ou g

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VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


1. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION – APHA. Compendium of
methods for the microbiological examination of foods. 3 ed. Washington: 1992.

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Análise microbiológica de alimentos: Técnica do Número Mais Provável

I. INTRODUÇÃO (NMP/g), entre um limite inferior e um


limite superior de confiabilidade.
Outro método convencional Ao contrário do método de

muito utilizado em microbiologia de contagem em placas, o NMP não

alimentos é a técnica do Número Mais fornece uma medida direta da

Provável (NMP). A técnica do NMP é população microbiana. É também mais

utilizada na análise microbiológica de variável que a contagem de colônias em

alimentos para estimar a população de placa. O resultado obtido é apenas uma

certos tipos de micro-organismos, como estimativa da densidade de micro-

coliformes totais, coliformes fecais, organismos viáveis na amostra. Parte-se

Escherichia coli, Staphylococcus da premissa que os micro-organismos a

aureus, Vibrio parahaemolyticus, serem contados estão distribuídos ao

salmonelas e estreptococos. No entanto, acaso pela amostra. A precisão do

pode ser adaptada para qualquer tipo de método pode ser melhorada com o

micro-organismo. Por esta técnica, a aumento do número de tubos em cada

amostra a ser analisada é diluição. Deve-se levar em conta

homogeneizada e submetida a diluições também que quanto maior for o número

seriadas. Alíquotas dessas diluições são esperado do micro-organismo

transferidas para o meio de cultura pesquisado, maiores deverão ser as

indicado para o micro-organismo diluições usadas. É uma técnica

desejado. Após incubação, é verificado especialmente útil quando se trata de

o número de tubos que apresentam contar organismo em número baixo por

resultado positivo em cada diluição. Os grama de alimento. Uma vez que o

valores obtidos são transpostos para método fornece apenas uma estimativa,

uma tabela que fornece o número mais a confirmação da presença do micro-

provável do micro-organismo organismo procurado deve ser feita em

pesquisado por grama de amostra meio seletivo.

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II. OBJETIVOS
1. Demonstrar a aplicação da técnica do NMP na análise microbiológica dos alimentos;
2. Discutir a validade dessa técnica em comparação com contagem em placas;
3. Demonstrar o uso dessa técnica na pesquisa de coliformes.

III. MATERIAIS
Amostras de alimentos:
Meios e soluções: etanol 70 %, tubos e erlemneyers com salina 0,85 %, tubos com
caldo LST e EC;
Utensílios e equipamentos: lamparina, pipetador automático, pipetas estéreis, bisturi
ou faca estéril, estufa a 35 °C e 45 °C.

IV. PROCEDIMENTOS
Preparo da amostra
1. Usar técnica asséptica durante procedimentos de manuseio do alimento;

2. Desinfetar a superfície de trabalho com 70 % de etanol;

3. Antes de abrir qualquer embalagem, limpar a área em volta do local de onde será
retirada a amostra, usando etanol 70 %;

4. Alimentos líquidos e semi-líquidos devem ser homogeneizados invertendo ou


agitando a embalagem rapidamente 25 vezes. Retirar a alíquota a ser analisada 2,5 cm
abaixo da superfície;

5. Amostras desidratadas devem ser misturadas assepticamente com uma colher


esterilizada.

6. Sólidos e semi-sólidos devem ser pesados (25g) e diluídos em 225 ml de solução


salina 0,85 %. Homogeneizar em “stomacher” por 2 minutos.

Diluição

Proceder a diluição da amostra e o plaqueamento simultaneamente. Tomar o


cuidado de homogeneizar as diluições, agitando o frasco 25 vezes em 7 segundos.

NMP de Coliformes (teste presuntivo)

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1. Inocular três séries de três tubos com caldo LST (lauril sulfato triptose) e os tubos
invertidos (de Durhan) utilizando porções de 1 ml de cada uma das diluições preparadas
anteriormente;

2. Incubar a 35 + 1 °C por 24 a 48 horas;

3. Observar os tubos positivos (produção de gás nos tubos de Durhan) após 24 horas;
incubar novamente os tubos negativos por mais 24 horas e anotar o resultado final;

4. Comparar os valores obtidos com a tabela de NMP para diluições em séries de três
tubos e expressar o resultado como NMP presuntivo de coliformes / g ou ml.

NMP de Coliformes a 45 °C

1. Com o auxílio da alça de platina, transferir uma alíquota dos tubos positivos de LST
(produção de gás em 48 horas) para caldo EC (E. coli);

2. Incubar a 45 °C por 24 a 48 horas em estufa;

3. Observar os tubos positivos (produção de gás nos tubos de Durhan);

4. Calcular o NMP usando a tabela para diluições em séries de três tubos e expressar o
resultado como NMP de coliformes termotolerantes / g ou ml do alimento.

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V. RESULTADOS
1. Número Mais Provável (NMP) presuntivo de coliformes a 35 °C – caldo LST.

N° de tubos positivos em série de 3

Amostra Diluição NMP / g

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

2. Número Mais Provável (NMP) de coliformes termotolerantes a 45 °C – caldo EC.

N° de tubos positivos em série de 3

Amostra Diluição NMP / g

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

VI. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS

1. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION – APHA. Compendium of methos


for the microbiological examination of foods. 3 ed. Washington: 1992.

2. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA INSTRUÇÃO NORMATIVA N° 62 DE – 26


DE AGOSTO DE 2003.

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Análise microbiológica de alimentos: Isolamento de bolores e leveduras

I. INTRODUÇÃO

mesófilas (35-37°C) e raramente nas


Os bolores e leveduras
temperaturas de bactérias
constituem um grande grupo de micro- termotolerantes (45°C). Seu
organismos, a maioria originária do solo crescimento não é incomum sob
ou do ar. Os bolores são extremamente condições de refrigeração (5°C), porém
versáteis, a maioria das espécies é capaz abaixo de 10 °C negativos podem ser
de assimilar qualquer fonte de carbono considerados microbiologicamente
derivada de alimentos. Já as leveduras, estáveis.
de maneira geral, são mais exigentes do Os bolores deteriorantes de
que bolores. alimentos, como quase todos os outros
Os bolores e leveduras são fungos filamentosos, exigem oxigênio
também bastante resistentes à condições para crescimento, podendo ser
adversas, como pH ácido e atividade de considerados aeróbios estritos. No
água baixa. Com relação ao pH, os entanto, várias espécies, são eficientes
fungos são muito pouco afetados pela em utilizar pequenas quantidades de
variação na faixa de 3,0 a 8,0. Vários oxigênio, de forma que o efeito do O2 é
bolores crescem abaixo de 2,0 e dependente da quantidade absoluta
diversas leveduras abaixo de 1,5. dissolvida no substrato, e não da
Entretanto, quando o pH afasta-se do concentração presente na atmosfera. Ao
ótimo (geralmente próximo de 5,0) a contrário dos bolores, muitas espécies
velocidade de crescimento diminui e, se de leveduras são capazes de crescer na
houver outros fatores de inibição completa ausência de O2 e em diferentes
(atividade de água, temperatura, etc), concentrações de CO2. Isso as torna os
seu efeito restritivo sobre a velocidade deteriorantes mais comuns de alimentos
de crescimento torna-se mais acentuado. líquidos engarrafados, nos quais o
A temperatura ótima de crescimento dos bolores é limitado pela
crescimento da maioria dos fungos disponibilidade de oxigênio.
encontra-se na faixa de 25 a 28 °C, não A quantificação de bolores e
crescendo bem nas temperaturas leveduras em alimentos é feita pelo

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método de contagem padrão em placa, Ágar Extrato de Levedura Glicose


determinando-se o número de Unidades Cloranfenicol (YEGC) para amostras
Formadoras de Colônias (UFC). O com predomínio de leveduras ou com
método mais recomendado é o leveduras injuriadas pelo
plaqueamento em superfície, para processamento. Nesses produtos o
aumentar a exposição ao oxigênio e DRBC recupera menos leveduras do
evitar o estresse causado pelo meio de que o YEGC. Para produtos não
cultura quente. Vários meios de cultura submetidos a tratamento térmico,
podem ser utilizados: (1) Ágar Dicloran acidificação ou outro tratamento que
Rosa de Bengala Cloranfenicol possa provocar injúrias às células, pode
(DRBC), para alimentos com atividade também ser utilizado Ágar Batata
de água superior a 0,95 e (2) Ágar Dextrose Acidificado (PDA-AC),
Dicloran Glicerol 18 (DG18), para porém, algumas bactérias podem
alimentos com atividade de água menor crescer neste meio.
ou igual a 0,95. O DRBC contém Outros métodos já oficializados
cloranfenicol, para inibir bactérias, além pela AOAC (Association of Official
de dicloran e rosa de bengala, para Analytical Chemists) são os “kits
restringir o espalhamento da colônia. O rápidos” analíticos como: (1) Petrifilm
DG18, além de cloranfenicol e dicloran, Yeast and Mold Count Plate (3M
contém também glicerol, que reduz a Microbiology Products) para análise de
atividade de água do meio. alimentos; (2) SimPlate Yeast and Mold
O Standard Methods for the Color Indicator (YM-CI) (BioControl
Examination of Dairy Products (Frank Systems Inc.) para análise de alimentos,
& Yousef, 2004) recomenda o DRBC ingredientes e amostras ambientais.
para produtos lácteos em geral e o (3)

II. OBJETIVO

Analisar a presença de bolores e leveduras em alimento.

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III. MATERIAIS
Meios de cultura e soluções: Ágar Batata Dextrose Acidificado (PDA-AC) em placas
de Petri; tubos com 9 mL de salina 0,85 %, frascos com 225 mL de salina 0,85 %.
Utensílios e equipamentos: lamparina, pipetas, ponteiras estéreis, estufa a 25 °C, alça
de Drigalski.
Alimento:

IV. PROCEDIMENTO
1. Usar técnica asséptica durante procedimentos de manuseio do alimento;

2. Desinfetar a superfície de trabalho com 70 % de etanol;

3. Antes de abrir qualquer embalagem, limpar a área em volta do local de onde será
retirada a amostra, usando etanol 70 %;

4. Alimentos líquidos e semi-líquidos devem ser homogeneizados invertendo ou


agitando a embalagem rapidamente 25 vezes. Retirar a alíquota a ser analisada 2,5 cm
abaixo da superfície;

5. Amostras desidratadas devem ser misturadas assepticamente com uma colher


esterilizada.

6. Sólidos e semi-sólidos devem ser pesados (25g) e diluídos em 225 ml de solução


salina 0,85 %. Homogeneizar por 2 minutos.

Diluição da amostra de alimento

Proceder a diluição da amostra e o plaqueamento, simultaneamente. Realizar


diluições decimais seriadas. Tomar o cuidado de homogeneizar as diluições, agitando o
frasco 25 vezes em 7 segundos.

Método de Superfície (Spread plate)

1. Marcar as placas contendo PDA-AC com a identificação da amostra e a diluição a ser


plaqueada;

2. Transferir 0,1 ml de cada diluição para placas contendo PDA-AC;

3. Espalhar a amostra sobre a superfície da placa com uma alça de Drigalsky flambada
em álcool. Flambar a alça novamente antes de espalhar a diluição seguinte. Começar da
diluição mais elevada. Deixar a placa pelo menos 15 minutos;
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4. Incubar as placas, invertidas, a 25 °C por 5 dias;

5. Selecionar colônias de bolores e leveduras.

V. RESULTADOS

1. Contagem total de bolores e leveduras.

Diluição

Duplicata 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Média

UFC/ ml ou g

VI. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

1. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION – APHA. Compendium of


methods for the microbiological examination of foods. 3 ed. Washington: 1992.

2. SILVA, N. ; JUNQUEIRA, V. A.; SILVEIRA, N. F. A.; TANIWAKI, M. H.;


SANTOS, R. F. S.; GOMES, R. A. R. Manual de Métodos de análise Microbiológica de
Alimentos e Água, 4ª edição, 2010.

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Análise microbiológica de alimentos: Isolamento de Staphylococcus aureus

I. INTRODUÇÃO

Baird-Parker que contém gema de ovo


Staphylococcus aureus são
formando um halo claro ao redor da
bactérias em forma de cocos Gram colônia. Já o telurito de potássio é
positivos, que ocorrem em arranjo tipo reduzido formando colônias negras.
cacho-de-uva, quando vistas ao Certos tipos de S. aureus
microscópio. São anaeróbias produzem enterotoxinas que causam
facultativas, com maior crescimento sob intoxicação alimentar. Dentre as razões
condições aeróbias, quando produzem para o exame de S. aureus em
catalase. Produzem também as enzimas alimentos, estão as seguintes: confirmar
coagulase e termonuclease. Crescem em se este micro-organismo é o agente
concentrações de até 15 % de NaCl. A causador de uma intoxicação alimentar;
maioria das estirpes cresce bem entre 10 determinar se um alimento ou
e 45 °C (ótimo: 30 a 37 °C) e em ingrediente é uma fonte potencial de
valores de pH entre 4,2 e 9,3 (ótimo: 7,0 estafilococos enterotoxigênicos;
a 7,5). demonstrar contaminação pós-
Os meios de cultura para S. processamento que, frequentemente, é
aureus geralmente empregam em razão do contato humano com
substâncias inibitórias para a microbiota alimentos processados ou exposição do
acompanhante, dada a sua baixa alimento a superfícies de processamento
competitividade. Em meio líquido para inadequadamente sanitizadas.
enriquecimento, geralmente adicionam-
se 10 % de NaCl, mais uma combinação
de outras substâncias inibitórias como
telurito de potássio, cloreto de lítio,
glicina, dentre outras. O meio sólido
mais utilizado para isolamento é o agar

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II. OBJETIVOS
Isolar S. aureus em amostra de alimento.

III. MATERIAIS
Meios de cultura: agar Baird-Parker em placas de Petri;
Utensílios e equipamentos: lamparina, pipetas, ponteiras estéreis, estufa a 35 °C, alça
de Drigalski, alça de inoculação.
Alimento:

IV. PROCEDIMENTO
1. Usar técnica asséptica durante procedimentos de manuseio do alimento;

2. Desinfetar a superfície de trabalho com 70 % de etanol;

3. Antes de abrir qualquer embalagem, limpar a área em volta do local de onde será
retirada a amostra, usando etanol 70 %;

4. Alimentos líquidos e semi-líquidos devem ser homogeneizados invertendo ou


agitando a embalagem rapidamente 25 vezes. Retirar a alíquota a ser analisada 2,5 cm
abaixo da superfície;

5. Amostras desidratadas devem ser misturadas assepticamente com uma colher


esterilizada.

6. Sólidos e semi-sólidos devem ser pesados (25g) e diluídos em 225 ml de solução


salina 0,85 %. Homogeneizar por 2 minutos.

Isolamento de Staphylococcus aureus


Diluição

Proceder a diluição da amostra e o plaqueamento, simultaneamente. Tomar o


cuidado de homogeneizar as diluições, agitando o frasco 25 vezes em 7 segundos.

Método de Superfície (Spread plate)

1. Marcar as placas contendo agar Baird-Parker com a identificação da amostra e a


diluição a ser plaqueada;

2. Transferir 0,1 ml de cada diluição para placas contendo agar Baird-Parker;

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3. Espalhar a amostra sobre a superfície da placa com uma alça de Drigalsky flambada
em álcool. Flambar a alça novamente antes de espalhar a diluição seguinte. Começar da
diluição mais elevada. Deixar a placa pelo menos 15 minutos;

4. Incubar as placas, invertidas, a 35 °C por 48 horas;

5. Selecionar colônias negras, brilhantes, com anel opaco, rodeadas por um halo claro
transparente.

V. RESULTADOS
1. No espaço abaixo desenhe o aspecto da colônia típica de S. aureus.

VI. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

1. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION – APHA. Compendium of


methods for the microbiological examination of foods. 3 ed. Washington: 1992.

2. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA INSTRUÇÃO NORMATIVA N° 62 DE – 26


DE AGOSTO DE 2003.

3. MINISTÉRIO DA SAÚDE. RESOLUÇÃO – RDC N° 12, DE 2 DE JANEIRO DE


2001.

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Avaliação da Contaminação de Superfícies, Ambientes e Manipuladores

I. INTRODUÇÃO

organismos no alimento a mais baixa


A microbiota presente em um possível. Procedimentos dessa natureza
alimento consiste de micro-organismos resultarão em um alimento de vida útil
associados com a matéria-prima, maior, além de reduzir o risco de
daqueles adquiridos durante a intoxicações e infecções alimentares e
manipulação e processamento e dos que de permitir uma maior eliminação de
sobreviveram às etapas de micro-organismos pelas técnicas de
processamento e estocagem do produto. conservação de alimentos.
O estabelecimento das fontes de A avaliação e o controle da
contaminação de um alimento é contaminação de ambientes,
importante para que se possa exercer equipamentos e manipuladores permite
um controle sobre essa contaminação e a adoção de medidas corretivas para
manter a população de micro- minimizar a contaminação de alimentos.

II. OBJETIVO
Demonstrar métodos de coleta de amostras para análise microbiológica de
equipamentos, superfícies, manipuladores e ambientes.

III. MATERIAIS
Meios de cultura e soluções: Agar padrão para contagem (PCA) e tubos com solução
salina 0,85 % tamponada.
Utensílios e Equipamentos: swabs esterilizados, moldes de 100 cm2 esterilizados,
tesoura, agitador de tubos, lamparina, pipetador.

IV. PROCEDIMENTO
1. Retirar um swab esterilizado, segurando-o com o cuidado de não tocar qualquer parte
que venha a ter contato com a solução tamponada;
2. Abrir, assepticamente, o tubo com solução salina. Umedecer o algodão e pressioná-lo
contra a parede do tubo drenando o excesso de líquido;

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3. Esfregar o swab, lenta e firmemente, três vezes sobre a superfície conforme


relacionado abaixo:
a. Utensílios de uso individual – toda a superfície que entra em contato com o alimento
ou que é levada à boca dos usuários;
b. Grandes utensílios ou superfícies de trabalho – 5 áreas de 100 cm2;
4. Voltar o swab para o tubo com solução tamponada e agitar com movimentos
rotatórios. Retirar o excesso de líquido pressionando o algodão contra a parede do tubo;
5. Repetir a operação, com o mesmo swab, em 4 outras faixas, de 50 cm2, no caso de
grandes utensílios e superfícies, e no caso de utensílios individuais, 3 outros retirados
aleatoriamente de um lote;
6. Cortar o swab com tesoura sanificada em álcool e flambada, deixando o algodão no
interior do tubo com a solução salina;
7. Agitar vigorosamente por 10 segundos;
8. Colocar 0,1 em placas de Petri, em duplicata;
9. Espalhar a alíquota com a alça de Drigalsky ; Incubar a 35 + 2°C;
10. Para a avaliação da contaminação de ambientes pela técnica de sedimentação, expor
uma placa de Petri, contendo agar PCA aberta, por 15 minutos. Fechar e incubar a
35+2°C;
11. A amostragem de mãos de manipuladores deverá ser feita com o swab, percorrendo
toda a extensão da palma e dorso da mão e entre os dedos por 3 vezes.

V. RESULTADOS
1. Contagem de colônias em placas.

Amostra Diluição
10- UFC 10- UFC

VI. INTERPRETAÇÃO
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• Para superfícies que tiverem 5 áreas de 50 cm2 amostradas, a contagem residual


de bactérias não deve exceder 500 (média de 2 UFC por cm2).
• Para utensílios de uso individual e outros, considera-se aceitável até o nível de
100 UFC por utensílios.

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


1. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION – APHA. Compendium of
methods for the microbiological examination of foods. 3 ed. Washington: 1992.

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Procedimentos de higienização de hortaliças

I. INTRODUÇÃO

de ocorrência de doenças transmitidas


As hortaliças podem ser
por alimentos.
veículos potenciais de micro- Dentre os produtos permitidos
organismos patogênicos, constituindo para desinfecção dos alimentos, está o
um importante grupo de produtos hipoclorito de sódio ou cálcio a 2,0 –
envolvidos em doenças transmitidas por 2,5% e cloro orgânico, que são
alimentos. A lavagem e a desinfecção utilizados em concentrações variando de
são etapas consideradas críticas e 100 a 250 ppm. Tais produtos devem
fundamentais para a qualidade e estar regularizados no órgão competente
segurança microbiológica dos vegetais do Ministério da Saúde, além disso,
consumidos crus. A qualidade da devem ser aplicados de forma a evitar a
higienização das hortaliças depende da presença de resíduos no alimento
atividade do sanificante e de fatores tais preparado.
como concentração, solubilidade e A forma tradicional de
quantidades de micro-organismos higienização dos alimentos compreende
presentes na matéria prima. a lavagem com água corrente seguida de
Diversos fatores de risco, como imersão em solução de 200 ppm de
a contaminação cruzada, a higienização hipoclorito de sódio e enxágüe para
mal feita, o tempo de espera para o remover as sujidades remanescentes e
consumo e a temperatura em que o resíduos do produto químico, pois este é
alimento se encontra, podem permitir precursor de tri-halometanos, que
que o micro-organismo se multiplique quando em contato com matéria
até atingir doses infectantes. Portanto, orgânica, possui capacidade residual.
quanto menor o número de micro-
organismos após a higienização e
desinfecção, menor será a possibilidade

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II. OBJETIVOS
Verificar pelo método microbiológico a diferença entre limpeza e desinfecção de
hortaliças.

III. MATERIAIS
Amostra: hortaliça

Meios de cultura e reagentes: LST (lauril sulfato triptose), salina 0,85 %, solução de
hipoclorito de sódio ou cálcio (2 – 2,5 %), e pastilha.

Utensílios e equipamentos: lamparina, balança, pipetador, pipetas autoclavadas, tubos


de rosca, frasco de vidro, tubos de durhan, estufa regulada a 35 °C e a 45 °C.

IV. PROCEDIMENTO

Higienização da hortaliça

A hortaliça será submetida a três procedimentos de higienização:


Procedimento A: lavagem com água corrente (controle);

Procedimento B: lavagem com água corrente; higienização com hipoclorito de sódio ou


cálcio (200 ppm) por 15 minutos; enxágue;

Procedimento C: lavagem com água corrente; higienização com pastilha; enxágue.

Preparo da amostra

1. Antes de abrir a embalagem do folhoso, limpe a área externa com álcool 70% para a
remoção dos contaminantes que possam estar ali presentes;
2. A hortaliça deve ser “desfolhada”. Selecionar folhas para homogeneização
contemplando folhas externas e centrais;
3. Utilizando luvas estéreis abra a embalagem e retire assepticamente, com auxílio de
uma espátula/colher estéril, aproximadamente, 25 gramas que sejam representativos
da amostra, ou seja, coletando diversas partes do alimento e insira no frasco
contendo 225 mL de salina 0,85 %;
4. Homogeneizar a amostra por, aproximadamente, 30 segundos, agitando suavemente
o frasco. Essa é a diluição 10-1;

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5. Transferir 1 mL dessa solução, com auxílio de pipeta, para um tubo de ensaio


contendo 9 mL de salina 0,85 % estéril e agitar suavemente (diluição 10-2);
6. Repetir o procedimento anterior, transferindo 1 mL da diluição 10-2 para 9 mL de
água peptonada (0,1%) estéril e agitar (diluição 10-3).

NMP de Coliformes (teste presuntivo)


1. Inocular três séries de três tubos com caldo LST (lauril sulfato triptose) e os tubos
invertidos (de Durhan) utilizando porções de 1 ml de cada uma das diluições preparadas
anteriormente;
2. Incubar a 36 + 1 °C por 24 a 48 horas;
3. Observar os tubos positivos (produção de gás nos tubos de Durhan) após 24 horas;
incubar novamente os tubos negativos por mais 24 horas e anotar o resultado final.
4. Comparar os valores obtidos com a tabela de NMP para diluições em séries de três
tubos e expressar o resultado como NMP presuntivo de coliformes / g ou ml.

V. RESULTADOS
1. Número Mais Provável (NMP) presuntivo de coliformes a 35 °C – caldo LST.

N° de tubos positivos em série de 3 NMP / g

Amostra

Diluição

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

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VI. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS

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2. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA INSTRUÇÃO NORMATIVA N° 62 DE – 26


DE AGOSTO DE 2003.

3. MINISTÉRIO DA SAÚDE. RESOLUÇÃO – RDC N° 12, DE 2 DE JANEIRO DE


2001.

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