Quantificação de Proteínas Por Espetrofotometria

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS POR ESPETROFOTOMETRIA
A ESPETROFOTOMETRIA
A espetrofotometria permite tirar conclusões sobre:
 a natureza e composição de uma amostra desconhecida;

 determinar a concentração de uma substância conhecida;
Todas as substâncias absorvem energia radiante, isto é, radiações eletromagnéticas.

Mesmo materiais que são considerados transparentes para a vista humana, ou seja, que não
absorvem luz visível, têm espetro de absorção.
 no ultravioleta (UV) – exemplo: vidro

 no infravermelho – exemplo: água.
A absorção de energia por uma molécula ocorre aquando da transição de um eletrão de um nível de
energia mais baixo para um mais elevado. Antes que outro fotão possa ser absorvido, o estado
excitado deve perder esta energia e reverter ao estado de energia inicial.
As moléculas podem absorver também radiação eletromagnética durante transições entre os seus
estados de vibração e/ou rotacionais.
O ESPETROFOTÓMETRO
O espetrofotómetro é um aparelho concebido para medir a quantidade de energia radiante
absorvida por uma amostra/substância.
(A maioria dos espetrofotómetros é usada nas regiões UV e visível do espetro eletromagnético,
sendo que alguns espetrofotómetros também operam na região do infravermelho.)
Componentes básicos de um espetrofotómetro de ultravioleta-visível:
 Lâmpada: uma fonte de luz policromática, normalmente de tungsténio, para comprimentos

de onda na gama do visível (entre 350-900 nm), ou de deutério, para a região dos UV (200-
400 nm).
 Monocromador: um prisma que decompõe a luz e um filtro ótico que permite selecionar os
comprimentos de onda desejados.
 Cuvete: um compartimento para alojar a amostra.
 Detetor: normalmente um tubo fotoelétrico ou um díodo de silicone, que mede a intensidade
de luz transmitida pela amostra.
RAZÃO DA INTENSIDADE DA LUZ DE UMA SOLUÇÃO
A razão entre a intensidade de luz transmitida uma solução colocada no espetrofotómetro, depois de
o atravessar.
It I0
T=
I0
A=log 10 ()
It
=−log 10 T
Legenda:
I t - intensidade de luz na ausência de amostra
I 0- transmitância (𝑻).
log10 da razão inversa de 𝑻- absorvância (𝑨)
TRANSMITÂNCIA
A transmitância pode ter um valor entre 0 e 1.
Normalmente indicada como uma percentagem. (multiplicada por 100)
ABSORVÂNCIA
A absorbância traduz a quantidade de luz absorvida pela substância em solução.
LEIS DA ABSORÇÃO
 LEI DE LAMBERT
Para uma concentração baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz
considerado.
A absorbância da solução é diretamente proporcional à espessura do compartimento que contém a
solução – percurso ótico da luz na amostra 𝓵 (expresso em cm).
𝐴 = 𝑘′. ℓ
 LEI DE BEER
Para uma concentração baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz
considerado.
A absorbância da solução é diretamente proporcional à concentração do soluto na amostra (𝒄).
𝐴 = 𝑘′′. 𝑐
 LEI DE LAMBERT – BEER
Combinando as duas leis anteriores, a equação fundamental para a absorção da luz passa a ser:
𝐴 = 𝑘. ℓ. 𝑐
Constante de proporcionalidade (𝒌) - coeficiente de extinção, representada por: 𝛆: 𝐴 = 𝜀. ℓ. 𝑐
𝑨 – absorbância - não tem unidades (intensidade luminosa);
𝓵 – trajeto ótico da luz - largura da cuvete utilizada em cm (na maioria dos casos é igual a 1cm);
𝛆 – coeficiente de extinção- unidades variam conforme as unids da concentração e do comprimento;

Unidades usadas podem ser:
L g−1 cm−1
L mol−1 cm−1 – quando a concentração está em molaridade - coeficiente de extinção molar.
COEFICIENTE DE EXTINÇÃO
É uma constante característica de cada espécie química dissolvida num determinado solvente.
Depende do comprimento de onda da radiação incidente e da temperatura.
Mais utilizado é o coeficiente de extinção molar - 𝜀.

Neste caso a lei de Lambert-Beer corresponde a: A= ε.l.c
O coeficiente de extinção molar de uma substância, para um determinado λ, corresponde à

absorbância de uma solução com a concentração 1M: l = 1cm
c = 1M ; A=εx1x1; A = ε.
O coeficiente de extinção molar pode ser consultado em tabela.

A partir da absorvância de soluções de concentração desconhecida, pode determinar-se facilmente
a respetiva concentração utilizando a lei de LambertBeer.
não é possível recorrer a um ε pré-determinado em todos os casos, como:
 para moléculas poliméricas de tamanho variável ou de peso molecular indefinido – como é o

caso de proteínas, cadeias de DNA ou de polissacarídeos;
 quando se deseja determinar a concentração, não de uma espécie química única, mas de
uma classe de compostos (por exemplo, todos os lípidos presentes numa amostra);
 quando se pretende medir uma concentração de um analito indiretamente através de uma
reação colorimétrica.
Nestes casos, a constante de proporcionalidade 𝒌 tem de ser determinada para cada situação e
condição experimental, por exemplo, através do método da curva de calibração.
CURVA DE CALIBRAÇÃO
Curva de calibração ou curva padrão é um método para determinar a concentração de uma

substância numa amostra desconhecida, comparando-a com um conjunto de amostras puras
dessa substância de concentração rigorosa conhecida.
A curva de calibração não é mais do que o gráfico da variação da resposta instrumental, o chamado
sinal analítico, em função da concentração do analito (a substância a ser medida).
Necessário preparar uma série de soluções padrão.

Soluções padrão- soluções com concentrações conhecidas da substância em estudo.
Dentro das concentrações preparadas/conhecidas deve estar: concentrações que inclua e seja
próxima à concentração esperada de analito.
Análise de cada padrão produzirá uma série de medições.

Permite construir a curva de calibração.
Maioria das análises, um gráfico de resposta do instrumento em função da concentração mostrará
uma relação linear.
Pode então medir-se o sinal da amostra desconhecida e, usando a curva de calibração, interpolar
para encontrar a concentração do analito.
No caso da espetrofotometria, é necessário construir a curva de calibração que represente a lei de
Lambert-Beer.
A reta obtida (reta padrão) e a sua equação corresponde à lei de Lambert Beer para essa condição
experimental.
O declive da reta corresponde à constante de proporcionalidade 𝒌.
Para construir uma curva de calibração para espetrofotometria é necessário:

Obter os valores de absorbância das soluções padrão.
Valores são colocados num gráfico:
 eixo das abcissas: a concentração - variável independente;

 eixo das ordenadas a absorbância – variável dependente.
Desenha-se então a melhor reta que traduz a nuvem de pontos, tomando como ponto fixo a origem
das coordenadas.
Alternativamente pode determinar-se a equação matemática da melhor reta representada pelo
conjunto de pontos através de um método estatístico de regressão linear ou utilizando um programa
de cálculo adequado
APLICAÇÕES DA ESPETROFOTOMETRIA
As aplicações da espetrofotometria podem ser divididas em duas categorias:
1. Medição da absorbância a um determinado comprimento de onda.
Exemplo: utilização do coeficiente de extinção molar ou construção de uma reta padrão para a
determinação da concentração de um determinado composto em solução.
2. Medição da variação da absorbância num intervalo de comprimentos de onda para a

obtenção de um espetro de absorção para identificação de biomoléculas.
O espetro de absorção de um composto é obtido medindo a absorbância a vários comprimentos de

onda e registando a absorbância em função do comprimento de onda.
ESPETROFOTOMETRIA DE PROTEÍNAS
As proteínas são biomoléculas poliméricas que absorvem radiação ultravioleta a 280 e 200 nm,
quando em solução
Os aminoácidos com anéis aromáticos são a principal razão para o pico de absorvância a 280 nm.
As ligações peptídicas são principalmente responsáveis pelo pico a 200 nm.

A composição em aminoácidos aromáticos, a estrutura secundária, terciária e quaternária das
proteínas afeta a sua absorvância, portanto fatores como pH, força iónica, etc. podem alterar o
espetro de absorção. Outros componentes na amostra, como ácidos nucleicos ou moléculas que
absorvam luz ultravioleta, podem interferir na quantificação espetrofotométrica de proteínas.
Para ultrapassar estas limitações, Marion M. Bradford, em 1976, desenvolveu um método

colorimétrico para dosear proteínas, o método de Bradford.
MÉTODO DE BRADFORD
Utilizado o reagente de Bradford- constituído por:

Corante Azul Brilhante de Comassie G-250
Metanol
Ácido fosfórico.
Em meio ácido:
- O Azul de Comassie apresenta uma cor castanha.
Quando este se liga às proteínas:

- Forma um complexo corante-proteína de cor azul.
Esta reação é proporcional à quantidade de proteínas presentes na amostra.

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QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS POR ESPETROFOTOMETRIA

A espetrofotometria permite tirar conclusões sobre:

 a natureza e composição de uma amostra desconhecida;

Todas as substâncias absorvem energia radiante, isto é, radiações eletromagnéticas.

 no ultravioleta (UV) – exemplo: vidro

Componentes básicos de um espetrofotómetro de ultravioleta-visível:

 Lâmpada: uma fonte de luz policromática, normalmente de tungsténio, para comprimentos

RAZÃO DA INTENSIDADE DA LUZ DE UMA SOLUÇÃO

A absorbância traduz a quantidade de luz absorvida pela substância em solução.

 LEI DE LAMBERT – BEER

Constante de proporcionalidade (𝒌) - coeficiente de extinção, representada por: 𝛆: 𝐴 = 𝜀. ℓ. 𝑐

𝑨 – absorbância - não tem unidades (intensidade luminosa);

𝛆 – coeficiente de extinção- unidades variam conforme as unids da concentração e do comprimento;

Mais utilizado é o coeficiente de extinção molar - 𝜀.

O coeficiente de extinção molar de uma substância, para um determinado λ, corresponde à

O coeficiente de extinção molar pode ser consultado em tabela.

não é possível recorrer a um ε pré-determinado em todos os casos, como:

 para moléculas poliméricas de tamanho variável ou de peso molecular indefinido – como é o

Curva de calibração ou curva padrão é um método para determinar a concentração de uma

Necessário preparar uma série de soluções padrão.

Análise de cada padrão produzirá uma série de medições.

Para construir uma curva de calibração para espetrofotometria é necessário:

 eixo das abcissas: a concentração - variável independente;

1. Medição da absorbância a um determinado comprimento de onda.

2. Medição da variação da absorbância num intervalo de comprimentos de onda para a

O espetro de absorção de um composto é obtido medindo a absorbância a vários comprimentos de

As ligações peptídicas são principalmente responsáveis pelo pico a 200 nm.

Para ultrapassar estas limitações, Marion M. Bradford, em 1976, desenvolveu um método

Utilizado o reagente de Bradford- constituído por:

Quando este se liga às proteínas:

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