KROMATOGRAFI LAPIS

TIPIS (KLT)
Emma Emawati (28 November 2015)
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
 Pengertian: KLT merupakan cara pemisahan
campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan
mengetahui kuantitasnya dan kromatografi ini
merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan
sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikan
 Kromatografi digunakan untuk memisahkan suatu
campuran menjadi komponen komponennya
 Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar
bergntung pada sifat kelarutan senyawa yang akan
dipisahkan
 Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa
padatan, atau kombinasi cairan padatan) dan fase
gerak berupa cairan atau gas. Fase gerak mengalir
melalui fase diam dan membawa komponen komponen
yang terdapatdalam campuran. Komponen komponen
berbeda bergerak pada jalur yang berbeda.
Beberapa keuntungan KLT
1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk
tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan
dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan
radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending),
menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena
komponen yang akan ditentukan merupakan bercak
yang tidak bergerak.
FASE DIAM

 Merupakan penjerap
berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30
μm.
 Penjerap yang paling sering

digunakan adalah silica dan

serbuk selulosa, sementara
mekanisme sorpsi yang utama
pada KLT adalah adsorpsi dan
partisi.
Beberapa Fase diam Pada KLT
FASE GERAK

 Sistem yang paling

sederhana ialah
campuran 2 pelarut
organik karena daya
pelarut ini dapat mudah
diatur
Cara Memilih dan Mengoptimasi Fasa
Gerak
1. Fase gerak mempunyai kemurnian yang sangat tinggi

2. Daya elusi fase gerak diatur sedemikian rupa sehingga

harga Rf terletak antara 0,2-0,8

3. Pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan
nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke
dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara
signifikan.

4. Solute-solute ionik dan solute-solute polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan
tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammoniamasing-masing akan
meningkatkan solute-solut yangbersifat basa dan asam.
Aplikasi (Penotolan ) Sampel
 Untuk memperoleh
roprodusibilitas, volume
sampel yang ditotolkan
paling sedikit 0,5 μl.
 Jika volume sampel
yang ditotolkan lebih
besar dari 2- 10 μl,
maka penotolan harus
dilakukan secara
bertahap dengan
dilakukan
 pengeringan antar
totolan.
Pengembangan
 Tepi bagian bawah
lempeng tipis yang
telah ditotoli sampel
dicelupkan kedalam
fase gerak kurang
lebih 0,5-1 cm.
 Tinggi fase gerak
dalam bejana harus
dibawah lempeng
yang telah berisi
totolan sampel.
 Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan
sedapat mungkin volume fase gerak sedikit mungkin
tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai
ketinggian lempeng yang telah ditentukan.
 Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya
bejana dilapisi dengan kertas saring . Jika fase
gerak telah mencapai ujung dari kertas saring,
maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah
jenuh.
Medeteksi Bercak
 Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan
mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui
cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas.
 Cara fisika yang dapat digunakan untuk
menampakkan bercak adalah dengan denagan
cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar
ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama
untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat
bercak akan terlihat jelas.
Mengidentifikasi Senyawa senyawa
 Senyawa-senyawa pada suatu campuran bisa
dapat diketahui dengan membandingkan bercak
bercak hasil pelaksanaan kroatografi yang dibuat
dengan bercak bercak hasil kromatografi yang
sudah diketahui jenis senyawanya
 Dengan membandingkan posisi, dan warna bercak
senyawa pada plat KLT
Berikut adalah cara kimiawai untuk
mendeteksi bercak
 Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang
akan bereaksi secara kimia dengan solute yang
mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak
menjadi berwarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih
dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan
intensitas warna bercak.
 Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang
dipasang panjang gelombang emisi 254 atau 366 untuk
menampakkan solute sebagai bercak yang gelap atau
bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang
berfluorosensi seragam. Lempeng yag diperdagangkan
dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi
dengan senyawa fluorosen yang tidak larut.
 Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam
nitrat pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solute-solut
organic yang akan Nampak sebagai bercak hitam sampai
kecoklat-coklatan.
 Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber
tertutup.
 Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan
densitometer, suatu instrument yang dapat mengukur
intensitas radiasi yang direfleksikan dari permukaan
lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar
tampak. Solut-solut yang mampu menyera[p sinar akan
dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatatan (recorder)
Perhitungan Nilai Rf
 Perhitungan nilai Rf
didasarkan atas rumus :
Rf=jarak yang ditempuh
oleh komponen(b) di bagi
jarak yang ditempuh oleh
pelarut(a)
 Nilai Rf dinyatakan
hingga angka 1,0
beberapa pustaka
menyatakan nilai Rf yang
baik yang menunjukkan
pemisahan yang cukup
baik adalah berkisar
antara 0,2-0,8
Penggunaan KLT
 Analisa kualitatif dengan KLT dapat dilakukan untuk uji identifikasi
senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk
identifikasi adalah nilai Rf.
 Analisis kuantitatif dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak
langsung pada lengpeng dengan menggunakan ukuran luas atau
dengan teknik densitometry dan cara berikutnya dalaha dengan
mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat
dalam bercak dengan metode analisis yang lain, misalnya dengan
metode spektrofotometri.
 Analisis preparatif, sampel yang ditotolkan dalam lempeng dengan
lapisan yang besar lalu dikembangkan dan dideteksi dengan cara
yang non- dekstruktif. Bercak yang mengandung analit yang dituju
selanjutnya dikerok dan dilakukan analisis lanjutan.