Kromatografi lapis tipis adalah metode kromatografi cair yang paling

sederhana. Pada Kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas serupa dalam hal

fase diamnya berupa lapisan tipis dan fase geraknya mengalir karena kerja kapiler.

Perbedaannya dalam sifat dan fungsi fase diam. Pada KLT, fase cair lapisan tipis

(tebal 0,1-2 mm) yang terdiri dari bahan padat yang dilapiskan kepada permukaan

penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca, tapi dapat pula terbuat dari pelat

polimer atau logam. Lapisan melekat kepada permukaan dengan bantuan bahan

pengikat, biasanya CaSO4 atau amilum (pati). (Gritter, 1991)

Pada KLT, zat penyerap merupakan lapisan tipis serbuk halus yang dilapiskan

pada lempeng kaca, plastik atau logam secara merata, umumnya digunakan

lempeng kaca. Lempeng yang umumnya dapat dianggap sebagai kolom

kromatografi terbuka dan pemisahan yang tercapai dapat didasarkan pada adsorbsi,

partisi atau kombinasi kedua efek, tergantung dari jenis zat penyangga, cara

pembuatan dan jenis pelarut yang digunakan. (Ditjen POM,1995)

KLT dengan lapis tipis penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan

senyawa polar. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan bercak dengan

harga Rf yang identik dan ukuran hampir sama, dengan menotolkan zat uji dan baku

pembanding pada lempeng yang sama. Perbandingan visual ukuran bercak yang

dapat digunakan untuk memperkirakan kadar secara semikuantitatif

Titik tempat campuran ditotolkan pada ujung pelat atau lembaran disebut titik

awal dengan cara menempatkan cuplikan itu disana disebut penotolan. Garis depan

pelarut adalah bagian atas fase gerak atau pelarut ketika ia bergerak melalui

lapisan, dan setelah pengembangan selesai , merupakan tinggi maksimum yang

diperoleh pelarut. Perilaku senyawa tertentu di dalam sistem kromatografi tertentu

dinyatakan dengan harga Rf. Angka ini diperoleh dengan membagi jarak yang
ditempuh oleh bercak linarut dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan pelarut.

Keduanya diukur dari titk awal dan harga Rf beragam mulai dari 0 sampai 1

Ada dua metode kuantitasi analit dalam KLT (cocok untuk bahan anti

radioaktif). Pertama melibatkan sejumlah cara pengukuran langsung pada lempeng

seperti pengukuran luas, perbandingan keterlihatan, atau densitometri. Kedua

melibatkan pergerakan analit dari lempeng, diikuti dengan tahap kuantitasi. Masing-

masing metode mempunyai keuntungan dan kerugian dan mempunyai kedudukan

tersendiri dalam KLT kuantitatif. Teknik ini terutama ditekankan pada densitometri .

(Munson, 1991)

Pelaksanaan KLT

1. Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam
dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT
dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara
mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi (Gandjar &
Rohman, 2007).

2. Fase Gerak

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-
coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana
ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini
dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara
optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase
gerak :

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti
 juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007).

3. Penotolan Sampel

Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5
l. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 l, maka penotolan
harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan
(Gandjar & Rohman, 2007).

4. Pengembangan

Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan

sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase
gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan
kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus
dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.

Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak
sedikit mungkin, akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian
lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya
bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari
kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar &
Rohman, 2007).

5. Deteksi Bercak

Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang
biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui
cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat
digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif
dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk
senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas (Gandjar &
Rohman, 2007).

Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV

254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366
nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254
atau 366 nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya
(Gibbons, 2006).
DAFTAR PUSTAKA

1. Gritter, J.R., dkk., (1991), Kromatografi , Penerbit Institut Teknologi

Bandung, 1, 6, 8.
2. Ditjen POM., (1995), Farmakope Indonesia , Edisi IV, Departemen
Kesehatan RI, Jakarta, 45, 46, 50, 1002
3. Munson, J.R., (1991), Analisis Farmasi, Bagian B, Airlangga University
Press, Surabaya, 125, 128.
4. Ditjen POM., (1979), Farmakope Indonesia , Edisi III, Departemen
Kesehatan RI, Jakarta, 41, 658, 151
5. Svehla, G., (1985), VOGEL : Buku Teks Analisis Kualitatif Makro dan
Semimikro , PT Kalman Media Pustaka, Jakarta.