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    Cet article décrit les outils et techniques de base du génie génétique, notamment les enzymes comme les nucléases, ligases et polymérases utilisées pour manipuler et modifier l'ADN.

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    OUTILS DE GENIE GENETIQUE

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    OUTILS DE GENIE

    GENETIQUE
    Gnie gntique

    Ensemble des techniques de manipulation


    du matriel gntique (ADN, ARN) des
    fins pratiques pour utiliser, reproduire,
    ou modifier le gnome des tres vivants
    Le code gntique est le mme pour tous
    les tres vivants

    Un mme gne donnera toujours la mme


    protine, peu importe l'espce de
    l'individu

    On peut introduire un gne d'une espce


    dans une autre espce = gnie gntique
    Connaissances permettant de transfrer du matriel
    gntique dun organisme un autre

    ADN recombinant (ou recombin)


    ADN hybride obtenu in vitro par combinaison de
    deux molcules dADN appartenant deux
    espces diffrentes
    Les plasmides

    Petites molcules dADN double brin, circulaires


    A localisation extrachromosomique
    Prsents chez la plupart des espces bactriennes
    A rplication autonome (=rplicons) indpendamment
    des chromosomes

    Chromosome bactrien
    circulaire Plasmides

    Bactrie
    L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un
    organisme donneur et celui dun vecteur (qui peut tre d'une espce
    totalement diffrente)

    ORGANISME DONNEUR : VECTEUR


    Extraction d'un fragment (fragment d'ADN capable de
    d'ADN d'intrt rplication autonome)
    Ex: gne associ une maladie LADN dans lequel on insre lADN
    LADN insr est appel insert , tudier et qui sert de support
    ADN exogne ou ADN tranger

    Insertion du fragment d'intrt dans le vecteur

    Obtention d'un ADN Recombinant

    Amplification de cet ADN, expression des


    protines correspondantes...
    On extrait les plasmides de bactries

    Une enzyme ouvre les


    plasmides

    On extrait ou on
    synthtise le On mlange des copies du gne et
    gne greffer des plasmides. Une enzyme
    fusionne les brins d'ADN

    Les plasmides sont rintroduits


    dans des bactries

    Le gne est reproduit quand la


    bactrie se reproduit
    Applications pratiques

    Thrapie gnique

    Vise remplacer ou complmenter un allle


    mutant dfectueux par un allle fonctionnel
    A surexprim une protine dont l'activit
    aurait un impact thrapeutique (Production de
    protines dintrt mdical)
    Vaccins
    Applications pratiques

    Plantes transgniques

    Plantes rsistantes aux insectes


    Rsistantes aux herbicides
    Fruits et lgumes qui se conservent plus
    longtemps
    Nouvelles saveurs
    Plantes plus riches en certains lments
    nutritifs (vitamines)
    Applications pratiques

    Animaux transgniques
    Animaux croissance plus rapide
    Plus faibles en gras
    Plus productifs (en lait, en viande, en ufs)
    Production de protines usage
    pharmaceutique (ex: insuline)

    DANGERS ?????
    Pour la sant ?
    Pour l'environnement ?
    Les enzymes en gnie gntique
    1- Les nuclases

    les nuclases dgradent les molcules d'ADN


    en rompant les liaisons phosphodiesters
    liant un nuclotide au suivant
    Il existe 2 types de nuclases
    Les exonuclases coupent aux extrmits
    les endonuclases coupent des liaisons internes
    1-1- Exonuclases

    Ces enzymes liminent des nuclotides un un


    partir dune extrmit de lADN
    Dans le sens 5 vers 3ou l'inverse

    Ex: Exonuclase III catalyse lhydrolyse


    squentielle des nuclotides dun ADN partir
    dune extrmit 3 libre (dans le sens 3 vers 5)
    1-2- Endonuclases
    A clivages non spcifiques
    Ces enzymes sont capables de rompre des
    liaisons phosphodiesters internes

    - La DNase extraite du pancras


    Coupe prfrentiellement aprs une base
    pyrimidique
    - La nuclase S1
    Isole dun champignon, Aspergillus oryzae
    Dgrade seulement les acides nucliques
    monocatnaires
    A clivages non spcifiques
    Enzymes de restriction
    Molcules extraites partir de microorganismes
    (gnralement des bactries) et qui coupent les
    liaisons phosphodiesters au niveau des acides
    nucliques
    Enzymes de restriction

    Fabriques par les bactries

    Protgent les bactries contre linvasion par de lADN


    tranger quelles coupent en petits morceaux

    Reconnaissent des squences spcifiques de 4 8


    nuclotides

    Coupent lADN sur ces sites dfinis (sites de restriction)

    Crent des bouts qui sont complmentaires

    La taille des fragments dADN produits dpend de la


    distribution des sites de restriction
    Sites de restrictions ?

    Sites spcifiques de nature palindromique


    La lecture des deux brins complmentaires
    dans des sens opposs donne la mme
    squence

    5 ATGCTAGCTAGCAT 3
    3 TACGATCGATCGTA 5
    Les enzymes de restriction peuvent couper en faisant des
    extrmits franches (mme taille d'ADN sur chaque brin), ou
    des extrmits cohsives (5' sortantes, ou 3' sortantes)
    Ces enzymes de restriction sont classs en fonction de
    leur site de reconnaissance et leur lieu de coupure
    quoi servent les enzymes de restriction ?
    couper l ADN des squences spcifiques
    Crent des extrmits, pouvant s apparier et tre
    relis par la ligase

    Comment peut-on amplifier un gne ?


    Par clonage dans des bactries qui se multiplient
    (Amplifient lADN (in vivo))
    Par PCR (Enzymes amplifient lADN (in vitro))

    Quelle est lutilit de lamplification ?


    Obtenir un trs grand nombre de molcules
    identiques (gnes) pour pouvoir en tudier la
    fonction
    2- Ligase
    Il est possible d'assembler deux
    fragments d'ADN avec
    l'utilisation d'une ligase
    Catalyse la formation d'une liaison
    phosphodiester entre deux
    segments d'ADN
    2-1- ADN ligase
    L'enzyme n'agit que si les 2 ADN
    sont associs par des
    extrmits cohsives
    2-2- T4 ADN ligase
    Elle est capable d'effectuer des
    ligations entre 2 ADN a bouts
    francs
    Ex: Insrer une squence d'ADN dans
    un plasmide pour gnrer un vecteur
    d'expression
    3- Les enzymes modifiant lADN:
    De nombreuses enzymes modifient l'ADN par
    addition ou suppression de groupes chimiques
    spcifiques

    3-1- Les phosphatases


    Catalysent llimination dun groupement phosphate en
    5 Empchant donc la formation de liaison
    phosphodiester (empche toute action des ligases)

    Ex: Dphosphoryler un vecteur que lon vient douvrir par un


    enzyme de restriction, afin dviter une refermeture de ce
    vecteur (auto-ligation) qui empcherait alors dinsrer le
    fragment dADN tudier
    3-2- les kinases

    Les kinases permettent le transfert dun


    groupement phosphate partir dune
    molcule dATP

    Il sagit du phosphate en position gamma


    (le plus externe des trois groupements
    fixs sur lAdnosine). Il sera transfr
    lextrmit 5 dun ADN dphosphoryl
    4- Les polymrases et enzymes apparentes

    Les polymrases d'acides nucliques sont des


    enzymes qui synthtisent un nouveau brin
    d'ADN complmentaire a une matrice d'ADN
    ou ARN, seffectue de manire
    complmentaire et antiparallle

    Laddition des nouveaux nuclotides se faisant


    dans le sens 5 P vers 3 OH
    4-1- LADN polymrase I

    Extraite d'Escherichia coli, elle joue un rle


    majeur dans la rparation de l'ADN
    Est constitue dune seule chane peptidique et
    possde trois activits enzymatiques :
    -Une activit de synthse ADN polymrase 5-3;
    -Une activit de dgradation exonuclase 3-5;
    -Une activit de dgradation exonuclase 5-3.
    4-2- Lenzyme de Klenow
    enzyme obtenu partir de lADN polymrase I do
    lon a limin le petit fragment responsable de
    lactivit exonuclase 5-3. Il ne reste donc plus que
    les activits polymrase 5-3 et exonuclase 3-5

    4-3- Les ADN polymrases thermorsistantes


    La Taq polymrase Cest une ADN polymrase isole
    des bactries vivant dans les sources deau chaude.
    Elle agit une temprature voisine de 65c
    4-4- La rtrotranscriptase (ou transcriptase reverse):
    Code par les gnes pol des rtrovirus
    La RT est un enzyme qui permet de fabriquer un ADNc partir dun
    ARNm
    Hybridation molculaire

    Dsigne l'association qui peut avoir lieu entre deux acides


    nucliques simples brins de squences complmentaires et qui
    conduit la formation d'un double brin

    Cette association s'effectue par l'tablissement de liaisons


    hydrognes spcifiques : deux liaisons entre l'adnine (A) et la
    thymine (T) (ou l'uracile U) et trois entre la cytosine (C) et la
    guanine (G)

    L'hybridation est la base de nombreuses techniques de biologie


    molculaire impliquant la mise en prsence d'au moins deux brins
    simples d'acides nucliques dans des conditions physico
    chimiques prcises
    Les sondes nuclotidiques

    Une sonde nuclotidique est un segment de nuclotides


    qui permet de rechercher de manire spcifique un
    fragment d'acide nuclique que l'on dsire tudier
    Cette raction sonde-fragment correspond une
    raction d'hybridation molculaire
    Une sonde nuclotidique peut tre une squence d'ADN
    ou d'ARN, mais obligatoirement monobrin
    Sa taille est trs variable : oligonuclotide de 20-30
    nuclotides ou l'oppos de plusieurs centaines de
    nuclotides
    La sonde est complmentaire et antiparallle du
    fragment recherch. Dans un mlange complexe o
    s'effectue l'hybridation molculaire, la sonde doit
    tre facilement reprable grce un marquage avec
    un radioisotope
    Les vecteurs
    Un vecteur est un transporteur capable de conduire
    une molcule pntrer dans une cellule

    En biologie molculaire, certains vecteurs sont


    tudis pour faire entrer un acide nuclique dans
    une cellule et permettre la rplication ou lexpression
    de cet acide nuclique dans la cellule qui le reoit

    Les plasmides bactriens, les bactriophages et de


    nombreux virus sont des vecteurs naturels.

    Dautres vecteurs encore plus performants ont t


    obtenus artificiellement partir de ceux-l grce
    des manipulations gntiques

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