Chapitre II : les Vecteurs

L’Ingénierie génétique ou le génie génétique utilise la technologie de ADN recombinant (ADNr) pour
fusionner des gènes avec des vecteurs et les cloner dans des cellules hôtes : De cette manière, on
peut :
1 - Répliquer des gènes isolés en de nombreuses copies, et,
2 - Synthétiser leurs produits en grandes quantités

Vecteurs de clonage

Un vecteur est une petite molécule d’ADN à réplication autonome qui joue le rôle de transporteur
pour des fragments d’ADN d’intérêt. L’ensemble formé par le vecteur et les fragments insérés est
appelé ADN recombinant.

Choix du vecteur de clonage

Le vecteur idéal doit être une petite molécule pour pouvoir être facilement manipulé. Sa réplication
doit être efficace à l’intérieur d’une cellule vivante afin de permettre l’amplification du fragment
donneur inséré. Il doit aussi contenir des sites de restriction utilisables pour l’insertion de l’ADN à
cloner. Les sites uniques sont les plus pratiques car ils permettent de diriger l’insert vers un seul site
du vecteur. De nombreux vecteurs de clonage sont couramment utilisés et le choix de l’un d’entre
eux dépend de la taille du fragment d’ADN à cloner.

Principes généraux d’utilisation d’un vecteur

- préparation d’un vecteur

- préparation de l’ADN à insérer
- réalisation d’un recombinant
- incorporation à l’hote

Types de vecteurs

- Plasmides
- Bactériophages et autres virus
- Cosmides
- Chromosomes artificiels : BACs, YACs et PACs
1 – Plasmides

Les plasmides bactériens sont de petites molécules circulaires d’ADN qui existent en plus du
chromosome bactérien principal.ils répliquent leur ADN indépendamment du chromosome
bactérien. Il existe un grand nombre de plasmides différents chez les bactéries. La distribution de
n’importe quel plasmide à l’intérieur d’une même espèce est généralement sporadique : certaines
cellules possèdent le plasmide, d’autres en sont dépourvues.

Ils sont utilisés pour cloner des morceaux d’ADN relativement courts, jusqu'à 10 kb environ. Un tel
vecteur doit posséder trois éléments :

1- une origine de réplication permettant sa réplication dans E. coli

2 – un marqueur de sélection, généralement la résistance à un antibiotique
3 – un ou plusieurs sites de restriction particuliers ou il est possible de placer l’ADN étranger.

Les plasmides constituent également un moyen efficace d’amplifier l’ADN cloné car ils existent en un
grand nombre de copies/cellule, qui peut atteindre plusieurs centaines pour certains plasmides.

Le marqueur de sélection permet de reconnaitre facilement la présence du plasmide par sélection

génétique. Par exemple, les cellules contenant un plasmide avec un gène de résistance aux
antibiotiques survivent quand elles sont étalées sur un milieu nutritif contenant l’antibiotique, alors
que les cellules sans plasmide ne survivront pas.

Un fragment d’ADN est inséré dans une région du plasmide possédant des sites de clonage multiples
(SCM). Cette région renferme plusieurs sites de restriction particuliers : quand le plasmide est coupé
par les enzymes correspondantes, on obtient un plasmide linéaire. Si l’ADN d’intérêt est scindé par la
même enzyme de restriction, on peut le souder à ce site, après quoi l’ADN du plasmide est introduit
dans les cellules par transformation.

Deux plasmides très utilisés en génétique proviennent de plasmides naturels, mais ils ont été tous
deux modifiés génétiquement pour faciliter leur utilisation comme vecteurs recombinants d’ADN.
Le plasmide pBR322 possède deux génes de résistance à des antibiotiques, tetᴿ et ampᴿ. Ces deux
gènes contiennent des sites uniques de restriction utiles pour le clonage. Par exemple un ADN
donneur pourrait s’insérer dans le gène tetᴿ, ce qui casse et inactive le gène tetᴿ. La résistance à la
tétracycline est supprimée et la cellule y devient sensible (bactérie transformée). On peut donc
sélectionner les colonies résistantes à l’ampicilline ampᴿ. Parmi les colonies ampᴿ, seules les colonies
sensibles à la tétracycline contiendraient l’insert ou l’ADN recombinant.
 Le plasmide pUC est un vecteur plus élaboré, dont la structure permet la sélection visuelle directe
des colonies contenant les vecteurs avec les inserts d’ADN donneur ou étranger. L’élément clé est
une petite partie du gène de la β-galactosidase d’E. coli, enzyme qui scinde le lactose. Dans cette
région, un morceau d’ADN appelé polylinker ou site de clonage multiple SCM a été inséré. Il
contient de nombreux sites uniques de restriction, utiles à l’insertion des fragments étrangers. Dans
ces plasmides, l’insertion de l’ADN étranger interrompe le gène de la β-galactosidase et empêche la
synthèse d’une enzyme fonctionnelle. . Un substrat incolore de la β-galactosidase , appelé X-gal, est
ajouté au milieu et l’enzyme fonctionnelle convertit ce substrat en un colorant bleu, qui colore la
colonie en bleu. Quand les cellules sont étalées après transformation sur un milieu contenant à la
fois l’antibiotique (pour sélectionner les cellules contenant le plasmise) et X-gal ; elles restent
blanches si elles contiennent l’ADN inséré, alors que les cellules qui en sont dépourvues sont bleues.

Figure 1 : clonage moléculaire avec vecteur plasmidien

Il existe différentes générations de plasmides :

Les plasmides de première génération, rencontrés dans la nature, n’ont pas les propriétés requises
pour les manipulations génétiques ex : ColE1, RSF 2124, Psc101
Les plasmides de deuxième génération sont réunis sous le nom de pBR « numéro ». Ils ont subi
certaines modifications, plasmides artificiels (pBR312 à 328).
Les plasmides de troisième génération sont plus souvent utilisés, famille des pUC (Puc7 0 pUC19)
Les plasmides spéciaux de dernière génération sont faits sur mesure pour des cas spécifiques

2 – les vecteurs viraux

Le phage lambda λ : Phage de première génération

Le bactériophage λ est un virus d’E. coli, on peut y cloner des fragments ADN allant de 12 à 22 kb.
Génome du bactériophage λ est une molécule d’ADN linéaire, double brin, de 48,5 kpb, encapsidée
(empaquetée) dans la tète du phage. Il possède une tète icosaédrique, une queue non contractile
terminée par une fibre fine.
A chaque extrémité 5’appelée « cos », se trouve ADN monocaténaire de 12 nucléotides
Ces séquences sont complémentaires et leur association donne une structure circulaire à l’ADN
injecté dans la cellule hôte : l’ADN de λ possède donc des extrémités cohésives naturelles : elles
s’associent pour former le site « cos ».

Figure 3 : structure phage λ

L’infection phagique et la réplication du phage, ne dépendent pas de la partie centrale du génome :
Le 1/3 central du génome de ce virus n’est pas nécessaire pour la réalisation du cycle lytique. Cette
particularité est utilisée pour construire des vecteurs de clonage dans lesquels il est possible
d’insérer de grands fragments d’ADN chimère dans les têtes de phage. Une fois que l’ADN est inséré,
le génome du phage recombiné est empaqueté dans les capsides virales
Les Tètes et queues sont ensuite assemblées pour reconstituer des particules phagiques infectieuses
Les bactéries infectées par ces phages recombinants produisent de très nombreux nouveaux phages
avant d’être lysées : L’apparition d’une plage de lyse phagique sur le tapis bactérien signale
automatiquement la présence d’un phage recombinant contenant un insert. Il est ensuite possible de
récupérer d’importantes quantités d’ADN recombinant, de gènes, à partir du lysat. Deuxiéme
stratégie d’utilisation du vesteur λ ; Stratégie par insertion (environ 1 – 12 kb) : un site pour EcoR1.
Dérivés du phage λ utilisés comme vecteur de clonage (2eme génération): phage M13, phage λ
ZAP,……
 Figure 4 : clonage dans le phage λ

3 - Les cosmides

Les cosmides sont des vecteurs hybrides des phages λ et des plasmides ; plasmides qui contiennent
un fragment ADN de phage λ porteur du site « cos ». Leur ADN peut se répliquer dans la cellule
comme celui d’un plasmide et être empaqueté comme celui d’un phage. Toutefois, les cosmides
peuvent transporter des inserts d’ADN environ trois fois plus longs que ceux transportés par λ lui-
même (jusqu'à 45 kb).

Ils ont les caractéristiques d’un plasmide (origine de réplication et un marqueur de sélection Ampᴿ)
et d’un bactériophage λ (séquence « cos », nécessaire à l’encapsidation de ADN dans des particules
phagiques). Les cosmides peuvent être encapsidés dans des capsides de bactériophages, de façon à
transférer les gènes d'intérêt dans des cellules par transduction (infecter une bactérie)

Figure 5 : clonage par les cosmides

4 – Chromosomes artificiels

La taille des molécules susceptibles d’être clonées dans des vecteurs plasmodiaux à limité l’analyse
des génomes à grande échelle. Pour cela, les généticiens ont décidé de construire des chromosomes
artificiels de bactéries (BACs) et des chromosomes artificiels de levures (YACs). On a aussi progressé
dans la création de chromosomes artificiels de mammifères. Ils ne se répliquent qu’une fois par cycle
cellulaire (comme les chromosomes naturels.

a)- YAC = « yeast artificial chromosome », premiers à être développés, segments linéaires ADN, sont
des vecteurs construits à partir de séquences ADN chromosomique de levure. Ils Possèdent :
- une origine de réplication (ARS),
- un site centromérique (CEN), et
- des séquences télomériques (TEL) leur permettant de se comporter comme un chromosome une
fois introduit sous forme linéarisé dans la levure.

TRP1 : milieu sans tryptophane URA3 : milieu sans uracile MCS : sites de clonage
multiples

De très grands fragments d’ADN exogène (de 150 à 1000 kb) peuvent être introduits dans les YACs.
Actuellement, le plus grand insert cloné a une taille de 2900 kb. Ces vecteurs sont donc de bons
outils pour l’analyse des génomes complexes.

D’autres vecteurs permettent également le clonage de grands fragments d’ADN : BACs et les PI-
dérived Artificial Chromosome (PAC).

b) - Les BACs : Bacterial artificial chromosomes, dérivent d’un plasmide : le facteur F, servent à cloner
de grands fragments d’ADN (300 kb), présents en une seule copie dans la bactérie hôte. On mélange
les gènes d’intérêt avec le facteur F : forment le BAC. Premier vecteur BAC construit = pBAC108L

BACs se comportent comme les plasmides de très grande taille. Ils sont de plus en plus utilisés : par
rapport aux YACs, le clonage de l’ADN y est plus efficace, et les clones sont plus stables dans E. coli
que dans la levure.
c) - Vecteurs PAC = P1 artificial chromosome, accepte des inserts ADN allant de 80 à 100 kp, dérive
du bactériophage P1 dont le génome est plus grand que celui de λ.

d) - Chromosomes artificiels de mammifères ou MACs (Mammalian Artificial Chromosomes :

Structure comparable aux YACs en mettant des centromères et des télomères dérivés des
chromosomes de mammifères.

e) - Chromosomes artificiels humains : Peuvent transférer des segments humains plus longs ADN
humain dans cellules en cultures, sont généralement construits par fragmentation de chromosomes
avec séquence centromérique, de forme circulaire (forme linéaire n’a pas pu être construite. )

f) - Vecteurs navettes : Vecteur pouvant se répliquer chez deux espèces différentes, Ex : vecteur YAC
se répliquant à la fois chez E. coli sous forme circulaire et chez la levure S. cerevisiae sous forme
linéaire. Il possède une séquence contrôlant la réplication chez E. coli (ORI) et une séquence
pour la réplication chez S. cerevisiae (ARS), des gènes Ampᴿ et génes TRP1, URA3, HIS3, codant des
enzymes de biosynthèse d’acides aminés pour la sélection chez la levure, deux séquences TEL, un
CMS et une région CEN.

Vecteurs de clonage : Destinés à l’isolement d’un fragment d’ADN, appelé « insert » et à amplifier
dans une cellule hôte.
Vecteurs d’expression : Dérivent des vecteurs de clonage. Destinés à isoler une séquence codante
(gène ou partie d’un gène) pour introduire dans une cellule-hôte appropriée afin de l’exprimer.