Chap3 Methodes Indirectes de Diagnostic II

METHODES DE
DIAGNOSTIC EN
VIROLOGIE
Dr Edgard Macondo
Diagnostic indirect
Il consiste à rechercher des Ac synthétisés dans un organisme en
réponse à une infection aigue, chronique ou ancienne.
Les techniques utilisées sont basées sur le principe de la
réactivité spécifique d’un Ac à l’Ag qui l’a généré.
Les Ag utilisés sont soit des virus entiers purifiés, des protéines
virales natives ou recombinantes, des oligopeptides synthétiques.
Les Ac sont généralement trouvés dans le sérum, rarement dans
d’autres liquides biologiques (salives, urines, LCR etc.)
Plusieurs techniques sont utilisées pour visualiser les Ac dans le
sérum, elles sont regroupées en deux grandes catégories :
Celles qui détectent des Ac possédant une activité antivirale
Celles qui détectent des Ac sans activité antivirale
Détection des Ac possédant une activité antivirale

Ces techniques ne sont limitées qu’à certaines infections, elles
permettent de mesurer l’efficacité de certains vaccins
Séroneutralisation
C’est l’inhibition des premières étapes de la multiplication

du virus (attachement et pénétration) par des Ac dits
neutralisants. Ces Ac empêchent l’apparition d’un ECP
visible, ils ont une activité protectrice In vivo. Ils sont
dirigés contre les constituants les plus externes du virus.
Cette technique s’applique aux virus induisant un ECP
d’apparition rapide (Entérovirus, Herpes virus). C’est la
technique de référence pour mesurer l’immunité anti-
poliomyélite
Séroneutralisation
Séroneutralisation
Inhibition de l’hémagglutination
Elle est réservée aux virus capable d’agglutiner les hématies

de certaines espèces animales (virus de la rubéole, virus de
la grippe, virus de la rougeole, virus des oreillons etc.).
Elle consiste à mettre en présence des dilutions croissantes
du sérum à tester avec le virus puis des globules rouges. La
présence des Ac dans le sérum se traduit par une inhibition
de l’hémagglutination (comparaison avec un témoin sans le
sérum). Le pouvoir protecteur de ces Ac réside au fait que
l’hémagglutinine est impliquée dans l’infectiosité du virus.
Détection des anticorps sans propriétés antivirales
Ces techniques sont les plus utilisées de par leur facilité.
Agglutination passive
Elle utilise des particules sensibilisées à l’Ag (latex,
gélatine, hématies). L’interaction Ag-Ac (IgG, IgM, IgA)
conduit à une agglutination rapide et macroscopique. Des
faux négatifs peuvent être observés par un phénomène de
zone (formation de complexes immuns réversibles par excès
d’Ac), ces sérums doivent être testés à une dilution au 1/10.
Fixation du complément
Le principe est basé sur la notion que le complément se fixe
puis s’active par un complexe Ag-Ac.
Le sérum à tester doit être décomplémenté (30 min à 56°C)
pour éviter toute source de complément non contrôlée.
Le sérum est mis en contact avec l’Ag viral et en présence
du complément.
La révélation de la réaction se fait par l’addition d’un autre
complexe Ag-Ac (hématies sensibilisées aux Ac).
Fixation du complément
Si le sérum possède des Ac anti-virus, le complexe immun
consomme le complément, le deuxième complexe (Ac-
hématies) reste intact.
En absence d’Ac dans le sérum, le complément disponible
se fixe sur le deuxième complexe (Ac-hématies) et lyse les
hématies.
L’hémolyse signe donc l’absence d’Ac dans le sérum testé.
Techniques utilisant un deuxième Ac marqué (conjugué)
Ce sont les techniques les plus utilisées, leur principe est le
suivant : l’Ag est fixé sur un support solide (lame, plaque,
microcupule, microparticule, membrane), le sérum à tester est
mis en contact avec l’Ag, après une incubation et un premier
lavage, un Ac anti-Ig humaine conjugué est ajouté. La nature du
conjugué et sa méthode de révélation permettent de définir la
technique utilisée. Fluorochrome (IFI), Enzyme (technique
immuno enzymatique telles que EIA, ELISA, immuno
empreinte, Western Blot, Dot Blot). Ces techniques permettent
de mettre en évidence les différentes classes d’Ig en utilisant des
conjugués dirigés contre celles-ci (IgA, IgM, IgG).
Immunofluorescence
Le support est constitué d’une lame porte objet sur laquelle
est fixée une lignée cellulaire infectée.
Après contact avec le sérum à tester puis lavage, le conjugué
est ajouté (Ac couplé à un fluorochrome, ITCF).
La spécifité de la méthode dépend du lecteur (subjectivité),
des faux positifs sont dus aux artéfacts (fluorescence non
spécifique).
Radio-Immunologie (RIA)
Le conjugué est un Ac couplé à un radio-isotope.
La détection des immuns complexes est réalisée à l’aide à

un compteur gamma. Les dangers liés à la radioactivité
limitent l’utilisation de cette technique.
Techniques immunoenzymatiques
Elles présentent plusieurs avantages : elles sont très
sensibles, elles discernent les classes des Ac, elles sont
automatisables et utilisent des faibles volumes
d’échantillons.
Principe : le sérum à tester est mis en contact avec un

support (sur lequel est fixé l’Ag). Après incubation et la
lavage, on ajoute un conjugué (anti-Ig couplé à un enzyme)
suivi d’une deuxième incubation et lavage.
La nature du substrat du conjugué peut être fluorogénique,

chimioluminescent ou chromogénique. Les effets obtenus sont
quantifiés par un fluoromètre, luminomètre ou spectrophotomètre.
La sensibilité peut être optimisée par un système d’amplification
de la révélation (exemple Streptavidine-biotine). Cette
optimisation de la sensibilité peut avoir une conséquence sur la
spécificité.
La spécificité est basée sur la nature de l’Ag fixé sur le support.
Les Ag peuvent être obtenus à partir d’un lysat de culture virale
(tests de première génération), à partir des peptide synthétiques
ou protéines recombinantes (tests de deuxième génération).
En fonction du support, on distingue :

EIA ou ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
avec comme support une microcupule en polypropylène.
MEIA (Microparticule Enzyme Immuno Assay) avec
comme support des microparticules métallique ou de latex.
Cette méthode a l’avantage d’augmenter la surface de
contact et de réduire le temps de réaction.
Techniques immunoempreintes
Immunoblot, le Western blot et le Dot blot.

Les antigènes viraux sont fractionnés, migrés sur gel d’agarose pour
une séparation puis transférés sur un support (membrane de
nitrocellulose. La révélation se fait par EIA.
Les peptides synthétiques ou des protéines recombinantes peuvent être
déposées directement sur la membrane de nitrocellulose (Dot blot).
Ces méthodes sont très spécifiques et permettent la confirmation des
tests ELISA et EIA et l’identification des certains Ac (en fonction de
leur Ag). En fonction des virus, un nombre d’Ac est nécessaire pour la
confirmation. Exemple pour HIV, il faut au moins deux Ac
d’enveloppe (GP 160, 120, 41/36) et un Ac de la capside (P24, P17
etc).
Avidité des IgG
Cette technique exploite l’existence d’une maturation de la

réponse immunitaire humorale en mesurant le pourcentage
d’affinité des IgG. Elle permet de distinguer une primo infection
d’une infection ancienne ou de dater approximativement
l’infection.
Le principe est basé sur le degré de dissociation spécifique du
complexe immun par l’action d’un agent dénaturant (urée).
L’avidité est utilisée pour les infections de rubéole, CMV chez
les femmes enceintes.

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METHODES DE

Détection des Ac possédant une activité antivirale

C’est l’inhibition des premières étapes de la multiplication

Elle est réservée aux virus capable d’agglutiner les hématies

Le conjugué est un Ac couplé à un radio-isotope.

La détection des immuns complexes est réalisée à l’aide à

Principe : le sérum à tester est mis en contact avec un

La nature du substrat du conjugué peut être fluorogénique,

En fonction du support, on distingue :

Immunoblot, le Western blot et le Dot blot.

Avidité des IgG

Cette technique exploite l’existence d’une maturation de la

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