INTRODUCTION

La culture cellulaire est une technique de laboratoire permettant de faire vivre in vitro des
cellules, de diverses natures et d'origines, d'en modifier les propriétés ou d'augmenter leur
nombre, afin d'en disposer en grande quantité pour ce qu'on veut en faire. La culture cellulaire
n'est pas une fin en soi, mais un outil indispensable à la biologie cellulaire eucaryote. En
biologie, la culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire croître des
cellules hors de leur organisme (e
in vitro ». Le principe consiste à obtenir un
type de cellules vivantes, de trouver un moyen de le faire survivre dans les conditions
artificielles du laboratoire, au mieux de la faire proliférer, tout en maintenant des conditions de
stress acceptable. Les conditions et les propriétés du milieu de culture sont pour cela capitales.
ituellement
intégrées dans les organismes complets.

I- HISTORIQUE

Trois périodes vont marquer le développement de la culture cellulaire :

*La période des précurseurs (1885 à 1900). Cette période annonce la première méthode de
culture de tissus en dehors du corps, grâce au professeur ROSS Harrison qui a pu cultiver des
neuroblastes de grenouille dans un milieu de lymphe et ainsi franchit un premier pas vers la
recherche actuelle sur les cellules souches et leurs dérivées.

* La période de la culture des tissus (à partir de1902). Cette période est dominée par Alexis
Carrel qui oriente le développement de la culture de tissus suivant trois voies principales :

105
 -

la trypsinisation des tissus par Moscona

de se diviser in vitro.

II- ORIGINE DES CELLULES MISES EN CULTURES

Les cellules mises en culture peuvent être :

- des microorganismes libres (bactéries ou levures)

On parle ainsi de «culture primaire ». Ces cellules ne peuvent habituellement pas être
maintenues en culture indéfiniment, notamment à cause de leur nombre limité de divisions
(limite de Hayflick) ;

- des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle « immortalité en
culture ») ; ce sont des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit
des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues « immortelles »
artificiellement ;

III- LES ETAPES GENERALES DE LA CULTURE CELLULAIRE

1- La préparation du matériel

1.1. Les ustensiles

Cinq ustensiles sont employés. Ce sont :
- une pêchette

106
 - deux micros scalpels
- un pot de crème dessert rempli de liquide de Tyrode ;
On y déversera lentement le jaune de l
- un petit saladier de type (rince-doigts) ; on y rincera l embryon dans le liquide de tyrode
à l aide de la pêchette.
- une salière : à l embryon
dans du milieu de culture.

Les micro scalpels sont réalisés à partir d aiguille à coudre fines. Monter l aiguille sur le
porte aiguille et l aiguiser sur deux plans opposés à l aide d une pierre à huile. A l aide de la
face à gros grains, on dégrossit les deux plans du scalpel, puis on les affines avec la face à grains
fins, laquelle, par suite, servira également à entretenir l affûtage de la lame obtenue.

1.2. La verrerie

Pour la préparation des cuves à fond noir, faire fondre la paraffine et y ajouter une cuillère
à soupe de charbon animal en poudre bien mélanger, puis couler dans les boites de Pétri. La
couche de paraffine doit être assez épaisse (de façon qu on puisse facilement y planter les
épingles à insectes) mais sans excès, en sorte que le fond reste bien noir. Par la suite, il suffira
de repasser les cuves à l étuve après chaque utilisation pour les stériliser.

Lors de la commande, faire clairement préciser par le fournisseur, le jour de la livraison

jusqu'à leur mise en incubation, soit trois jours avant la manipulation. Ils peuvent attendre
environ une semaine entre la livraison et le début de l incubation. Dans la nature, en effet, les

dans une petite étuve Jeulin, la même que celle qui sert à maintenir les flacons de culture de
37°C.

1.4. Milieu de culture et propriétés

Le milieu de culture utilisé est le SFRI4. Ce milieu de culture totalement défini est constitué
de RPMI 1640 additionné de sérum albumine bovine, de facteurs de croissance et d hormones.
Dans ce milieu, la culture de cellules dissociées par la trypsine fournit des fibroblastes et

107
beaucoup de neurones.

croissance, en hormones et en protéines sériques, on observe une prolifération très importante

des fibroblastes au détriment des neurones. On peut également utiliser un autre milieu de
culture, le milieu de Leibowitz. Il est bien adapté à la culture en atmosphère non enrichie en
CO2, mais il est incomplet. Pour obtenir de neurones, on pourra lui ajouter 2,5% de sérum de
on désire stimuler les fibroblastes

Composition d un milieu de culture pour tissus animaux le RPMI 1640

Sels inorganiques mg /l
Ca (NO3)2-4H2O 100
KCl 400
MgSO4-7H2O 100
NaCl 600
NaH2PO4-7H2O 1512
Autres composants mg /l
Glucose 2000
Glutathion 1,0
Hepes 5958
Rouge de phénol 5
Vitamines mg /l
Biotine 0,2
Pantothénate de calcium D 0,25
Acide folique 1
Chlorure de choline 3
Inositol 35
Nicotinamide 1
Acide para aminobenzoique 1
Pyrodoxine HCl 1
Riboflavine 0,2
Thiamine HCl 1
Vitamine B12 0,005
Acides aminés mg/l

108
 L-Arginine 200
L-Asparagine 50
Acide L-aspartique 20
L-Cystine 50
Acide L-Glutamique 20

L-Glutamine 300
Glycine 10
L-Histidine 15
L-Hydroxyproline 20
L-Isoleucine 50
L-Leucine 50
L-Lysine HCl 40
L-Méthionine 15
L-Phénylalanine 15
L-Proline 20
L-Sérine 30
L-Thréonine 20
L-Tryptophane 5
L-Tyrosine 20
L-Valine 20
Sérum de veau
Apporte des hormones (insuline) et des facteurs de croissance

2- Protocole de mise en culture

a-

b- Laisser couler un peu de blanc dans un récipient à débris (un pot à yaourt en verre, par

stérile du type pot en verre pour crème dessert contenant de la solution de tyrode stérile
c-
ciseaux. Repérer la face ventrale de l

109
 d-
récipient stérile (type "rince-doigt") rempli de solution de tyrode et bien éliminer le jaune résiduel

e- ryon dans une boîte de pétri à fond noir remplie de solution de tyrode.

f-
-ci flotte librement
le et le transférer dans une salière
stérile remplie de milieu de culture.
g-
scalpels.
h- Avec la pipette compter environ 25 gouttes de milieu de culture, de façon à former au fond
du flacon de culture, tenu horizontalement, un film continu mais très mince (si le film est trop
épais, les morceaux flotteront dans le milieu et ne pourront adhérer au fond du flacon).
i- eur pour transférer dans le flacon de
culture. Veiller à ne pas ajouter trop de milieux dans le flacon au cours de cette opération. Visser
les bouchons.
j-
chacun
k- Le lendemain, lorsque les morceaux ont adhéré au fond du flacon, ajouter du milieu de

l- Tous les deux à trois jours, éliminer le tiers ou les deux tiers du milieu de culture et le
remplacer par du milieu neuf.

3- Observation des cultures

é au-dessous de la platine
porte-objet, on observe directement le fond des flacons de culture. Le contraste de phases nous
permet de distinguer parfaitement les contours et les contenus cellulaires sans recourir à une
coloration ou à une préparation spéciale. Grâce à ces deux techniques, les cellules sont

110
compromet en aucune façon leur développement ultérieur.

La caméra qui est installée sur le microscope à tête

télévision du laboratoire différents phénomènes dynamiques et notamment :

- ;
-
neurotransmetteurs ;
- ;
- Mouvements et prolifération de certains hôtes indésirables, les bactéries par exemple (1h).

; il reste tout à fait possible de mener un travail

lames de microscope. On peut observer pendant quelques instants les cellules vivantes dans leur

méthodes classiques.

IV- LA CULTURE DE CELLULES IN VITRO

1- Les conditions de culture

Le principe général est de cultiver des cel

en conditions stériles. La composition du milieu doit permettre aux cellules de se développer et

(glucose), des acides aminés (ceux du code génétique, au nombre de 20) et des vitamines. Un
tampon HEPES maintient le PH et un indicateur coloré, le rouge de phénol, permet de contrôler
ce pH.

Beaucoup de cultures cellulaires sont effectuées en enceinte enrichie en CO2 de façon à

maintenir ce PH

la stérilité du milieu.

111
 A quoi correspond un facteur de croissance in vivo? Le PDGF (Platelet Derived Growth
Factor) est un facteur de croissance provenant des plaquettes sanguines qui est mitogène in
vitro. In vivo, ce facteur, contenu dans les granules des plaquettes, ne circule pas dans

de la coagulation du sang et stimulent au niveau de la plaie la prolifération cellulaire (par

exemple celle des fibroblastes pour produire plus de matrice extracellulaire). Le sérum de veau
-t-on des
milieux totalement artificiels, dont tous les facteurs de croissance sont répertoriés et quantifiés
(la SFRI 4, par exemple).

2- Les cellules mises en culture

2.1. Les supports des cultures

Certaines cellules se développent en suspension. Par exemple, les cellules de la lignée

lymphoïde poussent seules ou en minuscules amas. Elles adoptent une forme arrondie. Le plus
-ci et

couches, quelques fois). Ces cellules sont plus difficiles à obtenir en grand nombre que les
cellules poussant en suspension. Pour remédier à cet inconvénient, on utilise des perles micro

quantités de cellules.

les cellules Hela sont arrondies dans un milieu pauvre en sérum, mais présentent dans un milieu
riche en sérum la forme en fuseau aplati des fibroblastes.

2.2. Nombre des cellules

On peut mettre en culture à partir de masses de tissus excisés qui prolifèrent. On peut

r le milieu de culture avec une quantité

suffisante de cellules, celles-ci prolifèrent bien.

112
Les cellules sont en effet perméables et perdent certaines substances dans le milieu de culture.
Si celui-ci est trop abondant, les substances perdues sont trop diluées pour être récupérées et les
cellules meurent. Si le nombre de cellules est proportionnel au volume du milieu, les substances
perdues par les unes sont récupérées par les autres et les cellules survivent.

ule, on la cultive dans une goutte de milieu ou

rayons X mais restant actives métaboliquement.

2.3. Les types de cultures cellulaires

On distingue trois types : cultures primaires, cultures secondaires et lignées cellulaires.

- Les cultures primaires : fraîchement prélevées sur un animal, ces cellules opèrent
quelques mitoses.
- Les cultures secondaires : on les obtient par transfert de cellules primaires. Elles se
multiplient, puis meurent. Elles se divisent de 20 à 40 fois chez le poulet, entre 50 et 100 fois
pour les cellules de la peau humaine. Ces chiffres correspondent au nombre normal de mitoses

- Les lignées cellulaires : à la différence des cellules de culture secondaire, certaines

cellules ne sont pas limitées dans leur capacité à se reproduire et semblent pouvoir se perpétuer
indéfiniment. Ce sont par exemple des cellules tumorales, telles les cellules Hela, ou des
cellules mutées, comme la lignée 3T3 de souris. Toutes ces cellules présentent des anomalies
génomiques. Les cellules Hela comptent de 70 à 80 chromosomes au lieu des 46 normaux et
les 3T3 de souris en ont 65 au lieu de 40. De même que la mutation 3T3, le phénotype cancéreux
permet une meilleure adaptation à la croissance en culture. Le fait de posséder davantage de
chromosomes est apparemment un avantage dans les conditions de la culture in vitro.

3- L

3.1. Les différents types de cellules

On distingue trois types de cellules : fibroblastes, neurones et cellules musculaires

- Les fibroblastes
correspondent pas seulement à des cellules du tissu conjonctif, mais sont également capables
de se différencier en cellules musculaires lisses, en adipocytes en cellules conjonctives, en

113
cellules gliales, en chondrocytes ou en ostéocytes. Ce sont les signaux reçus du milieu extérieur
qui déterminent vers quel type de cellule le fibroblaste évoluera. La transformation en un type
; pa
fibroblaste en adipocyte est réversible.

- Les neurones : il en existe deux types : les neurones multipolaires et les neurones
bipolaires. Les neurones bipolaires ont un soma arrondi et ovale et possèdent deux neurites
or

croissance, le NGF. Quant aux neurones multipolaires ils ont un soma arrondi et lobé et de
nombreux neurites.

- Les cellules musculaires : elles forment de longs cordons contenant plusieurs noyaux
(syncytium). Elles résultent de mitoses sans cytodiérèse.

3.2. La différentiation obtenue

La différentiation obtenue dépend de deux facteurs

- Qualité du milieu

Dans le milieu enrichi en sérum (10%), on observe un important développement des

fibroblastes, qui envahissent la culture aux dépens des autres catégories cellulaires. Dans un
milieu moins riche en sérum (2,5%), les neurones moins concurrencés se développent
davantage.

-
-10
certains types cellulaires peuvent proliférer en
culture (les cellules cutanées, par exemple)

3.3. Le mode de vie des fibroblastes

114
 - Colonisation de flacons de culture

rès
quelques jours de culture, on peut observer leur évolution.

- La locomotion du fibroblaste

Le fibroblaste rampe à la surface du flacon de culture. Il émet continuellement des

lamellipodes et des spicules à partir de son bord antérieur. Certains spicules adhèrent au flacon,

lamellipodes et spicules dans les zones étirées. Les deux lamellipodes entrent alors en conflit.
Celui qui exerce la traction la moins forte se décolle de la surface et seul subsiste le lamellipode
le mieux ancré qui formera le bord avant de la cellule devenue polarisée. Si la surface de
déplacement est uniforme et plane, la direction du mouvement sera déterminée par le hasard ;
en revanche, si la surface comporte un gradient de molécules adhésives, les caractéristiques de
mission des lamellipodes et des spicules, qui se comporteront
alors comme des palpeurs.

Le déplacement du fibroblaste comprend trois actions distinctes :

- ;
- Ce bord se fixe à la surface ;
- Une fois fixé ce bord doit attirer à lui le reste de la cellule

tous parfaitement élucidés. Plusieurs éléments interviennent dans le processus de déplacement

des fibroblastes : des m

: on parle
alors d

- La sécrétion de la matrice extracellulaire

115
 Les matrices extracellulaires telles que les lames basales, les os et les cartilages sont des
secrétions cellulaires disposés en strates complexes de collagènes, de glycosaminoglycannes,
protéoglycannes et de glycoprotéines. Cette matrice agit par rétroaction sur le comportement
de nombreux cellules quelle entoure, influant sur leur forme, leur position, leurs métabolismes,
leur état de différentiation et de leur division. Une des protéines les plus étudiées est la

matrices extracellulaires. Les fibroblastes migrateurs déposent des protéines de la matrice

extracellulaire sur le fond du flacon et oriente ainsi la progression des autres cellules.
- La mitose

les cellules cancéreuses ou certaines lignées cellulaires échappent à cette contrainte. La nature
de cette relation entre prolifération et adhérence demeure inconnue. On peut en proposer un
model spéculatif
interviennent : nutriments, facteurs de croissance, densité des cellules. Paradoxalement, lorsque
la cellule entre en mitose elle se décolle presque totalement de son substrat pour adopter une

support.

VI- LES APPLICATIONS DE LA CULTURE CELLULAIRE

sont illustrées :

1.

La peau est constituée de différents types cellulaires dont les Kératinocytes, qui constituent

leur cytoplasme sous forme de filaments. En proliférant ces cell

supérieures meurent constituant la couche cornée, qui desquame en suite. In vivo, les
Kératinocytes se multiplient lentement
de la couche basale atteigne la surface de

Les Kératinocytes sont obtenus en faisant agir de la trypsine sur une biopsie cutanée. On
parvient à cultiver ces Kératinocytes in vitro en les installant dans des flacons recouverts de

116
fibroblastes de souris irradiés qui fournissent les protéines comme support et les facteurs
nécessaires à la prolifération de ces cellules. Seules 1 à 10% des cellules prélevées prolifèrent.
Après transfert de ces cellules dans de nouveaux flacons, 70% des colonies se développent
rapidement et on obtient ainsi une multiplication cellulaire beaucoup plus rapide que dans
ations.

rme de 3 cm2, qui en trois ou quatre

2
. 50% des greffons reprennent peu à peu les catégories
épiderme cultivé, viennent le coloniser. On traite aussi avec ces
cultures les ulcères cutanés chroniques des jambes fréquents chez les personnes âgées
diabétiques ou atteintes de difficultés circulatoires.

2. Produire des molécules thérapeutiques

La cult
en thérapeutique : interféron (substance antivirale), anticorps monoclonaux (inhibiteurs
spécifiques), urokinase (enzyme produite par les cellules rénales et dissolvant les caillots). Il
est intéressant de fabriquer industriellement des substances en grande quantité. Ces molécules
peuvent être obtenues par génie génétique, en transformant les bactéries ou des levures ;
jours possible. Il est alors intéressant
de récupérer ses substances en cultivant les cellules qui les produisent normalement. Les
bactéries et les levures sont les cellules les plus utilisées dans ce domaine. De petites tailles,
ulaire résistante, ayant des besoins alimentaires simples, on peut les
cultiver aisément en suspension dans des fermenteurs dont la capacité peut atteindre 200.000
litres. Naturellement, il en va tout autrement des cellules de Mammifères. Bien plus grandes,
nécessitant un support, fragile car limité par une simple membrane plasmique, ayant besoin

industrielle pose de nombreux problèmes.

On peut cultiver en fermenteur des cellules issues de lignées capable de vivre en suspension
dans le milieu, mais tous les types cellulaires ne se prêtent pas à la culture en suspension. La
culture sur micro support (constitués de billes de dextrane, polymère naturel du glucose, sur les

117
brassage, les collisions entre brilles tuent certaines cellules.

En revanche, les bioréacteurs à perfusion et à fibres creuses répondent à toutes les exigences de
la culture industrielle. Les cellules adhèrent aux aspérités des fibres creuses qui offrent une

organisme, où tous les nutriments sont sans

cesse renouvelés. Après induction dans la synthèse, le produit recherché est récupéré dans le
milieu de culture ayant séjourné au contact des cellules.

CONCLUSION

Les organismes vivants pris dans leur totalité sont des structures très complexes et très

le reste ne vienne perturber les résultats. Les cultures ce

tissu voire une cellule selon les besoins. Les cultures ne sont pas la panacée pour le biologiste.
même une cellule constitue un système complexe hautement intégré
qui peut perturber le paramètre étudié. La découverte chez l'animal adulte de cellules souches
pouvant contribuer, de façon transitoire ou permanente, à la réparation de tissus comme ceux
du foie, du muscle, du pancréas et du cerveau est une avancée majeure. Si ces données étaient
transposables à l'homme, elles pourraient inaugurer un changement considérable dans notre
attitude thérapeutique pour nombre de pathologies face auxquelles nous sommes actuellement
démunis compte tenu des limites ou des impossibilités d'une transplantation d'organe. Il n'est

afin de déterminer rapidement, dans des programmes de recherche fondamentale, la portée

médicale de ces observations, faites en grande partie chez l'animal et dont toutes n'ont pas été
confirmées chez l'homme.

118