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    Chap 4

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    Ce document décrit les conditions nécessaires pour cultiver des cellules in vitro, notamment la composition des milieux de culture, les équipements utilisés comme les boîtes de Pétri et les étuves, et les procédures pour maintenir un environnement stérile.

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    Chapitre 4

    Le milieu de culture et les


    conditions de culture
    1/ Principe de la culture cellulaire

    1.1. Définition

    - C’est une technique de laboratoire pour faire


    vivre des cellules in vitro
    - C’est le prélèvement de cellules, d'un animal ou
    d'une plante et leur placement ultérieur dans un
    environnement artificiel conduisant à leur croissance
    - Le but est de multiplier des cellules ou de les
    maintenir vivantes pour les utiliser
    1.2. Intérêts

    - Matériel en grande quantité


    - Conservation des caractéristiques du tissu initial
    - Homogénéité des cellules
    - Contrôle de l’environnement et de traitements appliqués
    - Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire
    - Pour la production de:
    • Vaccins
    • Protéines thérapeutiques (anticorps, agents
    immunologiques, Hormones)
    • Tissus
    • Vecteurs viraux
    • Cellules souches
    2/ Composition des milieux de culture

    2.1. Le sérum

    • Essentiellement sérum de veau fœtal (SVF)


    • L’addition de sérum est nécessaire et suffisante à la
    croissance des cellules in vitro
    2.2. Les milieux de culture synthétiques

     Composants conservés et pesés en atmosphère contrôlée

     Qualité primordiale
    - Filtration
    - Désionisation
    - Distillation
    - Stockage A -80°C dans des récipients en inox
    Refroidissement à 20°C au moment de l’utilisation

     Mélange des constituants


    Dissous séparément et mélangés dans l’ordre spécifié
    Conformité aux normes du pH et de l’osmolarité

     Taille des lots


    Varie de 3 à 2000 L

     Filtration stérilisante et mise en bouteille


    Filtres de 0,15 μm, sous hottes à flux laminaire
     Les milieux en poudre
    Secteur de production où humidité et température
    sont contrôlés

     Analyses physico-chimiques
    Osmolarité et pH

     Tests microbiologiques
    En milieux liquides pendant 2 semaines

     Tests de cytotoxicité et de croissance


    Cellules adhérentes et en suspension
    2.3. Les solutions salines équilibrées

     Exemples : PBS, HEPES, solutions d’enzymes…

     Constituants :
    -Enzymes
    Trypsine: décollement des cellules adhérentes
    -Aminoacides et vitamines
    Essentiels et non-essentiels
    - Tampons
    Fluctuations du pH dues au métabolisme
    HEPES le plus utilisé
    2.4. Les solutions antibiotiques et antimycosiques

    Rattrapage délicat des cultures contaminées


    2.5. Facteurs de croissance et d’attachement

    Peuvent être nécessaires pour certaines lignées

    Exemples
    Hormones, éléments-traces, vitamines
    Insuline, transferrine, sélénium: réduction de la
    concentration en SVF
    Cytokines, lymphokines
    Fibronectine, vitronectine
    3/ Conditions de culture

    3.1. Matériel
    Il existe 2 sortes de flacons de culture :
    - Boite de Pétri : Ce sont des boites avec des couvercles qui
    s'ouvrent et permettent des manipulations rapides mais ce
    n'est pas ce qu'il y a de plus propre et stérile. On s'en sert
    quand de faire des manipulations rapides sur beaucoup
    d'échantillons.
    - Flacons : L'intérêt est qu'il y a un bouchon avec au bout un
    filtre qui permet de laisser entrer l'O2 et CO2 dans les
    cellules mais ne laisse pas passer les bactéries et du coup on
    peut laisser pousser les cellules tranquillement sans être
    contaminées par les fluides qui vont être sous la hotte.
    3.2. Manipulations en milieu stérile

    On travaille toujours sous des hottes à flux laminaire, l'intérêt est


    que c'est de l'air stérile qui circule donc déjà ça permet de
    nettoyer les bactéries, virus en suspension... pour ne pas
    contaminer les cellules mais aussi de protéger l'utilisateur.
    3.3. Etuve

     Enceinte de culture a 37°C

     Milieu humide pour pas que le milieu qui est dans la


    boite s'évapore et que les cellule se déshydrate (5cm
    d'eau dans le fond de l‘étuve et pour éviter une source
    de contamination la paroi est en cuivre = antiseptique

     L’air est enrichi de 5% de CO2 qui permet le maintien


    du pH des cellules à 7,2 sinon en moins de 24h les
    cellules meurt
    En résumé, les conditions de culture :

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