Exploration biochimique de l’hémoglobine

Introduction

❖ Définition
L'hémoglobine est un pigment de coloration rouge contenu dans les globules rouges (hématies)
et permettant le transport des gaz respiratoires des poumons vers les tissus ou inversement.
L’hémoglobine est une protéine classée
- de par ses propriétés dans les chromoprotéines,
- de par sa structure dans les hétéroprotéines (protéines contenant des acides aminés et un
groupement non protéique, l’hème contenant lui-même un atome de fer, ce qui en fait
une hémoprotéine).
❖ Intérêts :
– Une des premières protéines dont la masse moléculaire a été déterminée avec
précision
– Première protéine a être associée à une fonction : le transport des gaz
respiratoires (oxygène et gaz carbonique) entre les poumons et les tissus
– Première protéine qui permet de démontrer qu'une mutation ponctuelle
provoque une maladie : exemple de la drépanocytose
– Anthropogénétique : certaines hémoglobines sont des marqueurs d’origine des
populations,
– Technique : différentes méthodes ont été mises en place pour identifier et étudier
l’hémoglobine (tests de solubilité, électrophorèse, focalisation isoélectrique IEF,
chromatographie liquide de haute performance HPLC, biologie moléculaire)

1. Rappels
1.1. Structure de l’hémoglobine
L’hémoglobine est une molécule à structure quaternaire formée de 4 sous-unités ou protomères
presque identiques, identiques deux à deux en réalité.
Sa masse moléculaire est de 64458 daltons.
Chaque sous-unité est constituée d’une chaîne polypeptidique, la globine et un groupement
prosthétique non protidique, l’hème contenant un atome de fer.

1.1.1. La globine
Chaque chaîne de globine de l’hémoglobine a la structure de la molécule de myoglobine (la
myoglobine est une protéine transporteuse d’oxygène, fonctionnellement identique à
l’hémoglobine, mais constituée d’une seule sous-unité) : formée de huit hélices α séparées par
des segments non hélicoïdaux : chacune de ces structures (hélices) est désignée par une lettre
capitale : A, B, C, D, E, F, G, H. Les acides aminés de la myoglobine ou de l’hémoglobine sont
désignés par la lettre de l’hélice à laquelle ils appartiennent et par leur rang dans la structure
primaire de cette hélice : exemple l’Arg H23 est le 23ème acide aminé de l’hélice H à
l’extrémité COOH terminale des sous-unités.
En se repliant la chaîne de globine ménage une poche sur le côté pour loger l’hème.

Figure 1 : structure de la myoglobine et des chaînes de globine de l’hémoglobine

1.1.2. L’hème

L’hème a une structure aromatique ou porphyrine (protoporphyrine IX). Il est constitué de

quatre noyaux pyrrol (l’hème est dit tétrapyrrolique), comprenant chacun un atome d’azote et
4 de carbone. Les 4 noyaux sont reliés par 4 ponts méthényles. Les carbones périphériques de
ces noyaux sont substitués par des chaînes latérales courtes qui lient la porphyrine aux radicaux
des acides aminés de la protéine. On retrouve 3 types de substituants :
- quatre (4) méthyle (CH3)
- deux (2) vinyle (CH2=CH-)
- deux (2) propionate COO--CH2-CH2-
Au centre de la porphyrine, l’atome de fer est lié par six valences (on le dit hexacoordiné).
Quatre (4) de ces directions fixent le fer sur les 4 atomes d’azote de la porphyrine. Une valence

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du fer est liée à un des azotes d’une histidine de l’hélice F (His proximale), et la dernière à une
histidine de l’hélice E (His distale). Le fer est toujours à état réduit Fe2+ dans l’hémoglobine.

Cette structure peut recevoir une molécule d’oxygène (O2). Lors de la fixation de l’oxygène,
l’atome de fer se rapproche de l’histidine proximale. L’oxygène transporté s’interpose entre
l’atome de fer et l’His distale.

Le noyau hème est situé dans une crevasse de la structure tertiaire, où les acides aminés sont
hydrophobes. Des liaisons hydrophobes et quelques liaisons électrostatiques lient la porphyrine
à la chaîne polypeptidique.

Figure 2 : structure de l’hème

1.1.3. organisation de la molécule d’hémoglobine

Quatre (4) chaînes de globine portant chacune une molécule d’hème (formant une sous-unité)
vont constituer l’hémoglobine. Celle-ci a deux types de chaînes de globine ou sous-unités :
- Deux sous-unités alpha (désignées par α1 et α2) de 141 acides aminés
- Deux sous-unités non alpha de 146 acides aminés. Elles sont de type β (bêta), γ
(gamma), δ (delta), ou ε (epsilon) définissant la forme d’hémoglobine.

Il se forme des dimères α1-nonα1 et α2- nonα 2 reliés par des liaisons hydrogènes solides.

3
Deux dimères se réunissent par des liaisons hydrogènes lâches entre α1 et nonα2 et entre nonα1
et α2.

L’ensemble du tétramère ménage une poche centrale appelée poche du 2-3 DPG
(diphosphoglycérate), ligand de l’hémoglobine qui modifie son affinité avec l’oxygène.

Figure 3 : les 4 sous-unités de l’hémoglobine et leur groupement prosthétique

1.1.4. Les différentes hémoglobines normales

En fonction de la nature de la chaîne non α, on obtient les hémoglobines normales suivantes :

- L’hémoglobine A ou A1 est l’hémoglobine adulte majoritaire (95%). Sa formule est
α2β2
- Une deuxième hémoglobine adulte est l’hémoglobine A2 formée de deux chaînes α et
de deux chaînes δ : α2δ2 (3%)
- Chez le fœtus et l’enfant on a l’hémoglobine fœtale : α2γ2 avec soit γ Ala ou γ Gly.
- Exception : chez l’embryon, l’hémoglobine est formée de deux fois deux chaînes
associées, pouvant ne pas contenir de chaîne α : Hb Gower 1 (ζ2ε2), Portland (ζ2γ2) ou
Gower 2 (α2ε2).

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 1.2. Fonctions de l’hémoglobine
1.2.1. Le transport de l’oxygène
1.2.1.1. Mécanisme
L'oxygène est insoluble dans l'eau et a besoin d’un transporteur dans le sang.
L’hémoglobine possède quatre sites de liaisons pour l’O2 grâce à ses 4 molécules d’hème qui
fixent chacune une molécule d’oxygène par une liaison réversible.
La fixation de l’O2 est une oxygénation et non une oxydation : on obtient de l’oxyhémoglobine
et non un oxyde d’hémoglobine.
L’oxygène est transporté des poumons vers les tissus.
La liaison de l’hémoglobine à l’oxygène dépend de la pression partielle en oxygène du milieu.
La courbe de saturation de l’hémoglobine par l’oxygène est sigmoïde contrairement à celle de
la myoglobine qui est une hyperbole. Ces deux courbes sont caractérisées par leur P50 qui
correspond à la pression à laquelle la moitié des sites de l’hémoglobine ou de la myoglobine est
occupée par l'O2.

Figure 4 : courbes de saturation de l’hémoglobine et de la myoglobine

Une courbe de dissociation sigmoïdale est une indication d'interaction coopérative entre les
sites de liaison d'une protéine pour un ligand. La liaison de l'O2 augmente l'affinité de
l'hémoglobine pour la liaison de molécules d'O2 supplémentaires (coopérativité positive ou
effet homotrope positif de fixation d'O2).

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La coopérativité de l’hémoglobine est liée à l’existence de deux formes possibles de la
molécule, d’affinité différente pour l’oxygène :

- Une forme tendue T ("tense") qui fixe difficilement l’oxygène,

- Une forme relâchée R ("relaxe") qui fixe plus facilement l’oxygène.

La désoxyhémoglobine est sous forme T. Les premières molécules d’oxygène s’y fixent
extrêmement difficilement mais une fois fixées, celles-ci vont favoriser la transition de la forme
T à la forme R plus favorable à la fixation de l’oxygène. Tout se passe comme si les premières
molécules d’oxygène recrutent les molécules d’hémoglobine pour fixer encore plus d’oxygène :
c’est l’effet coopératif positif.

1.2.1.2. Modulateurs de l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène

❖ Influence du 2,3 DPG (BPG) sur la liaison d'O2
L’hémoglobine purifiée (nue) a une affinité plus grande pour l'O2 que l’hémoglobine du sang
complet. La présence du D-2,3-bisphosphoglycérate (BPG) diminue l'affinité de l'hémoglobine
pour l'O2.
Le BPG diminue l'affinité de l’hémoglobine pour l'O2 en la maintenant dans la conformation
désoxy. La p50 de l’hémoglobine nue augmente de 12 à 22 mmHg en présence de BPG 4,7 mM,
sa concentration normale dans des érythrocytes et identique à celle de l'hémoglobine (complexe
1:1)
En absence de BPG, seule une faible quantité d'O2 est libérée dans les tissus

Figure 5 : effet du BPG sur la saturation de l’hémoglobine en oxygène

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L'augmentation des teneurs en BPG est en partie responsable de l'adaptation en haute altitude.
L'adaptation en haute altitude :
– implique une augmentation du nombre d'érythrocytes et de la teneur en hémoglobine
– est due à une augmentation rapide de la concentration en BPG érythrocytaire.
L’hémoglobine fœtale a une faible affinité pour le BPG : le BPG se lie avec moins d'affinité à
la désoxy HbF (22) qu’à la désoxy HbA maternelle.

1.2.2. Transport du dioxyde de carbone et effet Bohr

L'effet Bohr est la diminution de l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène (O2) lors d'une
augmentation de la pression partielle en dioxyde de carbone (CO2) ou d'une diminution de pH.
L'effet Bohr facilite le transfert de l’O2 et le transport du CO2.
CO2 + H2O ➔ H+ + HCO3-
Dans les tissus où la p02 est basse, les H+ issus de la formation du bicarbonate sont captés par
l'hémoglobine qui libère son O2. Ces protons captés facilitent le transport du CO2 (fixation du
CO2 à l’extrémité N-terminal sous forme de carbamates) en stimulant la formation du
bicarbonate. Dans les poumons, où la p02 est élevée, la liaison de l'O2 par l'hémoglobine libère
les protons captés précédemment, ce qui provoque le départ du CO2.
L'effet Bohr assure un apport d’O2 supplémentaire à des muscles en activité intense. De tels
muscles s'acidifient et abaissent le pH du sang de 7,4 à 7,2. Par conséquent, l'hémoglobine libère
environ 10% d’O2 de plus qu'à pH 7,4.

Figure 6 : effet du pH sur la saturation de l’hémoglobine en oxygène

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2. Anomalies de l’hémoglobine

On appelle anomalies de l’hémoglobine, tout défaut de structure ou de synthèse de la molécule

d’hémoglobine.

Ce sont des maladies génétiques, transmises à la descendance.

Les anomalies de l’hémoglobine se répartissent en deux grands groupes :
o les anomalies de structure de la protéine
o les anomalies de synthèse des chaînes de globine
Les deux types d’anomalies peuvent être intriqués : ce sont par exemple les syndromes thalasso-
drépanocytaires.
Toutes les anomalies génétiques de l’hémoglobine sont appelées hémoglobinopathies. Parmi
elles, les anomalies qualitatives (de structure) sont des hémoglobinoses tandis que les
anomalies quantitatives (de synthèse) sont des thalassémies.

2.1. Les anomalies de structure ou hémoglobinoses

Anomalies portant sur les gènes de structure : entraînent un trouble qualitatif de la synthèse de
l’Hb, ce sont les hémoglobinopathies qui sont caractérisées par :
- une mutation d’un gène de structure.
- avec substitution d’un AA dans la chaîne de globine qui est synthétisé en quantité
normale mais fonctionnellement anormale (pas toujours).
- L’anomalie hémoglobinique est l’apparition d’une hémoglobine pathologique qui se
distingue des hémoglobines normales par une modification structurale affectant
certaines chaînes polypeptidiques de l’hémoglobine.
- Les anomalies les plus fréquentes affectent les chaînes polypeptidiques bêta, plus
rarement les chaînes alpha, exceptionnellement les chaînes gamma ou delta.
- La modification la plus habituelle est la substitution d’un acide aminé de la chaîne par
un autre acide aminé.
- C’est ainsi que dans les trois hémoglobinopathies à diffusion mondiale, la
drépanocytose, l’hémoglobinose C et l’hémoglobinose E, l’anomalie structurale est la
substitution d’un seul acide aminé des chaînes bêta de l’hémoglobine A par un autre
acide aminé.

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 Tableau 1 : Quelques hémoglobines anormales
Hémoglobine Position de l’AA Substitution Mutation
anormale substitué
S 6(A3) Glu->Val GAG->GTG
C 6(A3) Glu->Lys GAG->AAG
E 26(B8) Glu->Lys GAG->AAG
O-Arab 121(GH4) Glu->Lys GAA->AAA
J-Lomé 59(E3) Lys->Asn (AAG->AAC or AAT)
Cocody 21(B3) Asp->Asn (GAT->AAT)
Henri Mondor 26(B8) Glu->Val (GAG->GTG)
Créteil 89(F5) Ser->Asn (AGT->AAT)
Korle-Bu 73(E17) Asp->Asn (GAT->AAT)

2.2. Les anomalies de synthèse ou thalassémie

• Rappel sur les gènes de l’hémoglobine
Les chaînes de type α correspondent à des chaînes polypeptidiques de 141 résidus dont la
synthèse est sous le contrôle de gènes situés sur le chromosome 16.
Les chaînes de type β (auxquelles se rattachent les chaînes γ, δ et ε) comportent 146 résidus et
dépendent de gènes situés sur le chromosome 11.
L’organisation des familles des gènes de globine est présentée schématiquement figure 7. Leur
expression est coordonnée précisément pour aboutir à une synthèse équivalente des gènes de la
famille α et de la famille β, tout déséquilibre se traduisant par un syndrome thalassémique.

Figure 7 : structure et organisation schématique des deux familles de gènes de globine.

Les gènes sont organisés de 5’ en 3’ selon leur ordre d’expression au cours du développement

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 • Les anomalies de synthèse
Les anomalies de synthèse sont des anomalies portant sur les gènes régulateurs : entraînent des
troubles quantitatifs de l’Hb, ce sont les thalassémies qui se caractérisent par :
- une insuffisance de production d’un type de chaîne.
- avec augmentation relative des autres chaînes normalement synthétisées.
- et augmentation importante de la production des chaînes normalement absentes (γ)
L’anomalie hémoglobinique est l’inhibition de la synthèse de certaines chaînes polypeptidiques
de l'hémoglobine.
Un mécanisme compensateur apparaît, tendant à pallier la synthèse insuffisante par une
élaboration accrue des autres chaînes polypeptidiques.
Quand la diminution de la synthèse affecte les chaînes bêta, le mécanisme compensateur est
représenté par une élaboration accrue des chaînes gamma et delta, d’où l’augmentation des
hémoglobines F et A2.
Quand la perturbation affecte les chaînes alpha, la compensation ne peut se faire que par
l’apparition de tétramères à un seul type de chaînes : hémoglobine H de structure bêta 4 et
hémoglobine Bart’s de structure gamma 4, hémoglobines qui n'existent pas chez le sujet normal.
L'anomalie quantitative de la synthèse des chaînes polypeptidiques entraîne une altération de
l’hématie par précipitation intra globulaire des chaînes alpha libres dans la β-thalassémie, des
fractions bêta 4 et gamma 4 qui sont des fractions instables dans l’α-thalassémie.

• Les principales anomalies quantitatives

– β-thalassémie : présence constante d’un pourcentage élevé d’hémoglobine F,
d’hémoglobine A2, et absence (β°thal avec inhibition des deux gènes β ) ou présence (β+thal
avec inhibition d’un seul gène β) d’hémoglobine A1
– α-thalassémie : seule la délétion des 4 gènes est incompatible avec la vie
– persistance héréditaire de l’hémoglobine fœtale (PHHF) : un groupe d’affections
caractérisées chez l’homozygote par la production exclusive d’hémoglobine F, sans aucune
conséquence clinique, ni hématologique sérieuse.

3. Exploration des anomalies de l’hémoglobine

Le diagnostic au labo de biochimie se fait par les techniques suivantes :
• Électrophorèse de zone à pH alcalin (cellulose) ou électrophorèse capillaire
• Électrophorèse à pH acide (agar)
• Focalisation iso-électrique (polyacrylamide)

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 • Électrophorèse des chaînes de globine en milieu dissociant : urée 6M à pH 6 et 9
• Quantification des Hb en HPLC
• Biologie moléculaire : étude des gènes de globine

3.1. Electrophorèse a pH alcalin

Séparation des différentes formes d’hémoglobine dans un champ électrique en fonction de leur
charge électrique dans un tampon à pH alcalin où les hémoglobines se comporteront comme
des acides avec charge négative.
Dépôt de l’échantillon à analyser du côté de la cathode pour les voir migrer vers l’anode.

Figure 8 : positions des hémoglobines les plus fréquentes à l’électrophorèse à pH alcalin

NB. L’électrophorèse capillaire tend à devenir une technique de choix de première intention
pour l’étude de l’hémoglobine. Elle est :
- Rapide
- Automatisée
- Performances satisfaisantes pour doser les fractions mineures, HbA2 et HbF
- Bonne résolution : à l’écran, en plaçant le curseur sur le pic anormal, le logiciel
indique pour chaque zone définie par le constructeur, une liste de variants potentiels.

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 3.2. Electrophorèse a ph acide

HBA1
HbA2
HbD
HbC HbS HbE HbF

+ -

Électrophorégramme sur agar, pH 6,0

Origine

Figure 9 : positions des hémoglobines les plus fréquentes à l’électrophorèse à pH acide

3.3. Isoélectrofocalisation
Avant l’âge de 3 mois, la présence majoritaire d’HbF diminue fortement la sensibilité de
l’électrophorèse à pH alcalin qu’il faut remplacer impérativement par une isoélectrofocalisation
complétée d’une électrophorèse sur agar à pH acide ou une chromatographie CLHP pour
quantification et identification.

Figure 10 : Identification de variants de l'hémoglobine par isoélectrofocalisation

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 3.4. Chromatographie liquide de haute performance (HPLC)

Figure 11 : Profil de rétention de variants de l'hémoglobine par HPLC

3.5. Les tests complémentaires

• Test de solubilité de l’HbS

Le test d’Itano de solubilité de l’HbS est essentiel pour confirmer la présence d’HbS, et repose
sur le principe que seule l’HbS désoxygénée précipite : Hémoglobine S réduite par action de
l’hydrosulfite de sodium précipite dans une solution phosphate 2,24 M en comparaison avec
un témoin.

• Le test de falciformation (Test d’Emmel) peut être une alternative au test d’Itano. Il est
réalisé soit pour dépister l’Hb S ou pour compléter une électrophorèse à pH alcalin sur
échantillons migrant comme AS. Principe : à l’état désoxygéné (en présence de
métabisulfite de sodium à 2 %), les globules rouges contenant de l’Hb S sont
falciformés (en forme de faucille).
• Le dosage d’HbF est réalisable par CLHP (ou par électrophorèse capillaire) ou par la
technique de Betke de résistance à la dénaturation alcaline, méthode valide lorsque
l’HbF est < 15 %.

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