El Aziz, H

Mémoire du troisième cycle
ROYAUME DU MAROC
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Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II Rabat
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Mémoire du troisième cycle pour l’obtention du diplôme
d’Ingénieur d’Etat en Industries Agricoles et Alimentaires
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IDENTIFICATION MOLECULAIRE PAR AMPLIFICATION ET

SEQUENÇAGE DE L’ADN DES CHAMPIGNONS
FILAMENTEUX ISOLÉS DES MAÂSRAS AU MAROC
Présenté & soutenu publiquement par
Hakim EL AZIZ
Devant le Jury composé de
Pr. Moussa ETTALIBI (I.A.V Hassan II- RABAT) Président

Pr. Patrick BOIRON (FACULTÉ DE PHARMACIE – LYON) Rapporteur
Pr. Mustapha ISMAILI ALAOUI (I.A.V Hassan II- RABAT) Rapporteur
Dr. Sevastianos ROUSSOS (I.R.D - MARSEILLE) Rapporteur
Dr. Hervé MACARIE (I.R.D - MARSEILLE) Examinateur
Dr. Khadija LAMRANI (I.A.V Hassan II- RABAT) Examinateur
18 juillet 2005
Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II Rabat 10101 BP 6202 Rabat Instituts
Tel : 037 77 17 58/59 45 ou 037 77 07 92 Fax : 037 77 81 35 ou 037 77 58 38
‫‪Mémoire du troisième cycle‬‬
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Résumé
Le secteur oléicole bénéficie d’une importance cruciale sur le plan socio-économique

marocain. Ce secteur est caractérisé par l’abondance de moulins traditionnels de trituration
des olives appelés ‘Maâsra’. Les pratiques suivies lors de l’extraction de l’huile d’olive au
niveau des Maâsra, offrent des conditions propices pour le développement de moisissures sur
les olives, les grignons et les margines. Quelles sont ces moisissures ? Sommes-nous certains
de leur identification morphologique ? L’identification moléculaire permet-elle de compléter
l’identification morphologique ou de la remplacer?
A partir d’une collection de 134 souches de champignons filamenteux isolées des

Mâasras, 53 souches ont été choisies sur la base de critères morphologiques et culturaux
comme étant représentatives de la collection. D’abord, la technique de PCR a été utilisée pour
l’amplification de la région ITS de l’ADNr au biais de la paire d’amorces ITS1 (sens) et ITS4
(antisens). Ensuite, la région amplifiée a été séquencée en utilisant l’amorce ITS4. Les
chromatogrammes élaborés par le séquenceur automatique ont été analysés en utilisant le
logiciel Chromas afin d’obtenir des séquences exploitables. Enfin, les séquences obtenues ont
été soumises au logiciel Blast pour la recherche de séquences similaires. Suite à cette
recherche dans la banque de données génétiques GenBank, les noms de souches de
moisissures ont été classées de manière décroissante suivant le pourcentage de similarité de
leurs séquences avec la séquence de la souche d’intérêt.
Les techniques utilisées, largement appliquées pour l’identification des souches de

champignons filamenteux, nous ont permis d’identifier 37 souches appartenant aux genres :
Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Fusarium, Mucor, Rhizomucor, Galactomyces,
Ceratocystis, Dipodascus, Thanatephorus et Trichoderma. L’identification moléculaire du
genre fongique concorde chez 73 % des souches avec celle établie morphologiquement lors
des travaux précédents. Cependant la congruence entre l’espèce moléculaire et
morphologique, mérite d’être approfondie. En perspective, le problème de la fiabilité des
données relatives à certaines souches de moisissures figurant au niveau de GenBank justifie la
création d’une banque de données génétiques IAV-IRD utilisant des critères rigoureux pour
l’admission de séquences.
Mots clés : Huile d’olive, Maâsra, Maroc, moisissures, identification moléculaire, ADN,
PCR, ITS, électrophorèse, Séquençage, Banque de données génétiques.
Abstract
In Morocco, the olive oil sector is of utmost importance with regards to the socioeconomic
situation. The sector is dominated by traditional oil mills called "Maâsras". These small
grinding units are always characterized by a low level of technology and the non-compliance
with basic hygienic practices. These practices ensure favorable conditions to the growth of
moulds on olives, pomace and wastewater. What are these moulds? Are we sure of their
morphological identification? Can a molecular identification confirm or replace a given
morphological identification ?
From 134 filamentous fungal strains isolated from Maâsras, 53 strains were selected on the
basis of morphological and cultural criteria as being representative of the collection. Initially,
the PCR technique was carried out to amplify the ITS rDNA region by usingITS1 forward and
ITS4 reverse primers. The amplified PCR product was automatically sequenced using the
ITS4 primer. Then, sequence data were analyzed using Chromas software in order to obtain
exploitable sequences. Finally, processed sequences were subjected to similarity searches
against GenBank using Blast software. At the end of those searches, the obtained names of
mould strains were classified in a decreasing manner according to the percentage of similarity
of their sequences with that of the studied strain.
The techniques used, largely applied for the identification of filamentous fungi, enabled us to
identify 37 strains belonging to the genuses of : Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces,
Fusarium, Mucor, Rhizomucor, Galactomyces, Ceratocystis, Dipodascus, Thanatephorus et
Trichoderma. Molecular identification of the studied mould genuses is in agreement for 73 %
of strains with prior morphological data. However, similarity at the species level requires a
more in depth study. In prospect, the problem of the reliability of data relative to certain
mould strains appearing in GenBank justifies the creation of a IAV-IRD genetic data bank
using rigorous criteria for the admission of sequences.
Key words: Olive oil, Maâsra, Morocco, mould, molecular identification, DNA, PCR, ITS,
electrophoresis, sequencing, genetic databank.
Table des matières
Résumé ................................................................................................................... i
Abstract.................................................................................................................iv
Table des matières ................................................................................................. v
Liste des figures..................................................................................................viii
Liste des tableaux .................................................................................................xi
Liste des abréviations .........................................................................................xiii
Introduction générale............................................................................................. 1
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE.............................................................. 4
Chapitre I : Secteur Oléicole .............................................................................. 5
1- Situation oléicole mondiale................................................................................................ 6
1.1- Production d’huile d’olive .......................................................................................... 6
1.2- Consommation d’huile d’olives .................................................................................. 7
2- Situation nationale ............................................................................................................. 8
3- Maâsra : unité traditionnelle de trituration d’olive ............................................................ 9
3.1- Récolte des olives ..................................................................................................... 10
3.2- Stockage des olives ................................................................................................... 11
4- Contamination fongique naturelle des olives................................................................... 11
Chapitre II : Champignons Filamenteux et Identification Moléculaire ...... 14

I- Champignons filamenteux............................................................................... 14
1- Définition des champignons filamenteux........................................................................ 14
2- Classification des champignons filamenteux................................................................... 15
3- Conditions de développement des champignons filamenteux ......................................... 16
3.1- Eléments nutritifs ...................................................................................................... 16
3.2- Activité de l’eau du substrat...................................................................................... 16
3.3- Oxygène .................................................................................................................... 16
3.4- pH ............................................................................................................................. 16
3.5- Température de croissance ........................................................................................ 17
4- Mycotoxines..................................................................................................................... 18
II- Identification des champignons filamenteux ................................................. 20

1- Approche morphologique ................................................................................................ 20
2- Approche chimique .......................................................................................................... 21
3- Approche moléculaire ...................................................................................................... 22
III- Techniques de biologie moléculaire ............................................................. 23

1- Réaction de polymérisation en chaîne ............................................................................. 23
2- Variantes de PCR ............................................................................................................. 27
2.1- PCR nichée ou nested PCR...................................................................................... 27
2.2- Reverse Transcription PCR ...................................................................................... 27
2.3- PCR quantitative ....................................................................................................... 28
3- Analyse de Restriction Enzymatique et Polymorphisme de Taille des Fragments de
Restriction ....................................................................................................................... 31
4- Amplification Aléatoire de l’ADN Polymorphique......................................................... 33
5- Polymorphisme de Taille des Fragments Amplifiés ........................................................ 34
6- Polymorphisme de Conformation de l’ADN Simple Brin.............................................. 35
7- Séquençage ...................................................................................................................... 36
8- Microsatellites.................................................................................................................. 39
IV- Etude morphologique et moléculaire de quelques genres de moisissures .. 40

1- Aspergillus ....................................................................................................................... 40
1.1- Approche phénotypique ............................................................................................ 40
1.2- Approche moléculaire ............................................................................................... 42
2- Penicillium ....................................................................................................................... 43
3- Trichoderma..................................................................................................................... 46
Conclusion........................................................................................................... 49
MATERIELS ET METHODES ........................................................... 50
1- Nature et origine des souches .......................................................................................... 51
2- Culture des souches.......................................................................................................... 57
2.1- Entretien des souches ................................................................................................ 57
2.2- Production de la biomasse pour l’extraction de l’ADN............................................ 57
3- Extraction de l’ADN ........................................................................................................ 57
3.1- Micro-extraction au Chelex 100® ............................................................................ 58
3.2- Extraction à l’achromopeptidase............................................................................... 59
3.3- Extraction à l’eau ...................................................................................................... 59
4- Amplification de la région ITS par PCR......................................................................... 60
5- Contrôle de l’amplification sur gel d’électrophorèse....................................................... 62
6- Séquençage des produits d’amplification ........................................................................ 63
7- Analyse des séquences ..................................................................................................... 64
RESULTATS ET DISCUSSION ....................................................... 65

1- Culture des souches.......................................................................................................... 66
2- Extraction et amplification de l’ADN.............................................................................. 66
3- Analyse des séquences ..................................................................................................... 70
4- Discussion ........................................................................................................................ 99
Conclusion générale ...................................................................................... 10665

Références bibliographiques ............................................................................. 108
Liste des figures
Figure 1 : Principaux pays producteurs d’huile d’olive en 2003. ............................................ 6

Figure 2 : Principaux pays consommateurs d’huile d’olive en 2002. ...................................... 7
Figure 3 : Production et consommation d'huile d'olive dans le monde et dans l'Union
européenne. ................................................................................................................. 8
Figure 4 : Tendance de la production nationale d’olive (DPV, 2004). .................................... 8
Figure 5 : Tendance de la production nationale d’huile d’olive (DPV, 2004)......................... 9
Figure 6 : Maâsra traditionnelle ............................................................................................... 9
Figure 7 : La région ITS de l'ADN humain............................................................................ 23
Figure 8 : Courbe de la variation de la dénaturation de l’ADN en fonction de la température.
Définition de la température de fusion (Tm)............................................................. 24
Figure 9 : Principe de la PCR................................................................................................. 26
Figure 10 : LightCycler : Thermocycleur à PCR quantitative. ................................................ 29
Figure 11 : Utilisation de sondes fluorescentes pour la détection de l’ADN. .......................... 30
Figure 12 : Utilisation de fluorophore pour la détection de l’ADN. ........................................ 30
Figure 13 : Technique de Southern blot. .................................................................................. 32
Figure 14 : Profil d’amplification par RAPD d’ADN des souches de Penicillium utilisant deux
amorces différentes ; NS2 (a) et NS7 (b)………….…………………………… 34
Figure 15 : Schéma des différentes étapes de la méthode d’AFLP.......................................... 35

Figure 16 : Principe du séquençage de l'ADN ......................................................................... 37
Figure 17 : Lecture manuelle de la séquence d’ADN .............................................................. 38
Figure 18 : Chromatogramme du séquençage d'ADN représentant ......................................... 39
Figure 19 : Exploitation des microsatellites pour la différentiation des tissus sain (N) et des
tissus cancéreux (T)……………………………………………………………... 40
Figure 20 : Caractères morphologiques des structures asexuées des Aspergillus.................... 41

Figure 21 : Gel électrophorétique montrant le profil de restriction de certaines souches d’A.
fumigatus. ............................................................................................................... 42
Figure 22 : Caractères morphologiques des structures asexuées des Penicillium.................... 43
Figure 23 : Gel électrophorétique montrant le profil de restriction des souches de
Penicillium isolées des aliments……...…………………………………………..45
Figure 24 : Structures morphologiques de l’espèce Trichoderma viride. ................................ 47

Figure 25 : Southern blots de l’ADN des isolats de Trichoderma digéré par EcoRI et hybridé
avec la sonde de ADNmt de T. harzianum 2924 digéré par BamHI. A gauche, le
marqueur de poids moléculaire. Le N°25 correspond à la souche T. viride, les
autres N° sont ceux de T. harzianum...................................................................... 48
Figure 26 : Bain-marie à sec. ................................................................................................... 58
Figure 27 : Centrifugeuse, couvercle fermé (à gauche) et couvercle ouvert ( à droite) avec les
tubes d’Eppendorf 1,5 ml et tubes de PCR ‘Ready-To-GoTM PCR Beads’. ...... 59
Figure 28 : Emplacement des amorces ITS1 et ITS2............................................................... 60
Figure 29 : Thermocycleur pour l’amplification de l’ADN. .................................................... 61
Figure 30 : Cuve du gel d’agarose avec les traces de migration des fragments de l’ADN...... 62
Figure 31 : Installation d’électrophorèse.................................................................................. 62
Figure 32 : Installation de visualisation sous UV avec appareil de photographie ................... 63
Figure 33 : Séquence d'ADN traitée par le logiciel Chromas. ................................................ 64
Figure 34 : Culture des moisissures sur milieu Malt Extract Agar ‘MEA’.............................. 66
Figure 35 : Visualisation sous UV de la migration des bandes d'ADN sur le gel d'Agarose... 70
Figure 36 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNM 1............................. 71
Figure 37 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNM 9............................. 72
Figure 38 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNM 10........................... 73
Figure 40 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNT 15. ........................... 74
Figure 41 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNT 16. ........................... 75
Figure 44 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNM 102......................... 76
Figure 45 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNM 109......................... 77
Figure 46 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche H 17................................. 77
Figure 47 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche LOMY 1. ......................... 78
Figure 48 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche LOMY 367...................... 79
Figure 50 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche LOMY 794. ..................... 80

Figure 70 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche KLM 166......................... 96
Figure 73 : Interface du logiciel Chromas montrant. La partie de la séquence
à supprimer (à droite). .......................................................................................... 103
Figure 74 : Représentation schématique de la région ADNr avec les positions des nouvelles
amorces................................................................................................................. 103
Figure 75 : Arbre phylogénique réalisé avec l’algorithme du voisin le plus proche
(Neighbor Joining) et basé sur l’analyse de la séquence de la région ITS de la
souche LOMY 807 et les séquences de ses voisins les plus proche provenant
de GENBANK. Les chiffres indiquent la valeur de boostrap de chaque nœud. . .103
Figure 76 : Amplification de l’ADN de quelques espèces de Penicillium et d’E. coli révélée
sur gel d’agarose................................................................................................... 105
Liste des tableaux

Tableau 1 : Identification du genre de moisissures isolées (à 25°C) des échantillons prélevés
de maâsras. ............................................................................................................. 12
Tableau 2: Classification simplifiée des champignons ............................................................ 15
Tableau 3: Classification des champignons en fonction de leurs températures cardinales de
croissance. .............................................................................................................. 17
Tableau 4: Souches utilisées dans l’étude des Penicillium isolées à partir des aliments. ........ 44
Tableau 5: séquences d’amorces .............................................................................................. 45
Tableau 6: Liste des souches isolées par Salih et al., (2004). .................................................. 51
Tableau 7 : Liste des souches isolées par Zaouia et al., (2004). ............................................. 53
Tableau 8: Liste des souches de la collection IAV Hassan II – IRD de Marseille. ................. 55
Tableau 9: Résultats d’amplification de l’ADN en fonction de la méthode d’extraction
utilisée. ................................................................................................................... 68
Tableau 10: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 1. .................... 71
Tableau 11: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 9. .................... 72
Tableau 12: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 10. .................. 72
Tableau 15: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNT 16..................... 75
Tableau 18: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 102. ................ 76
Tableau 19: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 109. ................ 77
Tableau 20: Identification morphologique et moléculaire de la souche H 17. ........................ 77
Tableau 21: Identification morphologique et moléculaire de la souche LOMY 1................... 78
Tableau 22: Identification morphologique et moléculaire de la souche LOMY 367............... 78

Tableau 37: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 89 ................... 90
Tableau 44: Identification morphologique et moléculaire de la souche KLM 166. ................ 96
Tableau 46 : Identification morphologique et moléculaire de la souche LOMY 786.............. 98
Tableau 47: Résultats d’identification moléculaire des souches regroupées par genre. .......... 99
Liste des abréviations
A. : Aspergillus.
ADN : Acide désoxyribonucléique.
ADNc : ADN complémentaire.
ADNr : ADN ribosomal.
AFLP : Polymorphisme de Taille des Fragments Amplifiés ‘Amplified Fragments
Length Polymorphism’.
ARNm : Acide ribonucléique messager.
ARNr : ARN ribosomal.
ATCC : American Type Culture Collection.
aw : Activité de l’eau.
CIP : Collection de l’Institut Pasteur.
CNUCED : Conférence des Nations Unies pour le Commerce et le Développement.
dATP : Désoxyadénosine-Tri-Phosphates
dCTP : Désoxycytosine-Tri-Phosphates
ddNTP : didésoxyribonucléoside.
dGTP : Désoxyguanosine-Tri-Phosphates
dNTP : DésoxyNucléosides-Tri-Phosphates
DPV : Direction de Production Végétale, Ministère de l’Agriculture et du
Développement Rural. Rabat. Maroc.
DSMZ : Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh.
dTTP : Désoxythymine-Tri-Phosphates
F. : Fusarium.
IAV : Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II.
IRD : Institut de Recherche pour le Développement.
ITS : Espaceurs Internes Transcrits ‘Internal Transcribed Spacer’.
JCM : Japan Collection of Microorganisms.
PCR : Réaction de polymérisation en chaîne ‘Polymerase Chaine Reaction’.
PNTTA : Programme National de Transfert de Technologie en Agriculture.
PRAD : Programme de Recherche Agronomique pour le Développement.
p/v : Poids sur volume.
QBM : Qualité Biologie Moléculaire.
RAPD : Amplification Aléatoire de l’ADN Polymorphique ‘Randomly Amplified
Polymorphic DNA’.
REA : Analyse de Restriction Enzymatique ‘Restriction Enzym Analysis’.
RFLP : Polymorphisme de Taille des Fragments de Restriction ‘Restriction Fragment
Length Polymorphism’.
RT-PCR : Transcription inverse PCR ‘Reverse Transcription PCR’.
SSCP : Polymorphisme de Conformation de l’ADN Simple Brin ‘Single Straind
conformationnal Polymorphism’.
Tm : Température de fusion.
Introduction générale
Pour terminer ma formation d’ingénieur en Industries Agricoles et Alimentaires au

sein de l’Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II ‘IAV Hassan II’ de Rabat, et
contribuer au développement du secteur oléicole marocain, j’ai effectué un travail de mémoire
de fin d’étude sur : « Identification moléculaire par amplification et séquençage d’ADN des
champignons filamenteux isolées des ‘Maâsra’ au Maroc».
Le secteur oléicole revêt une grande importance socio-économique pour le Maroc. Or,
la promotion de cette filière est jonchée d’obstacles d’ordre climatique (l'irrégularité de la
pluviométrie), physiologique (le phénomène d'alternance) et technique (outils traditionnels et
rudimentaires). L’utilisation de la méthode du gaulage pour la récolte des olives, la
manutention et le stockage inadéquats en vrac ou en sacs en vue de l’extraction de l’huile au
niveau des unités traditionnelles de trituration des olives ‘Maâsra’ sont des conditions
propices au le développement de moisissures. D’où la probabilité significative de l’existence
de mycotoxines aussi bien dans l’huile que dans les grignons rendant ainsi impropre voire
même périlleuse leur consommation respective par l’Homme et par le bétail.
Le travail qui nous a été confié entre dans le cadre d’un Projet de Recherche
Agronomique pour le Développement (PRAD). L’acronyme choisi « Moisi ZérO » pour
désigner ce projet de recherche est composé de trois mots : Moisissures Zéro dans les Olives.
Il y a trois objectifs à atteindre dans ce projet : (1) Réaliser un travail scientifique orienté vers
l’identification classique et moléculaire des moisissures nuisibles et de leurs mycotoxines
présentes dans les maâsras, empêcher la prolifération de ces moisissures et contribuer à un
développement durable du secteur oléicole marocain. (2) Former par la recherche une jeune
équipe marocaine sur les techniques modernes de biologie moléculaire pour l’identification et
la détection des moisissures nuisibles. (3) Organiser au Maroc en 2004 un congrès
international sur « Biotechnologie et Qualité pour le développement de la culture de l’olivier
(OliveBioteQ-2004) ».
Durant les trois précédentes années du projet, de jeunes chercheurs marocains ont isolé
des souches de moisissures mésophiles et thermophiles productrices de mycotoxines. Elles
appartiennent principalement aux genres Aspergillus, Fusarium et Penicillium. Les souches
1
isolées ont aussi un intérêt biotechnologique puisqu’elles se sont révélées productrices

d’enzymes telles que les phytases , les tannases et les lipases.
L’objectif de ce travail qui entre dans le cadre des projets PRAD (04/16) et (02/13), est
d’identifier par voie de biologie moléculaire les souches de champignons filamenteux qui ont
été identifiées morphologiquement en 2003, 2004 et 2005, dans le cadre du projet PRAD
(04/15) par l’équipe de recherche de IAV Hassan II et de l’Institut de Recherche pour le
Développement ‘IRD’ de Marseille (Kammas et al., 2002 ; Iraqi et al., 2002 ; Salih et al.,
2004 ; Zaouia, et al., 2005). Pour ce faire, j’ai effectué un stage au sein du Laboratoire de
Mycologie Fondamentale et Appliquée aux Biotechnologies Industrielles à la Faculté de
Pharmacie, Université Claude Bernard, Lyon I, au Laboratoire de Microbiologie et des
Fermentations en Milieu Solide à l’IRD de Marseille et à l’IAV Hassan II de Rabat.
La classification morphologique des champignons filamenteux a dominé la

systématique fongique jusqu’à la fin du XXe siècle. Toutefois, cette approche reste inefficace
devant certains cas de champignons, en l’occurrence des moisissures peu différenciées et/ou
sensibles aux conditions environnementales. L’émergence des techniques de biologie
moléculaire a permis l’acquisition d’un complément d’information sur la taxonomie des
champignons et une meilleure délimitation des espèces qui, autrefois, pouvait être confondues
avec l’espèce dominante du genre. La technique de la réaction de polymérisation en
chaîne (‘Polymerase Chain Reaction’, PCR) est devenue une technique incontournable pour
l’amplification d’ADN.
Ce document, traite différents aspects que nous venons d’évoquer brièvement. Il est
composé de trois sections :
- Section 1 : Revue bibliographique.

On trouvera ainsi, dans le premier chapitre, un aperçu sur le secteur oléicole mondial et
marocain. Un deuxième chapitre est consacré à l’étude des champignons filamenteux ; de leur
classification, des conditions de développement, des différentes catégories de mycotoxines,
des méthodes de biologie moléculaire et notamment la technique de PCR, que nous avons
utilisée pour l’amplification de la région des Espaceurs Internes Transcrits (‘Internal
Transcribed Spacer’, ITS) de l’ADN des moisissures.
2
- Section 2 : Matériel et Méthodes.

L’origine des souches et les conditions de culture seront exposées dans cette section. Nous
détaillerons ensuite les méthodes d’extraction de l’ADN, son amplification, le séquençage des
amplifiats et l’analyse des séquences.
- Section 3 : Résultats et discussion.

Afin de faciliter la consultation des résultats, nous les avons résumés dans 37 tableaux. A la
fin de cette section, nous avons mené une discussion pour apporter des éléments de réponses
permettant d’expliquer les résultats obtenus.
3
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
4
Chapitre I Secteur Oléicole
Chapitre I : Secteur Oléicole

Occupant une superficie de 128.000 ha en 1960, l’oliveraie au Maroc voit sa surface
pratiquement quadrupler durant ces dernières décennies pour atteindre 500.000 ha. Ceci fait
de l’olivier la principale espèce fruitière plantée au Maroc, soit plus de 50 % de la superficie
occupée par l’arboriculture. Grâce à ses capacités d’adaptation à tous les étages
bioclimatiques, cet arbre endémique est rencontré dans un vaste périmètre qui s’étend de la
côte méditerranéenne à la région du Sous.
A côté de ses fonctions multiples de lutte contre l’érosion, de valorisation des terres
agricoles et de fixation des populations dans les zones marginales, l’oléiculture nationale
mobilise une activité agricole intense permettant de générer plus de 11 millions de journées de
travail par an, soit l’équivalent de 55.000 emplois permanents. De même, une activité
industrielle d’une importance cruciale est générée en aval par l’approvisionnement de 16.000
moulins traditionnels « Maâsras », 260 unités modernes de trituration et une cinquantaine de
confiseries d’olives (PNTTA, 1998).
La Picholine marocaine constitue la variété majoritairement cultivée au Maroc, soit

96 % de la superficie oléicole nationale. D’autres variétés telles que Dahbia, Meslala, Picual
et Picholine du Languedoc complètent le profil variétal oléicole (PNTTA, 2003).
5
1- Situation oléicole mondiale
Le secteur de l'huile d'olive représente un créneau économique important pour la

majorité des pays de la Méditerranée. Le Conseil Oléicole International (2002) rapporte que la
production mondiale annuelle d’huile d’olive s’est élevée pour la campagne 2001/2002 à
environ 2,69 millions de tonnes, soit une augmentation de 5,3 % par rapport au chiffre moyen
des campagnes depuis 1996. Les données concernant la situation oléicole mondiale qui est
exposée ci-dessous sont inspirées en grande partie du site Internet de la Conférence des
Nations Unies pour le Commerce et le Développement (CNUCED) :
(http://r0.unctad.org/infocomm/francais/olive/marche.htm).
1.1- Production d’huile d’olive
La production d'huile d'olive a toujours été concentrée dans les pays du pourtour
méditerranéen : Espagne, Portugal, Italie, Grèce, Syrie, Turquie, Tunisie et Maroc. A eux
seuls ces pays représentent plus de 90 % de la production mondiale (Figure 1).
Figure 1: Principaux pays producteurs d’huile d’olive en 2003.
6
1.2- Consommation d’huile d’olives
Les principaux pays consommateurs d’huile d’olives sont également les principaux
pays producteurs comme le montre la figure ci-dessous. L'ensemble des pays de l'Union
européenne représentent 71 % de la consommation mondiale. Les pays du pourtour
méditerranéen représentent 77 % de la consommation mondiale. Les autres pays
consommateurs de cette huile sont les Etats-Unis d’Amérique, le Canada, l'Australie et le
Japon.
Figure 2: Principaux pays consommateurs d’huile d’olive en 2002.
L'évolution de la production et de la consommation de l’huile d’olives depuis 1970

(Figure 3) montre une faible croissance jusqu'au début des années 90, puis une brusque
augmentation à la fois de la production et de la consommation pour les années 1996, 1997 et
1998. Malgré la chute de la production qui s'en est suivie, la consommation semble ne pas
diminuer.
Le parallélisme des courbes de consommation mondiale et européenne d’huile

d’olives, indique l'importance de la consommation européenne. Cependant, l'écart entre ces
courbes s'est amplifié au cours des dernières années du fait de l'ouverture de nouveaux
marchés pour l'huile d'olive.
7
Figure 3: Production et consommation d'huile d'olive dans le monde et dans l'Union européenne.
2- Situation nationale
Malgré les atouts dont dispose le secteur oléicole national, le diagnostic de la situation
actuelle met en exergue l’état modeste des niveaux de production. En effet, la production
nationale d’huile d’olive qui est de l’ordre de 48.000 tonnes/an ne couvre qu’environ 10 %
des besoins nationaux en huile végétale alimentaire, alors que la consommation avoisine les
350.000 tonnes/an (Chimi, 2001). L’évolution de la production nationale d’olive et de son
huile connaît une grande fluctuation d’une année à l’autre (Figures 4 et 5). Ceci est en raison
des conditions et des aléas climatiques, du phénomène de l’alternance, de l’âge des
plantations et du mode de conduite des oliveraies (DPV, 2004).
Milliers de tonnes
700
600
500
400
300
200
100
0
97/8 98/9 99/00 2000/01 2001/02 2002/03
Années
Figure 4: Tendance de la production nationale d’olive (DPV, 2004).
8
70
milliers de tonnes
60
50
40
30
20
10
0
97/8 98/9 99/00 2000/01 2001/02 2002/03
annés
Figure 5: Tendance de la production nationale d’huile d’olive (DPV, 2004).
3- Maâsra : unité traditionnelle de trituration d’olive
Au Maroc les unités traditionnelles de trituration des olives sont appelées

communément ‘Maâsra’ (Figure 6), elles ont généralement une faible capacité de trituration
(250 à 300 kg d'olives/ jour). Les propriétaires des maâsras travaillent soit pour leur compte
soit dans le cadre d'une location temporaire de l'unité par les agriculteurs ou par acquisition de
service par ces derniers (RAHMANI, 1996).
Figure 6: Maâsra traditionnelle.
Les circuits de production et de transformation des olives, particulièrement auprès des

maâsras, engendrent de nombreuses pertes, tant sur le plan quantitatif que qualitatif. Les
maâsras ne valorisent pas au mieux le potentiel de la production d'olives. Ces unités
traditionnelles traitent en moyenne 150.000 à 200.000 tonnes d'olives/an; avec des
rendements en huiles qui ne dépassent pas 14 % dans le meilleur des cas (Chimi, 2001).
9
Les maâsras sont équipées en pressoirs métalliques ou en bois, elles utilisent des
meules, pour broyer la pâte des olives, qui fonctionnent avec de l'énergie animale, humaine ou
mécanique. L'huile produite est stockée dans des bacs de décantation en ciment, faïence ou
argile.
Le processus d'extraction de l'huile consiste en un broyage des olives par des meules,
une mise de la patte produite dans des scourtins puis une extraction de l'huile par pression et
enfin une séparation par décantation des phases liquides (huile et margines).
Afin de mieux appréhender les traitements post-récoltes des olives destinées à la

trituration au sein des maâsras, un groupe de chercheurs de l'Institut Agronomique et
Vétérinaire Hassan II (IAV-Hassan II) a mené une enquête nationale dans le cadre du
Programme National de Transfert de Technologie en Agriculture (PNTTA) auprès de 132
maâsras artisanales, choisies au sein des principales régions de production d'olives. De cette
enquête, il ressort que(Chimi, 2001):
Le degré de maturité des olives, la méthode de récolte, les conditions de manutention

de ces fruits en vue de l’extraction de l’huile, sont des critères importants pour l’obtention
d’huiles de bonne qualité. Les méthodes de récolte et de stockage sont décrites ci-dessous.
3.1- Récolte des olives
Les méthodes de récoltes des olives au Maroc sont généralement traditionnelles. La

majorité des régions de production des olives utilisent le gaulage (90 %) mais 10 % des
agriculteurs pratiquent la cueillette des olives ou les ramassent naturellement lorsqu'elles sont
tombées. Le gaulage provoque la lésion des fruits, lesquelles lésions facilitent la pénétration et
le développement des micro-organismes ce qui nuit considérablement à la qualité de l'huile
d'olive.
10
3.2- Stockage des olives
Dans les unités artisanales mais également dans les maâsras coopératives, les olives
récoltées ne sont pas directement traitées à cause de leur abondance et de la capacité restreinte
des unités traditionnelles. Un stockage inadéquat des olives porte atteinte à la qualité de
l'huile d'olive. Le stockage des olives en vrac est à éviter à cause de l'entassement que
subissent les fruits. De façon optimale il doit être réalisé en couches minces de 22 à 25 cm
pour éviter la croissance microbienne indésirable. L'utilisation de caisses à parois perforées
est le moyen de stockage, à court terme, le plus recommandé. A travers les résultats de
l'enquête, 56 % des maâsras triturent des olives stockées en vracs, 38 % utilisent des fruits
stockés dans des sacs et seulement 6 % fonctionnent avec des olives stockées dans des
caisses. Il a été aussi constaté que 43 % des maâsras ne dépassent pas une durée de stockage
de 7 jours, par contre 57 % triturent des olives stockées plus de 15 jours.
4- Contamination fongique naturelle des olives
Les conditions particulières de récolte, de stockage et de trituration des olives auprès

des maâsras, notamment le gaulage et le séjour prolongé des olives avant leur traitement, font
des olives un milieu propice pour la croissance fongique. Ainsi, les huiles produites peuvent
présenter un risque de contamination par les mycotoxines et les grignons d’olive issus de
telles olives pourraient présenter un danger pour le bétail du fait de la concentration
préférentielle des mycotoxines dans les tourteaux plutôt que dans l’huile de pression.
Des études antérieures ont montré la présence sur les olives de spores de moisissures
réputées toxinogènes notamment les Aspergillus. Certaines espèces appartenant à ce genre,
notamment A. flavus et A. ochraceus se sont montrées capables d’élaborer leurs toxines
correspondantes sur les olives. L’huile de pression issue de telles olives peut renfermer de
faibles quantités de ces mycotoxines (Tantaoui-Elaraki et al., 1983).
En 2004, Salih et al. ont étudié la mycoflore des olives et des grignons d’olives dans
les maâsras marocaines. Un total de 50 échantillons composés essentiellement d’olives et de
grignons d’olives ont été prélevés à partir des maâsras des différentes régions du Maroc
11
(Errachidia Fés Méknés Rabat et Khémisat). Ainsi, 84 souches mésophiles appartenant à 9

genres de moisissures ont été isolées (Tableau 1). Tous ces genres ont été déjà rapportés
comme étant des contaminants naturels des aliments (Domsch et al., 1980). Tantaoui-Elaraki
et al., (1990) rapportent que quelques moisissures appartenant aux genres Aspergillus,
Penicillium, Trichoderma, Acremonium, et Alternaria ont déjà été isolés des olives. Les
souches thermophiles qui ont été isolées sont au nombre de 12 et appartiennent aux genres
Rhizopus et Mucor en plus de deux souches d’A. fumigatus.
Un autre projet de recherche a été réalisé dans le cadre du PRAD entre l’IAV Hassan II
et à l’IRD de Marseille, portant sur l’isolement de champignons filamenteux thermophiles à
partir de grignons d’olives pour la production de phytases, de lipases et de tannases. Dans ce
travail, environ 450 souches de champignons filamenteux thermophiles ont été isolées. Ces
souches appartiennent essentiellement aux genres Rhizopus, Rhizomucor, Mucor et
Aspergillus. Trente pourcent des souches isolées correspondaient à l’espèce A. fumigatus.
Tableau 1 : Identification du genre de moisissures isolées (à 25°C) des échantillons prélevés de maâsras.
Genre Nombres de souches isolées Mycoflore totale mésophile (%)

Aspergillus 27 32.1
Penicillium 26 31.0
Geotrichum 10 11.9
Mucor 9 10.7
Rhizopus 6 7.1
Trichoderma 3 3.6
Alternaria 1 1.2
Acremonium 1 1.2
Ulocladium 1 1.2
Ces moisissures sont en général saprophytes pour l’homme et l’animal, mais pouvent
renfermer des espèces pathogènes. C’est le cas notamment des Aspergillus et des Penicillium
dont certaines espèces sont impliquées dans la production de dangereuses mycotoxines. En
effet, Tantaoui-Elaraki et al., (1983) ont démontré que les olives noires entières, mais ayant
subi des endommagements mécaniques superficiels, et ensemencées respectivement avec des
12
conidiospores d’A. flavus et d’A. ochraceus étaient le siège d’une certaine sécrétion
d’aflatoxine B1 ou d’ochratoxine A.
Salih (2004) a prélevé 14 échantillons d’huile d’olive des différents maâsras de la

région d’Errachidia pour la recherche des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 et la présence de
l’ochratoxine A. Sur la totalité des échantillons d’huile d’olive qui ont été analysés, aucun
échantillon ne s’est révélé contaminé par l’une ou l’autre des mycotoxines recherchées.
13
Chapitre II Champignons filamenteux et identification moléculaire
Titre II : Champignons Filamenteux et Identification Moléculaire
I- Champignons filamenteux
A côté des champignons supérieurs dits macromycètes, il y a ce que l’on appelle les
micromycètes ou champignons inférieurs. Ceux-ci constituent un monde de champignons
filamenteux ou de levures microscopiques dont seul le microscope a révélé leur existence. Les
champignons filamenteux, appelés communément moisissures, ont été largement étudiés sur
plusieurs plans : morphologie, métabolisme, biologie moléculaire, biotechnologie, etc.
1- Définition des champignons
Les champignons sont définis comme étant des micro-organismes eucaryotes

sporogènes non chlorophylliens. Ils sont classés en trois groupes selon leurs intérêts
industriels : les champignons filamenteux, les levures et les champignons supérieurs (Brock et
al., 1994).
Leur développement se fait par croissance apicale par élongation des filaments à partir
de leurs extrémités, dans tous les sens et de façon identique. Leur mode de reproduction se
fait par voie sexuée ou asexuée. La forme sexuée est appelée téléomorphe, la forme asexuée,
anamorphe et l’organisme complet, holomorphe.
14
2- Classification des champignons filamenteux
Bien qu’aucun schéma phylogénétique des champignons n’ait reçu un agrément

unanime de la part de la communauté scientifique, la classification simplifiée suivante peut
être proposée. Celle-ci permet de distinguer deux grandes divisions qui se séparent chacune
en une série de sous-groupes (Tableau 2) (Boiron, 1996) :
- les Chromista ou Pseudomycota, pour les Oomycètes et les Hyphochytridiomycètes, à

côté de certaines algues ;
- les Fungi ou Eumycota pour les autres, appelés champignons « vrais ».
Tableau 2: Classification simplifiée des champignons
Division Classe Sous-classe
Chromista (ou Pseudomycota) Oomycètes

Hyphochytridiomycètes
Fungi (ou Eumycètes)
Chytridiomycètes
Zygomycètes
Ascomycètes Hemiascomycetidea
Euascomycetidea
Loculoascomycetidea
Basidiomycètes Teliomycetidea
Eubasidiomycetidea
Deutéromycètes Hyphomycetidea
Coelomycetidea
Blastomycetidea
15
3- Conditions de développement des champignons filamenteux
Bien qu’elles soient relativement peu exigeants, un certain nombre de facteurs,

nutritifs et environnementaux, doivent être réunis pour que les champignons filamenteux se
développent. Les principaux facteurs de développement sont :
3.1- Eléments nutritifs
Les plus importants sont le carbone et l’azote, utilisées sous forme de composés
organiques et présents en quantité suffisante dans les denrées alimentaires et ne constituent
donc pas un facteur limitant à leur développement (William Bridge Cook, 1979). Les ions
minéraux (potassium, phosphore, magnésium, etc.) en quantités faibles et parfois quelques
vitamines peuvent stimuler ou orienter le développement.
3.2- Activité de l’eau du substrat
La croissance des champignons requiert une activité de l’eau (aw) faible par rapport
aux bactéries. La limite inférieure de l’aw en dessous de laquelle les moisissures ne peuvent
pas se développer est de 0,65 (William Bridge Cook, 1979).
3.3- Oxygène
La plupart des champignons se développent à l’extérieur de la substance contaminée.

Ils sont des aérobies. Néanmoins, certaines moisissures sont moins exigeantes et se
développent en conditions de faible concentration d’oxygène (William Bridge Cook, 1979).
3.4- pH
Les champignons sont peu sensibles au pH du milieu. Il se développent de préférence

en milieux acides entre 2 et 8 avec un optimum entre 5,5 et 5,7. Certaines espèces
(Aspergillus niger) peuvent se développer jusqu’à un pH de 1,7 et 2. Cette faculté de se
16
développer en milieu acide permet de les séparer plus facilement des bactéries pour
l’isolement.
3.5- Température de croissance
Chaque micro-organisme se caractérise par sa croissance dans une gamme de

températures cardinales bien définie. Cet intervalle est caractérisé par (tableau 3) :
Une température minimale au-dessous de laquelle il n’y a pas de croissance

microbienne.
Une température optimale pour laquelle la croissance microbienne est la plus élevée.
Une température maximale au-dessus de laquelle il n’y a pas de croissance
microbienne.
La majorité des moisissures est mésophile avec un minimum entre 0 et 15°C, un

optimum entre 25 et 30°C et un maximum en dessous de 35°C. Par ailleurs, il existe une
autre catégorie de champignons, dits thermophiles, qui se développent à des températures
supérieures à 50°C. D’autres champignons sont capables de supporter des températures
inférieures à 0°C et sont donc appelés psychrophiles (Dix, et al., 1995a, b).
Tableau 3: Classification des champignons en fonction de leurs températures cardinales de croissance.
Catégorie de Températures cardinales de croissance en °C
micro-organismes Minimale Optimale Maximale

Psychrophiles ≥0 15 20
Psychrotolérants 0 25-30 35
Mésophiles 5 25-30 35
Thermotolérants 5 30-40 50
Thermophiles 20 ≥ 45 > 50
17
4- Mycotoxines
Les mycotoxines font partie des contaminants naturels de l'alimentation, par

opposition aux molécules apportées intentionnellement ou accidentellement par l'homme tel
que les additifs alimentaires et les résidus de produits phytosanitaires.
Les mycotoxines sont des métabolites secondaires sécrétés par des moisissures
appartenant principalement aux genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium. En raison de
leur structure chimique, les mycotoxines sont stables. Elles le sont particulièrement à la
chaleur, ce qui les rend d'autant plus dangereuses pour le consommateur puisqu'on peut alors
les retrouver dans les aliments après cuisson.
En sécurité alimentaire, il y a six familles de mycotoxines qui, si elles sont présentes
dans l'alimentation à des doses suffisantes, peuvent faire courir des risques aux
consommateurs. Ce sont:
Les aflatoxines sont essentiellement produites par quelques souches d’Aspergillus

flavus et par d’autres souches d’Aspergillus comme A. parasiticus, et A. nomius. Il y a quatre
sortes d’aflatoxines (B1, B2, G1 et G2). Dans les produits d’origine végétale, on rencontre
essentiellement les aflatoxines B1 et G1 (Pittet, 1998).
L’ochratoxine A (OTA), est une mycotoxine produite par Aspergillus ochraceus et

Penicillium verrucosum. Cette mycotoxine a été identifiée en Tunisie depuis 1983 et elle est
systématiquement détectée dans diverses denrées alimentaires (Maaroufi 1998). L’OTA a été
détectée dans le sang des populations surtout rurales en Tunisie (néphropathie). L’ochratoxine
A est fortement cancérigène (I.A.R.C., 1993).
Les fumonisines : Riley et al. (1998) ont présenté différentes hypothèses concernant
les mécanismes d’action des fumonisines, mycotoxines produites par Fusarium moniliforme,
dont leurs principales manifestations toxiques chez l’animal, incluant : l’œdème pulmonaire
porcin, la leucoencéphalomalacie équine, la néfrotoxicité et l’hépatotoxicité chez de
nombreuses espèces animales, et l’action promotrice dans la survenue de cancers de foie chez
le rat. Une perturbation du métabolisme des sphingolipides est observée de façon précoce in
vitro sur la plupart des systèmes de culture.
18
La zéaralénone (ZEN) est une mycotoxine produite par différentes espèces de

Fusarium, elle contamine les céréales et divers aliments pour animaux. La ZEN, mycotoxine
génotoxique, elle induit des lésions au niveau de l’ADN, elle est probablement mutagène
(Bacha et al., 1998).
La patuline est produite par plusieurs moisissures, mais principalement Penicillium

expansum, un contaminant très fréquent des pommes abîmées et stockées. Le jus de pommes
et le cidre sont les principaux vecteurs, sa stabilité à la température et à l’acidité étant très
grande. La génotoxicité de la patuline n’est pas entièrement avérée, non plus que sa
cancérogénicité chez l’animal.
Les trichotécènes (deoxynivalenol, T2-toxine) constituent un groupe de métabolites

secondaires issus de nombreuses espèces de Fusarium se développant sur les épis de céréales
(principalement blé, orge, maïs, avoine) dans certaines conditions atmosphériques (froid et
humidité). Ils sont retrouvés dans une proportion importante (50 %) de grains et de produits
dérivés. Le passage dans la chaîne alimentaire (viande, œufs, lait) est très limité. Les
trichotécènes ont été à l’origine d’empoisonnements graves d’animaux et d’Hommes, connus
sous le nom d’aleucie, en Union Soviétique, Europe Centrale, USA, Finlande et Chine. Ils ne
sont ni génotoxiques ni cancérogènes.
19
II- Identification des champignons filamenteux
1- Approche morphologique
La morphologie est l’outil principal de la systématique des champignons. La majorité

des 75.000 espèces de champignons filamenteux décrites jusqu’à présent sont des espèces
morphologiques. En pratique, la délimitation des espèces s’appuie sur la quête des traits
caractéristiques de la morphologie et des cultures d’isolats sur milieu approprié.
Parmi les critères morphologiques, on peut citer :
L’étude microscopique du mycélium : la vérification de la présence ou l’absence de

cloisons, la détermination de sa couleur, l’ornementation et la largeur de ses parois,
son mode de ramification et la différenciation des thallospores.
L’étude microscopique des organes différenciés et leur contenu : forme, couleur,
dimension, texture des parois et ornementation.
Pour ce qui est des caractères culturaux, on doit déterminer : la vitesse de croissance
apicale, la texture du thalle (velouté, laineux, etc.), la couleur du thalle ( la pigmentation du
mycélium, couleur des conidies), la couleur du revers de la culture et présence d’un pigment
diffusible, l’odeur et présence d’exsudat (gouttelettes transpirées par le mycélium aérien).
En revanche, ces caractères morphologiques sont parfois délicats à exploiter en

absence d’une expérience approfondie. On assiste alors à des problèmes d’observation et de
stabilité des caractères morphologiques. Par exemple, l’identification de certaines espèces
appartenant au genre Alternaria basée exclusivement sur la morphologie est très difficile.
Ceci est dû à la sensibilité de ces champignons aux conditions de cultures (Anderson et
Thrane, 1996).
Pour l’identification des champignons filamenteux peu différenciés tels que

Aspergillus, Penicillium ou Alternaria l’approche phénotypique reste inefficace. En outre, les
20
méthodes physiologiques et biochimiques s’avèrent laborieuses et insatisfaisantes (Anderson

et Thrane, 1996; Frisvad et al., 1998; Guarro et al.,1999).
2- Approche chimique
L’approche chimique qui se base sur des méthodes chromatographiques et

spectroscopiques permet de mener des analyses aussi bien quantitatives que qualitatives pour
élucider les structures des métabolites ou des composés de la membrane cellulaire. Il s’agit
principalement des polysaccharides, des lipides insaponifiables, des acides gras, des
métabolites secondaires volatiles et non volatiles.
Les polysaccharides constituent 80 à 90 % de la membrane cellulaire des

champignons. Leur étude est très laborieuse en raison de la nécessité de la connaissance des
monomères et de leur séquence, de la position des liaisons et de la configuration anomérique.
Les lipides insaponifiables qui, sont étudiés dans le cadre de la chimiotaxonomie,

appartiennent à la famille des : ubiquinones, stéroïdes et caroténoïdes. Concernant, le profil
en acides gras, il peut être le même de point de vue composition chez de nombreuses espèces
d’un champignon filamenteux donné. Tout de même, ces espèces peuvent être différenciées
grâce à la concentration relative de chaque acide gras. Ainsi, Lopes da Silva et al. (1998) sont
arrivés à différencier des espèces de Penicillium.
Bien que l’utilisation des métabolites secondaires volatils pour l’identification des
champignons filamenteux soit très controversée, certains auteurs les ont employés pour
décrire quelques espèces appartenant aux genres Aspergillus, Fusarium (Wilkins et Larsen,
1995 ; Sunesson et al. , 1995 ; Frisvad et al., 1998) et au genre Penicillium (Börjesson et al.,
1990; Larsen et Frisvad, 1995a; Larsen et Frisvad, 1995b). Dans les industries agro-
alimentaires, l’intérêt de ces composés a été mis en évidence par Magan et Evans, (2000). En
effet, grâce à un nez électronique les auteurs ont pu détecter rapidement la détérioration des
stocks de grains. Désormais les espèces mycotoxinogènes peuvent être détectées grâce à
l’émergence de cette technique.
21
Les métabolites secondaires non volatils permettent de procurer des données précises
et complémentaires aux données morphologiques et moléculaires. Smedsgaard et Frisvad,
(1997) sont arrivés à obtenir des profils de métabolites secondaires non volatiles
caractéristiques de certaines espèces du genre Penicillium.
3- Approche moléculaire
La biologie moléculaire a connu un essor extraordinaire ces deux dernières décennies.

Quand les champignons filamenteux sont peu différenciés et/ou sensibles aux conditions
environnementales, les méthodes morphologiques, physiologiques et biochimiques s’avèrent
alors non seulement laborieuses et longues mais aussi quelquefois inefficaces. En outre, de
nombreuses espèces de champignons ont été décrites à partir d’un seul spécimen, ou dans les
meilleurs cas, d’un groupe d’individus très restreint. Ceci engendre une vulnérabilité certaine
au niveau de la taxonomie morphologique en raison de la grande variabilité phénotypique
dans le monde fongique.
Les experts de la biologie moléculaire, suivant la finalité de leur recherche, prennent

pour cible soit un gène (locus) ; soit un fragment d’ADN défini (espaceurs, introns, etc.), soit
plusieurs gènes (multiloci) ou même l’ADN total .
En taxonomie moléculaire des champignons, les gènes les plus sollicités sont ceux qui
codent pour l’ARN ribosomique (Frisvad et al., 1998). Pour la comparaison des taxons de
rangs supérieurs (familles, ordres, classes) l’ADN ribosomal 18S, très conservé, s’avère plus
adapté. La discrimination des espèces proches se base plutôt sur les séquences de la région
Espaceurs Internes Transcrits (‘Internal Transcribed Spacer’, ITS) de l’ADN ribosomal (Chen
et al., 2001; Zhao et al., 2001). Ceci en raison de la facilité de l’étude de ces unités, qui sont
des régions non codantes et variables selon l’espèce, après amplification par PCR. En effet,
elles sont présentes en 100 à 150 copies répétées en tandem chez les champignons comme
chez la majorité des eucaryotes. La figure 7 illustre les différents gènes et séquences
constituant la région ITS.
La région ITS est formée de l’ITS1, de l’ADNr 5,8 et de l’ITS2. Elle encadrée par les
gènes de l’ARNr 18S et de l’ARNr 28S.
22
Figure 7: La région ITS de l'ADN humain

(Strachan et al., 1999)
III- Techniques de biologie moléculaire
1- Réaction de polymérisation en chaîne
Cette technique décrite pour la première fois en 1985 par l’équipe de Mullis permet
d’amplifier des séquences d’ADN de manière spécifique et d’augmenter considérablement la
quantité d’ADN dont on dispose initialement. Elle nécessite de connaître la séquence des
régions qui délimitent l’ADN à amplifier. Ces séquences serviront à synthétiser des amorces
oligonucléotidiques complémentaires (de longueur de 20 à 30 nucléotides).
Cette technique d’amplification de fragments spécifiques d’ADN in vitro, a vu le jour

lorsque l’on a découvert une enzyme, la Taq polymérase, capable de résister aux températures
de la dénaturation. Sa température optimale d'action est de 72°C et elle est capable de résister
à des passages successifs à 95°C ce qui a rendu possible l'automatisation de la procédure.
Cette réaction s’effectue par extension itérative (répétition de la succession cyclique)

de deux amorces spécifiques à la région que l’on désire amplifier, grâce à l’enzyme
thermostable. Ainsi, celle-ci part de ces deux amorces situées de part et d’autre de la région
cible pour y ajouter des nucléotides de façon complémentaire et antiparallèle à la séquence
considérée. Le produit de la réaction est un fragment d’ADN double brin dont les limites sont
déterminées par les amorces utilisées.
23
Théoriquement, 25 cycles d’amplification reproduisent environ 33 millions de fois le

produit spécifique, selon la formule:
Nc = N0 . 2C
Soit : - N0 : le nombre de fragment d’ADN initiaux,

- Nc : le nombre de copies au cycle C.
La PCR consiste en une succession cyclique de trois phases :
Dénaturation thermique
Les deux brins d’ADN sont séparés par élévation de la température supérieure à la
température de fusion qui est spécifique à chaque fragment d’ADN de séquence donnée. La
température de fusion Tm est définie comme étant la température où 50 % des fragments sont
sous forme simple brin (Figure 8).
% ADN simple brin
100
50
T°C
Tm
Figure 8: Courbe de la variation de la dénaturation de l’ADN en fonction de la température. Définition de

la température de fusion (Tm).
24
Hybridation des amorces
Une paire d’amorces sens et antisens vont s’hybrider sur les brins d’ADN et délimiter
ainsi la séquence à amplifier. La température d’hybridation doit être inférieure au Tm des
amorces pour favoriser et conserver leur association sur l’ADN cible.
Elongation :
L'association d'un brin et d'une amorce est le substrat de l'ADN polymérase ‘Taq pol’,
qui avec l'apport des 4 nucléotides extérieurs : dGTP, dATP, dTTP, dCTP
appelés DésoxyNucléosides-Tri-Phosphates (dNTPs), permet la synthèse du brin
complémentaire. Cette extension se fait à partir de l'extrémité 3' où se situe l'amorce, à une
température intermédiaire entre celle nécessaire à la dénaturation et celle de l’hybridation des
amorces. A la fin de l'élongation, on obtient un ADN duplex : brin ancien/brin néo-synthétisé.
La figure 9 illustre la succession cyclique des trois phases de la PCR.
25
Amorce (primers) Taq Nuléotides

ADN Cible
polymerase (bases)
1. Dénaturation de
l'ADN
2. Hybridation des amorces

3’. Elongation
3. Hybridation de la polymerase
Figure 9: Principe de la PCR.
26
2- Variantes de PCR
La PCR a considérablement évolué et a permis le développement de certaines variantes.
2.1- PCR nichée ou nested PCR
Appelée également PCR emboîtée, il s’agit de deux PCR. La première utilise des
amorces universelles complémentaires de séquences hautement conservées et communes à
tous les champignons filamenteux. La seconde se sert d’une autre paire d’amorces plus
spécifiques à un genre pour amplifier l’implicon (amplifiat) obtenu lors de la PCR précédente.
Ainsi, l’usage de deux couples d’amorces accroît la spécificité de la réaction et améliore
considérablement la sensibilité de la méthode.
2.2- Reverse Transcription PCR
La Reverse Transcription PCR (RT-PCR) est une méthode qui permet d’étudier un
gène à partir de l’ARN messager (ARNm). Elle se déroule en deux phases. Une première
phase correspond à la copie de l’ARNm en ADN complémentaire (ADNc). Une seconde
phase correspond à une réaction PCR classique sur l’ADNc synthétisé.
Dans la première phase, l’ARNm à étudier est repéré en utilisant une sonde
oligonucléotidique spécifique (amorce qui s’hybride à l’extrémité 3’ du seul brin d’ARNm
auquel on s’intéresse), puis la transcriptase inverse ou rétrotranscriptase permet la synthèse du
brin complémentaire sous une forme d’ADNc simple brin. Une seconde amorce
oligonucléotidique spécifique permet la synthèse du second brin par extension. L’ADNc
synthétisé servira par la suite de matrice pour une réaction PCR classique.
27
2.3- PCR quantitative
La PCR quantitative permet de mesurer la quantité de molécules d’ADN synthétisé au

cours de l’amplification. Elle utilise une référence ou étalon sur lequel on se base pour
quantifier les échantillons.
La PCR quantitative est dite absolue lorsque le nombre de molécules de la référence

est connu. Dans ce cas, une quantité absolue en nombre de copies d’ADN pourra être
attribuée à l’échantillon. Si le nombre de molécules n’est pas connu, on lui assigne une valeur
arbitraire (1 ;100 % ;…) et l’échantillon prend alors une valeur relative à la référence ; la PCR
quantitative est dite relative.
L’évolution de l’amplification peut être représenté par une courbe dont l’allure est
celle d’une sigmoïde. Deux phases constituent cette évolution ; la première correspond à une
amplification exponentielle et modélisable. La quantité d’amplifiat obtenue à chaque moment
de cette phase est directement fonction du nombre de copies initiales du fragment d’ADN. La
seconde qui est une phase de plateau, correspond à un ralentissement de l’amplification qui
peut être dû à l’épuisement des différents réactifs de la PCR tels que les amorces. Cette phase
est difficilement modélisable et elle est rarement reproductible.
Soit : - N0 : nombre de copies initiales,

- Nc : nombre de copies au cycle c
- E : efficacité de la PCR.
N1= N0 .(1+E)
N2= N1 .(1+E)
…
Nc=N0 .(1+E)c
- Exemple particulier :
Si E = 100 %, à chaque cycle, le nombre de copies double est : Nc=N0 . 2c
Actuellement, la PCR quantitative en temps réel gagne du terrain au détriment de la

PCR conventionnelle. Grâce au LightCycler (Figure 10) qui est un thermocycleur rapide (à air
28
pulsé), couplé à un microspectrofluorimètre, on peut mesurer la quantité d’ADN synthétisé

après chaque cycle d’élongation. Cette technique assure la rapidité, la simplicité et la sécurité
de manipulation (non utilisation de bromure d’éthidium qui est un produit cancérigène).
Figure 10: LightCycler : Thermocycleur à PCR quantitative.
Pour détecter les produits d’amplification, le LightCycler utilise l’une des deux
méthodes basées sur la fluorescence :
Détection de l'ADN avec un fluorophore, le SYBR Green
Le caractère fluorescent du SYBR Green ne se manifeste que lorsqu’il est lié à l'ADN double
brin. Il est très stable : au bout de 30 cycles d'amplification, seulement 6% de son activité est
perdue. Le microspectrofluorimètre couplé au LightCycler permet de lire cette fluorescence
(Figure 11).
Sondes d'hybridation
La détection de l’ADN se fait à l’aide de deux sondes marquées par deux fluorochromes, qui
émettent une fluorescence à une longueur d’ondes donnée après hybridation avec l’ADN cible
(Figure 12).
29
Figure 11: Utilisation de sondes fluorescentes pour la détection de l’ADN.
Figure 12: Utilisation de fluorophore pour la détection de l’ADN.
30
3- Analyse de Restriction Enzymatique et Polymorphisme de Taille des

Fragments de Restriction
L’Analyse de Restriction Enzymatique (‘Restriction Enzym Analysis’, REA) est une

technique qui est destinée à l’étude de l’ADN génomique total. Ainsi, elle est souvent utilisée
pour la cartographie du génome. En revanche, le Polymorphisme de Taille des Fragments de
Restriction (‘Restriction Fragment Length Polymorphism’, RFLP) est consacrée à l’étude des
régions connues d’ADN notamment celles de l’ADN ribosomal et de l’ADN mitochondrial.
L’ADN extrait des cellules fongiques est amplifié in vitro par PCR, puis il subit une
digestion enzymatique avec une ou plusieurs endonucléases. Les fragments de restriction
obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose.
Les mutations ponctuelles, telles que les insertions ou les délétions de nucléotides qui
affectent aussi bien les sites de restriction des enzymes employées que les régions qui les
séparent, engendrent des profils de restriction différents d’une souche à l’autre.
La RFLP est une technique qui s’appuie sur l’étude de la variabilité de la taille des
fragments d’ADN amplifié après digestion enzymatique. Comparée à la technique de REA, la
RFLP présente l’atout d’être pointue. Autrement dit, grâce à la PCR, la région du génome
abritant la mutation à mettre en évidence se trouve mieux ciblée.
Pour mieux visualiser ces variations obtenues par RFLP, les fragments d’ADN séparés
par électrophorèse, sont dénaturés chimiquement et transférés sur une membrane par Southern
blot et hybridés avec des sondes radiomarquées (Figure 13).
31
Electrophorèse sur gel d’agarose

+ dénaturation dans le gel des
fragments de restriction (NaOH)
+ Fixation de l’ADN sur la membrane

Transfert sur support par cuisson (nitrocellulose) ou exposition
solide par capillarité U.V (nylon)
(buvardage=blot)
Hybridation avec une

sonde marquée dénaturée
Figure 13: Technique de Southern blot.
32
4- Amplification Aléatoire de l’ADN Polymorphique
L’Amplification Aléatoire de l’ADN Polymorphique (‘Randomly Amplified

Polymorphic DNA’, RAPD) est une des techniques de ‘fingerprints’ : empreintes
moléculaires qui cible l’ensemble du génome. Elle fait appel à la PCR pour amplifier des
segments d’ADN génomique avec une amorce courte, généralement 10 nucléotides, d’une
séquence arbitraire et une température d’hybridation basse (Arisan-Atac et Kubicek, 1995 ;
Frisvad et al., 1998).
La RAPD et la RFLP partagent un point commun, en cela qu’elles mettent en évidence

la variation de taille des fragments d’ADN. En revanche, l’analyse RAPD exploite les sites
d’hybridation de l’unique amorce de la PCR au lieu des sites de restriction des endonucléases.
La révélation des amplimères se fait par séparation électrophorétique sur gel d’agarose
et visualisation au biais de fluorescence du bromure d’éthidium sous rayons ultraviolets
(Figure 14). Les bandes au niveau des profils d’amplification des différents isolats sont
soumises à une analyse afin de déceler d’éventuelles variations.
L’atout principal de cette technique est qu’elle ne requiert pas des connaissances
préalables des génomes étudiés. En outre, sa rapidité, sa simplicité et sa haute sensibilité pour
la détection des variations qu’omet la RFLP, font d’elle une des méthodes privilégiées pour le
typage moléculaire des champignons filamenteux (Bostock et al., 1993 ; Lehmann et al.,
1992 ; Magee et al., 1992 ; Taylor et al., 1999).
Le manque de reproductibilité constitue la contrainte majeure de cette méthode. Sa

sensibilité peut être considérée comme un inconvénient dans le sens où quelques variations
dans les conditions de la PCR telles que la température et la concentration en MgCl2
influencent l’affinité de l’amorce (Ellsworth et al., 1993). Par ailleurs, si le problème de la
reproductibilité est résolu, on ne peut guère trancher et dire que deux bandes de mobilité
électrophorétique identique sont forcement homologues ; car leur séquence peut être
différente même si elles aient le même poids moléculaire.
33
Figure 14: Profil d’amplification par RAPD d’ADN des souches de Penicillium utilisant deux amorces
différentes ; NS2 (a) et NS7 (b).
5- Polymorphisme de Taille des Fragments Amplifiés
Une combinaison des méthodes RFLP et PCR a donné naissance à la technique du

Polymorphisme de Taille des Fragments Amplifiés (‘Amplified Fragments Length
Polymorphism’, AFLP) (Figure 15). Après digestion enzymatique de l’ADN par deux
enzymes de restriction, des adaptateurs oligonucléotidiques doubles brins spécifiques à ces
dernières s’hybrident par ligation aux extrémités des fragments de restriction. Cette ligature
empêche que les sites de restriction initiaux soient reconstitués. Ce qui veut dire que la
digestion et la ligation se déroulent simultanément. Les fragments sont amplifiés par PCR en
faisant appel à des amorces oligonucléotidiques complémentaires des séquences des
adaptateurs et qui sont prolongées de 1 à 3 nucléotides arbitraires, appelés bases débordantes,
au niveau de l’extrémité 3’.
La spécificité de l’AFLP est notablement élevée du fait que seuls les fragments
possédant les bases complémentaires des bases débordantes seront amplifiés. L’analyse du
polymorphisme se fait après séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide.
L’analyse AFLP est d’une utilité notable du fait qu’elle ne nécessite pas une
connaissance préalable du génome étudié. De même, elle s’avère très pratique pour étudier les
champignons qui sont difficiles à cultiver car elle n’a besoin que d’une petite quantité d’ADN
(Rosendahl et Taylor, 1997).
34
Figure 15: Schéma des différentes étapes de la méthode d’AFLP.
6- Polymorphisme de Conformation de l’ADN Simple Brin
La méthode du Polymorphisme de Conformation de l’ADN Simple Brin (‘Single

Straind Conformationnal Polymorphism’, SSCP) permet de détecter des variations fines entre
souches montrant des profils RAPD ou RFLP identiques. En effet, les bandes d’égale mobilité
électrophorétique (monomorphes) sont découpées, éluées du gel, dénaturées par la chaleur
35
puis refroidies brusquement de manière à obtenir de l’ADN simple brin. Elles sont ensuite
déposées sur gel de polyachrylamide en conditions non dénaturantes.
Pour parvenir à discriminer les simples brins, ceux-ci doivent se différencier entre eux
par un changement de conformation dû à la substitution nucléotidique. Ceci se manifeste par
des variations de mobilité des bandes variables qui sont alors excisées du gel et séquencées.
Le résultat du séquençage permet de confectionner des amorces pour amplifier ces fragments
pour tous les isolats de l’étude.
La SSCP a une reproductibilité satisfaisante et elle est facile à analyser, d’une part.
D’autre part, l’avantage que l’amplification RAPD lui offre, la rend une technique
intéressante pour le typage de routine pour un grand nombre d’isolats.
7- Séquençage
Les évolutionnistes optent généralement pour le séquençage du génome dans leur

étude phylogénétique des espèces. Cette méthode utilise une ADN polymérase qui synthétise
le brin complémentaire de l'ADN à séquencer par ajout des dNTPs se trouvant en grande
quantité dans le milieu réactionnel. Celui-ci contient également une faible proportion d'un
didésoxyribonucléotide (ddNTP) (à Adénine, Guanine, Thymine, ou à Cytosine) qui diffèrent
des dNTP par l'absence d'un groupement OH en position 3’. Lorsqu'une ADN polymérase
utilise, à un moment totalement aléatoire, un ddNTP au lieu d'un dNTP, elle n'est plus capable
de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d'ADN s'arrête.
En pratique, on utilise un milieu contenant du ddATP, un deuxième contenant du

ddGTP, un troisième contenant du ddCTP, et un quatrième milieu contenant du ddTTP.
La figure 16 explique le principe du séquençage dans le cas d’un milieu contenant du ddGTP.
36
Figure 16: Principe du séquençage de l'ADN
La lecture de la séquence (Figure 17) se fait après migration pendant deux à quatre
heures sur gel d’acrylamide. La révélation des bandes est assurée soit par fluorescence de
l’amorce utilisée, soit par un nucléotide marqué radioactivement. Suivant la taille des gels, la
séquence lue est limitée de 200 à 750 nucléotides environ. Les bandes doivent être
suffisamment espacées pour que leur ordre soit déterminable.
L’ancienne méthode du séquençage dite ‘à la main’ était onéreuse et techniquement

difficile. Aujourd’hui le séquençage est automatique. L’automate est capable de réaliser et le
séquençage et la lecture des séquences. En effet, les fragments marqués auparavant par des
marqueurs fluorescents sont détectés à la sortie de la colonne chromatographique par le
séquenceur ainsi que leur taille précise. Le résultat est donné sous forme de chromatogramme
dont les pics représentent les bases nucléotidiques (Figure 18).
37
Figure 17: Lecture manuelle de la séquence d’ADN
38
Figure 18: Chromatogramme du séquençage d'ADN représentant

les bases nucléotidiques et les pics correspondants.
8- Microsatellites
L’analyse de polymorphisme de taille des séquences microsatellites (Figure 19) est

réputée être parmi les techniques les plus discriminantes. Les microsatellites sont des
séquences d’ADN répétées en tandem dont l’unité de répétition est comprise entre 1 et 6 pb.
Les séquences microsatellites appartiennent à des régions d’ADN non-codant, ce qui rend les
fonctions des gènes moins influencées par d’éventuelles variations de longueurs de ces
segments.
Les séquences microsatellites sont d’abord amplifiées par PCR, puis dénaturées par la
chaleur et refroidies brusquement afin d’obtenir des fragments d’ADN simple brin. Ceux-ci
sont ensuite séparés sur gel de polyacrylamide. Le polymorphisme de taille des diverses
souches étudiées est ainsi mis en évidence par comparaison des profils électrophorétiques.
39
Figure 19: Exploitation des microsatellites pour la différentiation

des tissus sain (N) et des tissus cancéreux (T).
(Strachan et Read, 1999)
IV- Etude morphologique et moléculaire de quelques genres de

moisissures
1- Aspergillus
1.1- Approche phénotypique
a) Classification taxonomique
Règne Division Sous Division Groupe Genre

Fungi Amastigomycètes Deutéromycètes Hyphomycètes Aspergillus
b) Critères morphologiques du genre
Thalle à mycélium cloisonné portant de nombreux conidiophores dressée (Figure 20),

non ramifiés, terminés en vésicules (tête conidienne unisérie) ou portée sur des métules ou
stérigmates (tête conidienne biséries). Conidies sèches en chaîne divergente ou associées en
colonnes compactes, unicellulaires, globuleuses, sub-globuleuses ou elliptiques, lisses ou
ornementées, hyalines ou pigmentées en jaune, brun, noir ou vert. Cellules à paroi épaissie et
sclérotes parfois présents (Botton et al., 1985).
40
Figure 20: Caractères morphologiques des structures asexuées des Aspergillus.
c) Clé d’identification du genre
Le genre comprend près de 180 espèces (d’après la classification de Raper , 1965)

répartie en 18 groupes essentiellement définis d’après les caractères de l’appareil
reproducteur. Les Aspergillus sont identifiés en utilisant des clés d’identification (Raper,
1965).
d) Pathogénicité
Les espèces d’Aspergillus sont des contaminants très communs, polyphages, parfois
pathogènes pour l’homme, les animaux et les végétaux, et susceptibles de produire des
métabolites hautement toxinogènes pour l’homme et les animaux comme les mycotoxines
(aflatoxines, ochratoxines, etc.).
41
1.2- Approche moléculaire
Pour l’identification des souches d’Aspergillus fumigatus, Kambouris et al., (1999) ont
fait appel à la RFLP. Après une amplification par PCR du gène de pepsine en utilisant
l’amorce sens (pep1: 5′-TAGACACCGGCACCACCCTC-3′) et antisens (pep22: 5′-
CTATGCCTGAGGGGCGAA-3′) , 0.5-1 µg d’amplifiat est mis à la digestion par 20 U de
l’endonucléase de restriction MspI. Après 16 heures de digestion, le résultat est révélé par
électrophorèse sur gel d’agarose de 2-3 % (Figure 21 ).
Figure 21: Gel électrophorétique montrant le profil de restriction de certaines souches d’A. fumigatus.
La description des gels est la suivante : En haut: marqueur de poids moléculaire

PBR322 x MspI sur gel d'agarose à 2 %. En bas: A: gel d'agarose à 3 %: Bandes du gène de
pepsine de quelques espèces d'Aspergillus amplifié par la paire d'amorce pep1/pep22. B:
profil de digestion par MspI des amplifiats du gène pepsine de quelques espèces
d’Aspergillus. Piste 1 : A. flavus ; 2: A. niger; 3: A. fumigatus; 4: A. parasiticus; 5: A. niger; 6:
marqueur de poids moléculaire PBR322 X MspI; 7: A. flavus; 8: A. niger; 9: A. fumigatus; 10:
A. parasiticus; 11: A. niger; 12: A. fumigatus (les bandes sont très fines); 13 : marqueur de
poids moléculaire PBR322 X MspI.
42
2- Penicillium
a) Classification taxonomique

Fungi Amastigomycètes Deutéromycètes Hyphomycètes Penicillium
Thalle vert ou plus rarement blanc, dont la texture est souvent utilisée comme critère
de détermination. Conidiophores isolés (Figure 22), groupés en faisceaux lâches ou agrégés,
hyalins lisses ou granuleux, simples ou ramifiés, terminés par un pénicille. Pénicilles
constitués, suivant le cas, soit un simple verticille (monoverticillés), soit d’un verticille de
ramification (métules) portant les phyalides (biverticillés), soit de plusieurs verticilles
successifs comportant des ramifications, des métules et des phialides (triverticillés,
quadriverticillés, etc.). Les caractères des pénicilles servent à la différentiation des groupes et
des espèces (Botton et al., 1985).
Figure 22:Caractères morphologiques des structures asexuées des Penicillium.
43
c) Clé d’identification du genre
Le genre Penicillium regroupe près d’une centaine d’espèces. Leur détermination fait
intervenir essentiellement les caractères du thalle des pénicilles et des spores. Pitt utilise aussi
comme critères la vitesse de croissance du mycélium à différentes températures et sur
différents milieux de culture (Pitt, 1985).
d) Pathogénicité
Les Penicillium sont pour la plupart très communs, polyphages et responsables de

nombreuses dégradations. Plusieurs mycotoxines (aflatoxines, patuline, l’acide penicillique,
etc.) sont produites par une variété d’espèces de Penicillium durant les opérations de transport
et de stockage des denrées alimentaires (Botton et al., 1985).
La PCR combinée à la RFLP a été utilisée par Colombo et al., (2002), pour
l’identification des souches de Penicillium isolées à partir d’aliments (Tableau 4).
Tableau 4: Souches utilisées dans l’étude des Penicillium isolées à partir des aliments.
La séquence cible est d’une taille entre 350 et 600 pb, elle correspond au gène 5.8 S et
les deux régions non codantes ITS 1 et 2 de l’ARNr. ITS5-ITS4 et ITS3-ITS4 sont les paires
d’amorces utilisées et qui ont été citées par White et al., (1990), ( Tableau 5).
44
Tableau 5: séquences d’amorces
Dix unités de chaque enzyme : AvaI, BgII et HaeIII ont été ajoutées à 10 µl
d’amplifiat. La digestion de RFLP se déroule à 37°C pendant 3 heures (Kumeda et Asao,
1996). Le profil de restriction est révélé par électrophorèse sur gel (Figure 23).
La RFLP effectuée au niveau de la zone ITS4-ITS5 par l’enzyme HaeIII a permis

l’identification de P. aurantiogriseum. En effet, une bande caractéristique est toujours alignée
avec la bande de 300 pb du marqueur de poids moléculaire. Alors que pour d’autres espèces,
cette bande est déplacée en deçà de la ligne 300 pb.
Figure 23: Gel électrophorétique montrant le profil de restriction des souches

de Penicillium isolées des aliments.
45
Les pistes du gel sont définies comme suit : S––standard (500 bp); N–– Essai à blanc
(réaction PCR sans ADN). M–– marqueur de poids moléculaire. /––piste vide. Les autres
étiquettes correspondent aux échantillons de moisissures listées au niveau du tableau IV. A–
C: gel électrophorétique des fragments RFLP d’ADN amplifié par les amorces ITS3-ITS4.
Chaque échantillon d’ADN d’une souche fongique est déposé dans quatre puits : le premier
contient un amplifiat de PCR non digéré. Les trois autres puits contiennent des amplifiats
digérés respectivement par les enzymes de restriction AvaI, BgII et HaeIII. D : gel
électrophorétique des fragments RFLP d’ADN amplifié par les amorces ITS4-ITS5. Chaque
échantillon d’ADN d’une souche fongique est déposé dans trois puits : le premier contient un
amplifiat de PCR digéré par AvaI. Les deux autres puits contiennent des amplifiats digérés
respectivement par les enzymes de restriction BgII et HaeIII. La ligne dessiné sur l’image du
gel D, montre le seuil du 300 pb qui discrimine P. aurantiogriseum des autres espèces.
3- Trichoderma
a) Classification Taxonomique

Fungi Amastigomycètes Deutéromycètes Hypocreales Trichoderma
Thalle à croissance rapide, d’abord lisse puis plus ou moins floconneux, souvent zoné,
blanc ou vert. Conidiophores en touffes plus ou moins compactes, très ramifiés,
irrégulièrement verticillés avec des ramifications à angle droit (Figure 24). Genre très
commun dans le sol ou sur les matières végétales en décomposition, comprenant une
vingtaine d’espèces d’un grand intérêt économique en raison d’une forte activité
cellulolytique.
46
Figure 24: Structures morphologiques de l’espèce Trichoderma viride.
c) Pathogénicité
Très peu de cas d’infection par Trichoderma sont signalés. Ces infection sont
généralement opportunistes et se développent chez les patients immunodéprimés.
Afin d’identifier 17 souches de lutte biologique, dont 16 ont été identifiées auparavant
sur la base de critères morphologiques en tant que Trichoderma harzianum, et une en tant que
Trichoderma viride, Hermosa et al., (2000) ont utilisé différentes techniques moléculaires
entre autres l’hybridation d’une sonde par le Southern blotting. D’abord, 8 µg de l’ADN
génomique sont digérés par une enzyme de restriction EcoRI ou EcoRV à 37°C. Les
fragments de restriction sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 0.8 %.
Les bandes d’ADN sont transférées par capillarité du gel à la membrane en nylon puis
immobilisées par cuisson à 80 °C pendant 90 min. L’hybridation s’effectue durant la nuit par
47
l’addition de 20 ng/ml d’une sonde d’ADN mitochondrial (ADNmt) dénaturé suivant la

procédure décrite par Sambrook et al., (1998) (Figure 25).
Figure 25: Southern blots de l’ADN des isolats de Trichoderma digéré par EcoRI et hybridé avec la sonde
de ADNmt de T. harzianum 2924 digéré par BamHI. A gauche, le marqueur de poids
moléculaire. Le N°25 correspond à la souche T. viride, les autres N° sont ceux de T. harzianum.
48
Conclusion
L’identification des champignons filamenteux fait appel, généralement, aux caractères

culturaux et aux caractéristiques morphologiques. Pour une expression correcte des caractères
à étudier, les moisissures doivent être cultivées dans des milieux standards favorisant une
bonne croissance.
Quand les caractères morphologiques s’avèrent inefficaces, la chimiotaxonomie qui

regroupe les méthodes chimiques et les méthodes moléculaires peut venir en aide. Les
moisissures peu différenciées et/ou sensibles aux conditions environnementales, sont mieux
identifiées en adoptant l’approche moléculaire. Il est indéniable que la technique de PCR est
l’un des outils incontournables qui ont fait le succès de l’identification moléculaire des
champignons filamenteux.
Il existe un certain nombre de critères auquel une technique de typage moléculaire doit
répondre. En effet, elle doit être rapide, économique, reproductible, applicable à tous les
individus d’une espèce donnée et elle doit avant tout discriminer entre des isolats n’ayant
aucun lien entre eux.
49
MATERIEL ET METHODES
MATERIELS ET METHODES
50
Le travail expérimental de biologie moléculaire a été réalisé au laboratoire de

mycologie fondamentale et appliquée aux biotechnologies industrielles de la Faculté de
Pharmacie, Université Claude Bernard, Lyon I, durant un premier séjour (période 1) :
septembre - décembre 2004 et un second séjour (période 2) : mai – juin 2005.
1- Nature et origine des souches
Les différentes souches étudiées ainsi que leur identification basée sur l’approche
morphologique sont indiquées dans les tableaux 6, 7 et 8. Les souches figurant dans le tableau
VI, ont été isolées au niveau des maâsras marocaines à partir d’olives, de grignons d’olives et
des margines, par Salih et al., (2004) lors de la compagne oléicole 2003-2004. Les souches du
tableau VII ont été isolées par Zaouia et al., (2005) pendant la compagne oléicole 2004-2005.
Le tableau VIII contient les souches de la collection IAV Hassan II - IRD de Marseille.
Les souches des champignons filamenteux sont conservés à une température de 4 °C,
dans des piluliers à gélose inclinée à base de ‘Potato-dextrose agar’ (PDA).
Tableau 6: Liste des souches isolées par Salih et al., (2004).
N° LOMY 1 N° GS 2 Echantillon Genre Espèce

807 52 5 Acremonium sp.
835 89 33 Alternaria sp.
790 30 3 Aspergillus flavus
828 77 21 Aspergillus fumigatus
783 4 13 Aspergillus niger
51
Tableau VI (suite)
1 2
N° LOMY N° GS Echantillon Genre Espèce
791 31 28 Aspergillus Niger
803 45 2 Geotrichum sp.
788 28 5 Mucor sp.
794 35 2 Mucor sp.
837 91 26 Mucor sp.
781 1 1 Penicillium sp.
52
Tableau VI (suite)
N° LOMY 1 N° GS 2 Echantillon Genre Espèce
784 9 5 Rhizopus sp.
786 24 13 Trichoderma sp.
785 10 15 Ulocladium sp.
1
: Numéro attribué par le Laboratoire de Mycologie et des Fermentations en Milieu Solide
de l’IRD de Marseille .
2
: Numéro attribué par Salih et al., (2004).
Tableau 7 : Liste des souches isolées par Zaouia et al., (2004).
N° ZN Identification morphologique
M39 Aspergillus awamori
M 20 Aspergillus awamori
M 10 Aspergillus carbonarius
53
Tableau VII (suite)

M 13 Aspergillus niger
M1 Aspergillus flavus
M 102 Aspergillus flavus
M 109 Aspergillus flavus
T 4 15 Aspergillus fumigatus
T 16 Aspergillus fumigatus
54
Tableau VII (suite)

M6 Penicillium viridicatum
M 36 Penicillium viridicatum
M 75 Penicillium viridicatum
M3 Penicillium verrucosum
M 37 Penicillium verrucosum
M 86 Penicillium sp.
M 89 Penicillium sp.
3
: Le symbole ‘M’ signifie que la souche est mésophile.
4
: Le symbole ‘T’ signifie que la souche est thermophile.
Tableau 8: Liste des souches de la collection IAV Hassan II – IRD de Marseille.
N° LOMY Genre Espèce

13 Aspergillus awamori
36 Aspergillus awamorri
175 Aspergillus carbonarius
11 Aspergillus flavus
323 Aspergillus flavus
21 Aspergillus foetidus
1 Aspergillus fumigatus
12 Aspergillus niger
367 Aspergillus ochraceus
10 Aspergillus oryzae
2 Aspergillus parasiticus
222 Aspergillus phoenicus
55
Tableau VIII (suite)

N° LOMY Genre Espèce
29 Penicillium aurentium-violaceum
38 Penicillium candidum
39 Penicillium caseicolum
30 Penicillium expansum
40 Penicillium roquefortii
328 Rhizopus microsporus
KLM 26 Rhizopus miehei
KLM 113 Non identifié Non identifié
KLM 122 Non identifié Non identifié
KLM 166 Rhizopus sp.
H1 Myceliophtora thermophila
H2 Rhizopus sp.
H 17 Aspergillus fumigatus
56
2- Culture des souches
2.1- Entretien des souches
Nous avons utilisé le milieu PDA (infusion de pomme de terre : 200 g, saccharose :
20 g, agar : 15 g, eau distillée : 1000 ml) pour réensemencer les souches dans des piluliers
contenant de la gélose inclinée dont la préparation est la suivante :
Trente neuf grammes du milieu PDA ‘prêt à utilisé’ sont dissous dans un litre d’eau
distillée. Le milieu est ensuite agité et porté à ébullition pour une bonne homogénéisation,
puis stérilisé à 121 °C pendant 20 minutes.
2.2- Production de la biomasse pour l’extraction de l’ADN
Les champignons ont été de nouveau réensemencés sur boîtes de Petri contenant le
milieu ‘malt extract agar’ (MEA) pour préparer les souches à l’extraction de l’ADN. La
préparation du MEA est la suivante :
Vingt grammes de malt sont pesés puis dissous dans un litre d’eau distillée. Le pH est
ajusté à 6,4 à l’aide de quelques goûtes de soude. Ensuite, 15 g d’agar sont pesés et bouillis
jusqu’à homogénéisation. Le milieu est réparti en flacons puis stérilisé à l’autoclave à 120 °C
pendant 20 minutes. En raison de la baisse du pH après autoclavage, on anticipe et ajuste le
pH à 6,6 au lieu de 6,4.
Les cultures de moisissures mésophiles sont incubées dans une étuve à 28 °C pendant
2 à 3 jours, puis on les sort de l’étuve pour l’extraction de l’ADN.
3- Extraction de l’ADN
Pour extraire l’ADN fongique à partir de colonies jeunes, nous avons utilisé trois
méthodes.
57
3.1- Micro-extraction au Chelex 100®
Le protocole utilisé est une adaptation aux champignons filamenteux du protocole

décrit pour les levures par Bernal et al., (1997). Deux cent microlitres d’eau Qualité Biologie
Moléculaire (QBM), bidistillée et stérilisée pour éliminer les DNases et Rnases, sont mis dans
un tube Eppendorf stérile de 1,5 ml. Le mycélium de moisissure (culture jeune 2 à 7 jours) est
prélevé en grattant superficiellement à l’aide de deux à trois œses de manière à éviter le risque
de prendre de la gélose, car celle-ci inhibe la PCR. Ensuite, 60 µl de la suspension
d’extraction, le Chelex 100®, sont ajoutés sous agitation. Le Chelex 100® est une résine
chélatrice contenant des billes minuscules, à peine visibles à l’œil nu, de silice capables de
fixer l’ADN. Il présente l’avantage d’éliminer de nombreux inhibiteurs de la Taq polymérase.
La suspension de mycélium est agitée à l’aide d’un agitateur rotatif « vortex » pendant 2
minutes puis portée à ébullition à 100 °C pendant 30 minutes sur un bloc chauffant ou dans un
bain-marie à sec (Figure 26). Une centrifugation (Figure 27) pendant 8 minutes à 13.000 tours
par minute permet de récupérer l’ADN en solution qui sera conservé à - 20 °C jusqu’à son
utilisation.
Figure 26: Bain-marie à sec.
58
Figure 27: Centrifugeuse, couvercle fermé (à gauche) et couvercle ouvert ( à droite) avec les tubes
d’Eppendorf de 1,5 ml et tubes de PCR ‘Ready-To-GoTM PCR Beads’.
3.2- Extraction à l’achromopeptidase
Les microtubes Eppendorf sont remplis de deux spatulettes de billes de verre et de

300 µl d’eau QBM puis stérilisés à 120 °C pendant 20 minutes. Deux à trois œses du
mycélium sont ajoutées dans le microtube qui est agité au vortex jusqu’à homogénéisation
de la suspension. On la chauffe ensuite au bain-marie à 70 °C pendant 30 minutes. On
remélange au vortex pendant 2 minutes et on prélève 80 µl de la suspension avec des cônes
dont le bout est coupé pour faciliter le prélèvement. On ajoute 3 µl d’achromopeptidase et on
réchauffe au bain-maire à 55 °C pendant 20 minutes. L’ADN en solution est séparé du
surnageant après une centrifugation à 13.000 tours par minute pendant 8 minutes.
3.3- Extraction à l’eau
Dans les microtubes Eppendorf, contenant les billes de verre et 300 µl d’eau QBM, on
ajoute trois à quatre œses de mycélium. On agite ensuite pendant 3 minutes au vortex et on
chauffe au bain-marie à sec pendant une heure à 100 °C. On centrifuge la suspension pendant
8 minutes à 13.000 tours par minutes. Deux cent microlitres du surnageant sont prélevés dans
un nouveau microtube stérile puis recentrifugés. On répète le prélèvement du surnageant et sa
centrifugation jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de particules en suspension. Ainsi, on récupère
l’ADN fongique en solution.
59
4- Amplification de la région ITS par PCR
La paire d’amorces universelles ITS1 (5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) (sens) et

ITS4 ( 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) (antisens) décrites par White et al., (1990), a
été utilisée pour l’amplification de la région ITS. Cette paire d’amorces permet d’amplifier
une partie de la séquence des gènes 18S et 28S codant pour l’ARNr et la totalité de la région
composée de l’ADNr 5,8S encadré par les deux ITS 1 et 2 (Figure 28).
Sous la hotte, la solution mère d’amorce à 100 µM est diluée extemporanément au

1/10e en QBM. Pour ce faire, on prélève 18 µl d’eau QBM et 2 µl de l’amorce ITS1, donc on
a une concentration de 0,01 µmol/ml soit 125 pmol/12,5 µl. La même chose sera pour
l’amorce ITS4. On prépare ensuite le ‘Mix’ en mélangeant 385 µl d’eau, 12,5 µl de la solution
diluée au 1/10e de l’amorce ITS1 et la même quantité pour l’amorce ITS4. Ce Mix peut servir
pour 27 réactions d’amplification.
5’ TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3’
ITS1
18S rDNA 5,8S 28S rDNA

ITS ITS
rDNA
ITS2 ITS4
5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’
Figure 28: Emplacement des amorces ITS1 et ITS4.
Les réactions de PCR sont réalisées dans des tubes de commerce prêt à l’emploi, de
type Ready-To-GoTM PCR Beads. Dans chaque tube contenant une bille de réactifs
lyophilisés, on additionne 15 µl du Mix et 10 µl de la solution d’ADN diluée au 1/10e s’il est
extrait au Chelex 100®, au ½ s’il est extrait à l’achromopeptidase, et sans dilution si
l’extraction est effectuée à l’eau. Le mélange réactionnel ainsi reconstitué contient 1,5 unité
de Taq DNA polymerase, 10 mM de NH2C(CH2OH)3HCl ‘Tris-HCl’ (pH 9,0 à température
ambiante), 50 mM de KCl , 1,5 mM de MgCl2 et 200 mM de chaque désoxynucléoside
60
triphosphate. Un test à blanc obtenu en remplaçant la solution d’ADN par un volume

équivalent d’eau ayant servi aux dilutions, est inclus dans chaque série d’amplification pour
détecter d’éventuelles contaminations.
Le mélange réactionnel contenu dans les microtubes de PCR est prêt à l’amplification.
Pour cela, on utilise un thermocycleur (Figure 29) de type PTC-100TM Programmable
Thermal Controller (MJ Research, Inc., Watertown, MA, USA). Le protocole utilisé est celui
décrit par Attili et al., (1998) légèrement modifié. La réaction de PCR commence par une
étape de dénaturation initiale de 3 minutes à 95 °C, ensuite l’amplification est assurée par
l’itération de cycles en nombre de 45 durant lesquels a lieu une dénaturation à 95 °C pendant
soixante secondes, une hybridation des deux amorces ITS1 et ITS4 à 54 °C pendant 60
secondes, et une extension à 72 °C pendant 120 secondes. A la fin du dernier cycle,
l’amplification est achevée par une extension finale de 7 minutes. La réaction de PCR dure
généralement de 3 à 4 heures.
Figure 29: Thermocycleur pour l’amplification de l’ADN.
61
5- Contrôle de l’amplification sur gel d’électrophorèse
La qualité de la réaction de PCR est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à
2 % (p/v). Ainsi, on pèse 0,6 g d’agarose que l’on mélange dans 30 ml de TAE 1X (0,04 M
Tris-acétate pH 8,3 ; 0,001 M EDTA), et on porte la préparation à ébullition jusqu’à
dissolution de l’agarose. Quand la température du gel est descendu à environ 50 °C, on y
ajoute 2 gouttes de Bromure d’éthidium (BET) (0,5 µg/ml) qui joue le rôle du révélateur en
s’intercalant entre les bases puriques et pyrimidiques de la double hélice des fragments de la
région ITS. Après solidification du gel dans la cuve d’électrophorèse (Figure 30) et on y
dépose un mélange de 3 µl d’eau qualité biologie moléculaire, 2 µl du bleu de bromophénol
et 1 µl d’amplifiat. On réserve un puits pour mettre 1 µl du marqueur de taille de 100 pb.
Après que l’on ait déposé les échantillons sur le gel immergé dans du tampon TAE 0,5 X, on
met le système d’électrophorèse (Figure 31) sous une tension de 90 volts pour la séparation
des fragments d’ADN. Ceux-ci chargés négativement par la présence de leurs groupements
phosphate, migrent, pendant 45 minutes environ, vers l’anode en fonction de leur masse
moléculaire et de leur encombrement stérique. Les bandes d’ADN sont, enfin, visualisées par
fluorescence du BET sous les rayons ultraviolets (figure 32).
Figure 30: Cuve du gel d’agarose avec les traces de migration des fragments de l’ADN.
Figure 31: Installation d’électrophorèse.
62
Figure 32: Installation de visualisation sous UV avec appareil de photographie

instantanée du type Polaroid.
6- Séquençage des produits d’amplification
Le séquençage est réalisé par un laboratoire privé appelé ‘BIOFIDAL’ ; 170 avenue
Gabriel Peri, 69120 Vaulx en Velin. On envoie les tubes d’amplifiats accompagnés d’une
fiche :
Référence : SSBN 550.

Nom de l’échantillon : xyz (i.g : 785).
Taille du produit PCR : Taille déterminée sur le gel (i.g : 600 pb).
Concentration et volume : 20 ng/µl ; 25µl.
Méthode de purification : SPCR 002.
Nom de l’amorce : ITS4
Le séquençage simple brin est réalisé en utilisant l’amorce ITS4. La purification des
produits d’amplification, qui est une opération indispensable, est entreprise par le même
laboratoire du séquençage.
63
7- Analyse des séquences
Nous recevons les chromatogrammes des ADN via Internet et nous les traitons par le
logiciel Chromas 162 (figure 33).
- Tout d’abord, on ouvre le chromatogramme, on sélectionne ensuite la partie à supprimer au

début de la séquence (~ 50 pb) en plaçant le curseur entre deux bases et en cliquant sur le
bouton ‘Edit’ puis sur ‘Set Left Cutoff’. La partie colorée en jaune ne sera pas prise en
compte dans la suite de l’analyse.
- Pour modifier une base, on clique dessus puis on écrit la lettre jugée correcte.
- On sélectionne la partie à supprimer à la fin de la séquence en cliquant sur ‘Edit’ puis sur
‘Set Right Cutoff’.
- On copie la séquence en cliquant sur ‘Edit’ puis ‘Copy sequence’ ensuite ‘FASTA Format’.
- Enfin, on soumet la séquence ainsi copiée dans BlastTM , qui est un logiciel disponible sur le
site international du National Health Institute, USA
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO_FORMAT=
Semiauto&ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Tabular&CLIENT=web&DATABASE=nr&DESCR
IPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=%28none%29&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_OBJECT=Align
ment&FORMAT_TYPE=HTML&NCBI_GI=on&PAGE=MegaBlast&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x
=34&SET_DEFAULTS.y=8&SHOW_OVERVIEW=on&END_OF_HTTPGET=Yes&SHOW_LINKOUT=y
es&GET_SEQUENCE=yes&PERC_IDENT=None,1,-2) et qui permet de rechercher dans la banque
TM
de données GenBank les séquences analogues à celles obtenues par séquençage.
Figure 33: Séquence d'ADN traitée par le logiciel Chromas.
64
RESULTATS ET DISCUSSION
65
1- Culture des souches
Nous avons réensemencé les 134 souches de moisissures sur milieu MEA dans des
boîtes de Petri, et les avons incubé pendant 72 heures à 28 °C. Hormis les souches
d’Alternaria sp. (LOMY 835), de Rhizopus sp. (LOMY 785) et de Trichoderma sp. (LOMY
796), les 131 souches restantes ont toutes bien poussé (figure 34).
Figure 34: Culture des moisissures sur milieu Malt Extract Agar ‘MEA’.
Nous avons fait plusieurs tentatives de réensemencement des 3 souches ont toutes
échouées. Nous pensons que nous les avons perdu lors de leur période de conservation.
2- Extraction et amplification de l’ADN
Dans ce qui suit, nous allons d’abord décrire les résultats obtenus lors de la première
période de notre travail (2004), puis les résultats obtenus pendant la deuxième période (2005).
66
Première période [ septembre-décembre 2004]
En se basant sur des caractères morphologiques macroscopiques, nous avons choisi 32

souches, chacune est susceptible de représenter un groupe de moisissures de même espèce.
Pour ce qui est d’Aspergillus fumigatus, nous avons estimé que l’identification
morphologique basée sur les caractères culturaux était suffisante pour la délimitation de cette
espèce puisqu’elle est la seule à se développer à 50°C parmi les espèces d’Aspergillus.
La première méthode d’extraction que nous avons utilisé est la micro-extraction au

Chelex 100®. C’est une méthode qui est généralement utilisée pour l’extraction de l’ADN des
moisissures au niveau du Laboratoire de Mycologie Fondamentale et Appliquée aux
Biotechnologies Industrielles de la Faculté de Pharmacie, Université Claude Bernard, Lyon I.
Vu que nous n’avons pu amplifier que 3 extraits d’ADN sur 14, soit un pourcentage de
21 %, nous avons pensé que la concentration du Chelex 100® est à l’origine de ce mauvais
résultat. Nous avons, alors, tenté de trouver une zone d’équilibre entre la concentration en
Chelex 100® et celle de l’ADN. Autrement dit, la zone où le Chelex 100® n’aurait pas d’effet
inhibiteur sur la PCR et où la quantité d’ADN serait suffisante pour l’amplification. Pour ce
faire, nous avons dilué davantage les échantillons d’ADN que l’on met dans les tubes de PCR
pour l’amplification. Ainsi, au lieu de travailler avec des dilutions de 1/10e, nous avons utilisé
des dilutions de 1/20e et 1/50e.
Malheureusement, nous n’avons pas pu amplifier les extraits d’ADN des souches
choisies par cette méthode.
Par conséquent, nous avons essayé une deuxième méthode qui est l’extraction à
l’achromopeptidase pour 23 souches et nous avons eu 9 amplifications.
Pour parvenir à amplifier l’ADN des moisissures restantes, nous avons fait appel à la
troisième méthode la plus simple qui est l’extraction à l’eau. Sur 13 champignons, nous avons
réussi à amplifier l’ADN de 5 souches.
A la fin de cette première période de stage en France en 2004, nous avons réussi à
amplifier l’ADN de 17 champignons filamenteux en utilisant trois méthodes différentes
(tableau 9).
67
Deuxième période [mai-juin 2005]
Lors du deuxième stage en France en 2005, nous avons repris la méthode d’extraction
au Chelex100® et nous l’avons légèrement modifiée. La première modification concerne le
temps d’agitation au vortex que nous avons augmenté à 4 minutes au lieu de 2. La deuxième,
correspond à la reprise de la centrifugation quatre à cinq fois surtout lorsqu’il s’agit
d’Aspergillus niger, Penicillium flavus ou autre espèce produisant abondamment des spores.
Celles-ci nuisent beaucoup à l’amplification. La troisième modification, a trait à la révélation
des bandes sur gel électrophorétique. Nous avons concentré davantage l’ADN déposé dans les
puits du gel en optant pour la composition suivante : 4 µl d’eau QBM, 2 µl du bleu de
bromophénol et 1 µl d’amplifiat. Les résultats obtenus étaient très satisfaisants. Ainsi, nous
sommes parvenus à amplifier l’ADN de 22 souches parmi 24 représentatives de la collection.
Au total, nous avons réussi à amplifier l’ADN de 39 champignons filamenteux.
Tableau 9: Résultats d’amplification de l’ADN en fonction de la méthode d’extraction utilisée.
Méthode d’extraction
Souches Chelex® Achromopeptidase Eau
Première période
LOMY 11 - - -
LOMY 13 - - -
LOMY 190 - - -
LOMY 21 - - -
LOMY 328 - - -
LOMY 367 NE + NE
LOMY 781 - + NE
LOMY 782 - - +
LOMY 784 - - NE
LOMY 785 - + NE
LOMY 786 - - -
LOMY 788 NE + NE
LOMY 791 - - -
LOMY 792 - - -
LOMY 794 + - NE
LOMY 803 NE + NE
LOMY 805 - - -
LOMY 807 NE + NE
LOMY 808 - - -
LOMY 815 NE + NE
LOMY 826 - - -
LOMY 837 NE NE +
LOMY 840 NE + NE
LOMY 841 NE + NE
68
Tableau IX (suite)
Souches Chelex® Achromopeptidase Eau
LOMY 846 NE NE +
LOMY 848 NE NE +
LOMY 855 NE NE +
KLM 26 + NE -
KLM 113 - NE -
KLM 122 - NE -
KLM 166 + NE -
Deuxième période
LOMY 1 + NE NE
LOMY 784 + NE NE
LOMY 786 + NE NE
LOMY 791 + NE NE
ZNM 1 + NE NE
ZNM 9 + NE NE
ZNM 10 + NE NE
ZNM 13 + NE NE
ZNT 15 + NE NE
ZNT 16 + NE NE
ZNM 17 - NE NE
ZNM 20 + NE NE
ZNM 60 + NE NE
ZNM 75 + NE NE
ZNM 83 + NE NE
ZNM 85 + NE NE
ZNM 86 + NE NE
ZNM 89 + NE NE
ZNM 92 - NE NE
ZNM 102 + NE NE
ZNM 109 + NE NE
H1 - NE NE
H2 + NE NE
H 17 + NE NE
(+) : ADN amplifié ;

(-) : ADN non amplifié ;
NE : non expérimenté.
La migration électrophorétique et la visualisation sous rayons ultra-violets nous ont

permis de nous assurer de l’amplification de l’ADN (figure 35).
69
Première série de puits Deuxième série de puits

Marqueur de poids moléculaire
Bande d’ADN 650 pb
Bande d’ADN 600 pb
Reste des amorces ITS1 et ITS4
Figure 35: Visualisation sous UV de la migration des bandes d'ADN sur le gel d'Agarose
à double série de puits (utilisation de la partie gauche).
3- Analyse des séquences
Après le traitement informatique du chromatogramme obtenu du séquenceur

automatique, nous avons soumis les séquences dans BlastTM pour la recherche des séquences
analogues dans les banques de données GenBankTM. Le résultat que l’on obtient est une liste
de souches dans l’ordre décroissant : de la souche analogue la plus probable à la souche
analogue la moins probable. Les figures [36 à 72] et tableaux [10 à 46] résument et regroupent
les résultats par genre. On note que malgré l’amplification de l’ADN des deux souches KLM
26 et H 2, leurs séquences respectives sont inexploitables.
70
Genre Aspergillus
Tableau 10: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 1.
ZNM 1
Identification moléculaire N° d’accession Probabilité1 Gap2
Aspergillus oryzae souche SRRC 2103 AY373857 556/563 (98%)
Aspergillus flavus souche SRRC 1000A AY373848 556/563 (98%)
Ab.G3
Aspergillus oryzae NRRL 506 AF459735 546/554 (98%)
Aspergillus flavus souche UWFP 533 AY214444 546/554 (98%)
Identification morphologique Aspergillus flavus
1 TCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAGATTGATTTGCGTTCGGC 60
61 AAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGC 120
121 GGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAGAGGGGACGACGACCCAACACAC 180
181 AAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGG 240
241 GGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTAGTTAT 300
301 CGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTA 360
361 ACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCAGACAGAGTTCGTGGTGTCTCC 420
421 GGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCGCCGAAG 480
481 CAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGT 540
541 AATGATCCTTCCGCAGGTTCACCCTAGAA 569
ZNM 1
Figure 36: Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNM 1.
Aspergillus oryzae est isolé fréquemment au Japon à partir de « Koji », et rarement

d’autres sources. Cette espèce produit de l’acide kojique, l’acide Cyclopiazonique, la
Maltoryzine et l’acide 3-Nitropropionique.
Aspergillus flavus est retrouvé sur sols cultivés, végétaux en décomposition, graines,
épices, parfois fruits secs. Il produit des mycotoxines (aflatoxines B1 et B2), l’acide
aspergillique, l’acide kojique, l’acide cyclopiazonic, l’acide 3-nitropropionique.
1
: La probabilité est calculée en divisant le nombre de nucléotides de la séquence analogue par
le nombre de nucléotides de la séquence d’ADN de la souche étudiée.
2
: Le ‘Gap’ est le pourcentage de nucléotides que le logiciel Blast élimine pour établir
l’analogie entre la séquence d’ADN de la souche étudiée et la séquence nucléotidique de la
banque de données.
3
: Absence de Gap.
71
ZNM 9
Identification moléculaire N° d’accession Probabilité Gap
Aspergillus tubingensis AJ280008 558/568 (98%)
Aspergillus niger souche UWFP 515 AY213633 558/568 (98%)
Ab.G
Aspergillus tubigensis souche CBS AF455522 557/568 (98%)
Aspergillus niger isolat wb209 AF455522 555/568 (97%)
Identification morphologique Aspergillus awamori
Aspergillus tubingensi est le nom synonyme d’Aspergillus niger var. tubingensis.
1 ACTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAATGGTTGGAAAACGTC 60
61 GGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGA 120
121 CGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACA 180
181 CACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAG 240
241 GGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTT 300
301 ATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTT 360
361 TAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGT 420
421 CTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAAAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGG 480
481 CCCGCCGAAACAACAGGGTATTATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGAACCGCA 540
541 CTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTGAAG 575
ZNM 9
Les champignons N°: ZNM : 20, 22, 28, 32, 47, 57, 90 et 101 sont similaires, du point de vue
morphologique, à ZNM 9.
ZNM 10
Ab.G
Aspergillus tubigensis souche CBS 134.48 AJ223853 530/539 (98%)
Identification morphologique Aspergillus carbonarius
72
1 TGTCACCCTGGAAAAAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCA 60
61 TGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCC 120
121 GTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGA 180
181 CGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGA 240
241 TGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGAT 300
301 GCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGAC 360
361 TGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAA 420
421 AGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTATAATAGAC 480
481 ACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 540
ZNM 10
Les champignons N°: Z NM 12, 84 et 85 sont similaires, du point de vue morphologique, à

ZNM 10.
ZNM 13
Ab.G
Identification morphologique Aspergillus niger
1 CTTAGTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAATGGTTGGAAAAC 60
61 GTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATC 120
121 GGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCA 180
181 GGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCA 240
241 ACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATAC 300
301 CAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTA 360
361 GTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAG 420
421 TTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGG 480
481 GGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAAAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGC 540
541 GGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTATAATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCC 600
601 GCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 632
ZNM 13
Les champignons N°: ZNM 16, 17, 23, 29 et 91, sont similaires, du point de vue
73
ZNT 15
Aspergillus fumigatus isolat wb161 AF455542 485/508 (95%) 5/508 (0%)
Identification morphologique Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus est un contaminant très fréquent des matières organiques humides et
des composts dont il entraîne une rapides décomposition avec dégagement de chaleur.
C’est un agent d’aspergillose aviaire et humaines, il doit être manipulé avec précaution. Il
élabore plusieurs métabolites dont plusieurs très toxiques : fumagilline, acide helvolique,
gliotoxine, dérivés quinoniques, alcaloïdes voisines de ceux de l’ergot de seigle.
1 AGAATAAAAACATCCTTgCTAATCTTAGAccAaGAAAGATGTGTGTCGGCTGGCGCCGGC 60
61 CGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAGTCCCATAtGCTCGAGAGATCGGACGCGGTGCCGCC 120
121 GCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATAGGGGGACGGGGGCCCAAtACACAAGCCGTGC 180
181 TTGAGGGCATCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGCGAATACCATGGGGCGCAATG 240
241 TGCGTGCAActACTCAATGATTCACTGAATTCTGCAATTCAGATNACTTATCGCATTTCG 300
301 CTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTAACTGATTA 360
361 CCATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGGCGGG 420
421 CGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGGCGGNCGTCAAAACGGTGGGCCCGCCGAAGC 480
481 AACAAGGTACGATAGACACGGGTTGGGAGGTTGGACCCAATAGGGCCCTCACTCGGTAAT 540
541 GATCCTTCCGGAAGGTTCACCTtACGGAAGGG 573
ZNT 15
Figure 40: Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNT 15.
Les champignons N°: ZNT :17, 18, 20, 24, 32, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 51, 61, 68, 74, 79
et 80 sont similaires, du point de vue morphologique, à ZNT 15 et ZNT 16.
74
Tableau 15: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNT 16.
ZNT 16
Aspergillus fumigatus souche SRRC 43 AY373851 495/559 (88%)
Aspergillus fumigatus souche UWFP 500 AY214447 495/559 (88%) Ab.G
Aspergillus fumigatus souche ATCC 16907 AY214446 495/559 (88%)
Aspergillus fumigatus souche UWFP AY214448 495/559 (88%)
1 GGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCG 60
61 GTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAACACACA 120
121 AGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGG 180
181 CGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCG 240
241 CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAANAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAC 300
301 TGATTACGATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTC 360
361 GGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCGAAACGGCGGGCCCGC 420
421 CGAAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGG 480
481 TAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAGGG 515
ZNT 16
Figure 41: Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche ZNT 16.
ZNM 20
Aspergillus niger souche UWFP 515 AY213633 530/538 (98%) Ab.G
Identification morphologique Aspergillus awamori
1 TGTCACCCTGGAAAAAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCA 60
61 TGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCC 120
121 GTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGA 180
181 CGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGA 240
241 TGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGAT 300
301 GCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGAC 360
361 TGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAA 420
421 AGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTATAATAGAC 480
481 ACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 540
ZNM 20
75
ZNM 85
Aspergillus niger isolat wb209 AF455522 547/556 (98%) 2/556 (0%)
Aspergillus niger souche IMI 050566 AY656630 547/556 (98%) 2/556 (0%)
Aspergillus niger souche ATCC 16888 AY373852 547/556 (98%) 2/556 (0%)
Aspergillus foetidus souche SRRC 321 AY373850 547/556 (98%) 2/556 (0%)
Aspergillus awamori souche SRRC 332 AY373840 547/556 (98%) 2/556 (0%)
Identification morphologique Aspergillus carbonarius
1 TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAA 60
61 TCCTACAGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTG 120
121 CCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGA 180
181 GGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGT 240
241 TCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCG 300
301 TTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCA 360
361 ATCAACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGG 420
421 CCCGGGGGGCAGAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAG 480
481 GGTACAATAGACACGGATGGGGAAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCC 540
541 TTCCGCAGGTTCACCTTACGGAAGG 565
ZNM 85
ZNM 102
Aspergillus flavus souche SRRC 1000A AY373848 555/563 (98%) Ab.G
Aspergillus flavus souche UWFP 533 AY214444 555/563 (98%)
Identification moléculaire Aspergillus flavus
1 CTTTAGTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAGATTGATTTGCG 60
61 TTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATC 120
121 GGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAGAGGGGACGACGACCCA 180
181 ACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATA 240
241 CCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACT 300
301 AGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAA 360
361 GTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCAGACAGAGTTCGTGGT 420
421 GTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCG 480
481 CCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACA 540
541 CTCGGTTATGATCCTTCCGCAGGTTCACC 569
ZNM 102
76
ZNM 109
Aspergillus flavus souche UWFP 570 AY214445 547/554 (98%) Ab.G
Aspergillus oryzae souche SRRC 2103 AY373857 547/555 (98%) 1/555 (0%)
Aspergillus flavus souche SRRC 1000A AY373848 547/555 (98%) 1/555 (0%)
Aspergillus oryzae NRRL 506 AF459735 547/555 (98%) 1/555 (0%)
Aspergillus flavus souche UWFP 533 AY214444 547/555 (98%) 1/555 (0%)
Identification morphologique Aspergillus flavus
1 TATCCTATCTTAACCGCGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAGATTGATTT 60
61 GCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGG 120
121 ATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAGAGGGGACGACGAC 180
181 CCAACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGA 240
241 ATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCAC 300
301 ACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTG 360
361 AAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCAGACAGAGTTCGT 420
421 GGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGC 480
481 CCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCT 540
541 ACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACT
573
ZNM 109
Tableau 20: Identification morphologique et moléculaire de la souche H 17.
H 17
Aspergillus fumigatus souche SRRC 43 AY373851 476/553 (86%) 1/553 (0%)
Aspergillus fumigatus souche UWFP 500 AY214447 476/553 (86%) 1/553 (0%)
Aspergillus fumigatus souche ATCC 16907 AY214446 476/553 (86%) 1/553 (0%)
Aspergillus fumigatus souche UWFP AY214448 476/553 (86%) 1/553 (0%)
1 CTCCNGTAGCGGTATCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAAAATATAGTTGGGTGTC 60
61 NGCTGGCGCCGTCCGGGCCTACAAAGCAGGTGAtttacCCCCATACGCTCTACGACCGGA 120
121 CGCGGTGCCGACGTGTGTCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAAC 180
181 ACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCA 240
241 GGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACT 300
301 TATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTT 360
361 TTAACTGATTACGATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGG 420
421 TCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCGAAACGGCGGG 480
481 CCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCA 540
541 CTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACTACGGAAAGG 579
H 17
Figure 46: Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche H 17.
77
Tableau 21: Identification morphologique et moléculaire de la souche LOMY 1.
LOMY 1
Aspergillus flavus souche SRRC 1000A AY373848 546/554 (98%)
Ab.G
Aspergillus flavus strain UWFP 533 AY214444 546/554 (98%)
1 TATCCCTAGCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAGATTGATTTGCGTTCGGCAAGCGCCG 60
61 GCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGC 120
121 CGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGGAGAGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTG 180
181 CTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAAT 240
241 GTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTC 300
301 GCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTG 360
361 CGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCAGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCG 420
421 CGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAG 480
481 GTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCC 540
541 TTCCGCAGGTTCAC
554
LOMY 1
Figure 47: Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche LOMY 1.
LOMY 367
Aspergillus ochraceus souche ATCC 18412 AY373854 540/552 (97%) 5/552 (0%)
Aspergillus ochraceus souche SRRC 65 AY373855 535/552 (96%) 5/552 (0%)
Identification morphologique Aspergillus ochraceus
Aspergillus ochraceus est une espèce synonyme de Sterigmatocystis ochracea.

Aspergillus ochraceus est principalement responsable de la pourriture des semences et des
graines. Ce champignon produit l'Ochratoxine A et l’acide pénicillique.
78
1 TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGATGAAATAGATTGGTTGCTTTTCAGCGTCGGCCA 60
61 GCAGCCGGCCGGGCCTACAAGAGCGGTGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACG 120
121 CGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCNNNNNNNNACGACGACCCAACACACA 180
181 AGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATACCCCCCGGAATACCAGGGGG 240
241 TGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAATTATCG 300
301 CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAAC 360
361 TGATTGCGATACAATCGACTCAGACGACAAAACTTCAGACAGTGTTCACGTTGGTGTCTC 420
421 CGGCGAGCGCTGTGCCACCCCTAAAGGATAGGGGGGCGGGCTCGCCGAAGCAACAAGGTA 480
481 CGGTATACACGGGTGGGAGGTTGGGCCCCGAGGGACCCTCACTCAGTAATGATCCTTCCG 540
541 CAGGTTCACCTA 552
LOMY 367
LOMY 791
Aspergillus niger isolat wb209 AF455522 526/533 (98%) Ab.G
Aspergillus niger souche IMI 050566 AY656630 526/533 (98%)
Aspergillus niger souche ATCC 16888 AY373852 526/533 (98%)
Aspergillus foetidus souche SRRC 321 AY373850 526/533 (98%)
Aspergillus awamori souche SRRC 332 AY373840 526/533 (98%)
Identification morphologique Aspergillus niger
Aspergillus niger est un cosmopolite, il est fréquemment retrouvé dans les céréales, les
fruits et les légumes moisis, le fourrage, les produits laitiers, les arachides. Il est très
utilisé dans l'industrie agro-alimentaire pour la production de divers acides. Il produit
l’acide oxalique, la flavaspérone et les aflatoxines par certaines souches.
Aspergillus foetidus est retrouvé sur le sol, substrats organique variés.
Aspergillus awamori est une moisissure lipolytique des oléagineux. Il produit les
malformines, toxique pour les animaux et à l’origine de malformations d’organes
végétaux.
79
1 TGATCCGAGTCAACTGGAAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTAC 60
61 AGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTC 120
121 GGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAG 180
181 CAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAG 240
241 ACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTC 300
301 ATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAAC 360
361 TCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGG 420
421 GGGCAGAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTACA 480
481 ATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAG 540
541 GTTCAC 546
LOMY 791
Genre Certocystis
LOMY 785
Identification moléculaire N° d’accession Probabilité Gaps
Ceratocystis adiposa AF275545 460/462 (99%) 2/462 (0%)
Ceratocystis adiposa AF043606 460/462 (99%) 2/462 (0%)
Identification morphologique Ulocladium sp.
Ceratocystis adiposa.
Position dans la classification
Fungi, Ascomycota, Ascomycetes, Sordariomycetidae, Microascales, Ceratocystidaceae.
Synonymes : Ceratocystis major ; Ceratostomella adiposa et Sphaeronaema adiposum.
1 ACACCCGACCGAGGTCAACCTTACAAAAGTGGGTTGTTTTACGGCATGTTGTACAAGAGG 59
60 TTCAAAGCGTAACACAAAGTTTTACTACGCAGGGAAGCTGCAAATACTACAGCCGATGCA 119
120 TTTCGGCGGCCCGCTTGACAGCGGGTCCTCCAACACCAAGCGAAGCTTGAGTGGTGAAAT 179
180 GACGCTCGGACAGGCATGCCTAGCAGAATACTGCTAGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTC 239
240 GATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCG 299
300 ATGCTAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTATTTGTTAAATGCAACTCAGC 359
360 AATGAATAATTCTCTAGAAATTAAAAGAGTTTGTAAAATACTACCGGCACAATCCCGAAG 419
420 GACCACGCCAAAGCAGTAAAGATAGGTATGTTCACAAAATGGTTTTAGAGTTGAAA 475
LOMY 785
80
Genre Fusarium
LOMY 807
Fusarium sporotrichioides AY188917 343/349 (98%) Ab.G
Fusarium kyushuense souche
U85547 338/343 (98%) 1/343 (0%)
NRRL25348
Fusarium sporotrichioides var. minor
AF414973 338/345 (97%) Ab.G
strain BBA 62425
Fusarium sporotrichioides souche
AF414970 338/345 (97%)
BBA 70746
Fusarium sporotrichioides NRRL AF006348
338/345 (97%)
25479
1/343 (0%)
Fusarium sporotrichioides NRRL
AF006347 338/345 (97%)
25474
Fusarium kyushuense souche BBA
AF414971 337/343 (98%)
70812
Identification morphologique Acremonium sp.
Fusarium sporotrichioides produit des mycotoxines appartenant au groupe des

Trichothecenes.
Fusarium kyushuense.

Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Sordariomycetes; Hypocreomycetidae; Hypocreales;
mitosporic Hypocreales; Fusarium.
1 ttgggggtttaacggcttggccgcgccgcgttccagttgcgaggtgttagctactacgca 60
61 atggaggctgcagcgagaccgccactagatttcggggccgggctgctggagtac---agc 120
121 ccgatccccaacaccaaacccgggggcttgagggttgaaatgacgctcgaacaggcatgc 180
181 ccgccagaatactggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctg 240
241 caattcacattacttatcgcattttgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatc 300
301 cgttgttgaaagttttgatttatttgttttttagactcagaagttacactaaaa-tcaga 360
361 gttttgtggttcctgcggcgggccgtcccgttttacggggcgcgggctgatccgccgagg 420
421 caacataaaggtatgttcacaggggtttgggagttgtaaactcggtaatgatccctccgc 480
481 aggttcacc 490
LOMY 807
81
LOMY 855
Fusarium redolens X94169 X93905 509/510 (99%) A.G.
Fusarium oxysporum isolat 12-151 AY667488 504/511 (98%) 3/511 (0%)
Fusarium oxysporum souche
AY669119 504/511 (98%) 3/511 (0%)
F-X.1.7-030520-(1-1)
Fusarium oxysporum souche
AY669126 504/511 (98%) A.G.
F-X.1.7-030520-13
Fusarium annulatum souche CBS AY213654
258.54 502/511 (98%) 1/511 (0%)
Identification morphologique Geotrichum sp.
1 ctgatccgaggtcaacattcagaagttgggggtttaacggcttggccgcgccgcgttcca 60
61 gttgcgagggttttactactacgcaatggaggctgcagcgagaccgccactagatttcgg 120
121 ggccggcttgccagaaaggctcgccgatccccaacaccaaacccgagggcttgagggttg 180
181 aaatgacgctcgaacaggcatgcccgccagaatactggcgggcgcaatgtgcgttcaaag 240
241 attcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcattttgctgcgttcttc 300
301 atcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgatttatttatggttttactc 360
361 agaagttacatatagaaacagagtttaggggtcctctggcgggccgtcccgttttaccgg 420
421 gagcgggctgatccgccgaggcaacagtaaggtatgttcacaggggtttgggagttgtaa 480
481 actcggtaatgatccctccgcaggttcacc 510
LOMY 855
82
Genre Geotrichum
LOMY 803
Galactomyces geotrichum AJ279451 321/325 (98%) 1/325 (0%)
Dipodascus australiensis AF157596 317/325 (97%) 1/325 (0%)
Galactomyces geotrichum est le nouveau nom de l’espèce Dipodascus geotrichum. C’est

une espèce téléomorphe de Geotrichum candidum.
Fungi; Ascomycota; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales;

Dipodascaceae; Galactomyces.
Dipodascus australiensis.

Fungi; Ascomycota; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales;
Dipodascaceae; mitosporic Dipodascaceae; Dipodascus.
1 ctgaggttgaactagtgttgtttttcaaacgaatttgattcgaaattttagaagagcaaa 60
61 gcaattccaagagagaaacaacgctcaaacaagtatactttgggggataccccaaagtgc 120
121 aatgtgcgttcaaaaactgatgattcacttctgcaattcacaagaaatatcgcgtttcgc 180
181 tgcgttcttcatcgatacgagaaccaagagatccattgttaaaagttttaattatttaag 240
241 tattgattgtatgattgatgtttgctgtggtaaattcacaaatattattaattcataatg 300
301 atccttccgcaggttcacctacgga 325
LOMY 803
83
LOMY 840
Galactomyces geotrichum AJ279445 239/242 (98%)
Ab.G
Dipodascus australiensis AF157596 235/242 (97%)
1 ttgactagtgttgtttttcaaacgaatttgattcgaaattttagaaaagcaatgcaattc 60
61 caagagagaaacaacgctcaaacaagtatactttgggggataccccaaagtgcaatgtgc 120
121 gttcaaaaactgatgattcacttctgcaattcacaagaaatatcgcgtttcgctgcgttc 180
181 ttcatcgatacgagaaccaagagatccattgttaaaagttttgattattttggtttggat 240
241 tg 242
LOMY 840
ZNM 86
Ab.G
Identification morphologique Penicillium sp.
1 GTAcCTAACAaGTAATCCTACTTGATCTGAGGTTGAATAGTGTTGTTTTTCAAACGAATT 60
61 TGATTCGAAATTTTAGAAAAGCAATGCAATTCCAAGAGAGAAACAACGCTCAAACAAGTA 120
121 TACTTTGGGGGATACCCCAAAGTGCAATGTGCGTTCAAAAACTGATGATTCACTTCTGCA 180
181 ATTCACAAGAAATATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATACGAGAACCAAGAGATCCA 240
241 TTGTTAAAAGTTTTGATTATTTTGGTGTTGAtTATAAAATTATTGTTTGCTGTGTAAATT 300
301 TCACAAATATTAtTAATTCTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAAGG 355
ZNM 86
84
ZNM 83
Ab.G
1 CAGCGGGTAATCCTACTTGATCTGAGGTTGAATAGTGTTGTTTTTCAAACGAATTTGATT 60
61 CGAAATTTTAGAAAAGCAATGCAATTCCAAGAGAGAAACAACGCTCAAACAAGTATACTT 120
121 TGGGGGATACCCCAAAGTGCAATGTGCGTTCAAAAACTGATGATTCACTTCTGCAATTCA 180
181 CAAGAAATATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATACGAGAACCAAGAGATCCATTGTT 240
241 AAAAGTTTTGATTATTTTGGTTTTGATTGTANNATTATTGTTTGCTGTGTAAATTTCACA 300
301 AATATTATCAATTCTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAGGAT 350
ZNM 83
Genre Mucor
LOMY 788
Identification moléculaire N°d’accession Probabilité Gaps
Mucor racemosus souche UWFP AY213662 575/588 (97%) 2/588 (0%)
Mucor racemosus sequevar 1 souche UWFP AY213660 574/588 (97%) 2/588 (0%)
Mucor racemosus souche NRRL 1428 AY625074 557/570 (97%) Ab.G
Mucor racemosus souche UWFP 1053 AY213661 557/570 (97%) 1/570 (0%)
Mucor racemosus f. racemosus souche CBS
AY213659 557/570 (97%) Ab.G
260.68
Identification morphologique Mucor sp.
Mucor racemosus est très répandu et souvent isolé du sol, des excréments de
bétail, des produits laitiers et carnés, des oeufs, des fruits et légumes, des céréales,
du foin, etc. Il peut provoquer une fermentation alcoolique en milieu mal aéré. Il
serait expérimentalement toxique pour les animaux.
85
1 TCCCACCTGATTTAGATAAATTTAAAAGAGATTTATTTGGGAGGCCCCATCAAAGTCA 58
59 ATTACAAGAGCTTTCCTTTATATTAAAAAAAAGTTCAGGCATTAAACAAGTTCAGGCCTT 118
119 AGTAAATTTCAAGGGTTTCAAGATCTATACAGATCGAGAGGCCCCCAATAATCCTATACA 178
179 ACAAAAGTTGAATAGAGGGTTTGTTTTGATACTGAAACAGGCGTGCTCATTGGAATACCA 238
239 ATGAGCGCAAGTTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTT 298
299 ATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTG 358
359 TTTTATAGATTTTTTAGGTCTATGTTACAATATTAATTCTGAATTCATTTGGTAAATAAT 418
419 AATAGGATACCAGGCCTAAACCTGATTATGACTCGGTTAACATTTCCAATGTCTATCCTT 478
479 ATAACATTGGAACATCCCTCAAACGTCAAATAATAATACAGTTCACAGTAAATAGATAAT 538
539 AATGGACAAGCCAAGATTATTGATTATTTAATGATCCTTCCGCAGGTT 586
LOMY 788
LOMY 837
Mucor fragilis AF474242 569/578 (98%) Ab.G
Mucor fragilis AJ608958 567/578 (98%) 1/578 (0%)
1 agatttcagatcaaatttaaagatgtgttatttgggaggccccagcacagttttatcgcaa 61
62 gagcttctctttatattnnnnnnnngttcaggcattcaaacaagatcaggcctttgtata 121
122 tttcaagaggttcaagatcagaatagatcaagagactctcagtcatcctattcaacaaaa 181
182 gttggatagagggtttgttttgatactgaaacaggcgtgctcattggaataccaatgagc 241
242 gcaagttgcgttcaaagactcgatgattcactgaatatgcaattcacactagttatcgca 301
302 ctttgctacgttcttcatcgatgcgagaaccaagagatccgttgttaaaagttgttttat 361
362 agattttttacgtctatgttacaatattaattctgaattcttttggtaaataataatagg 421
422 ataccaagcctaagcttgattatgactcggttaacatttccagtgcctatccttatagca 481
482 ttggaacatccctcaagcgtcaagtaataatacagttcacagtaaatagataatgatgga 541
542 caagccaaaattattgattatttaatgatccttccgca 579
LOMY 837
86
Genre Paecilomyces
LOMY 782
Paecilomyces variotii souche ATCC
AY373941 248/255 (97%)
22319
Paecilomyces variotii isolat wb556 AF455416 248/255 (97%) Ab.G
Paecilomyces variotii AY247956 248/255 (97%)
Paecilomyces variotii souche NRRL 1115 AF033395 248/255 (97%)
Paecilomyces variotii est l’un des Paecilomyces les plus communs, c’est contaminant
fréquent des aliments.
Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae;

mitosporic Trichocomaceae; Paecilomyces.
Synonymes: Penicillium divaricatum et Penicillium viniferum.
1 gggtatccctacctgatccgaggtcaacctaagaga-aatataggtgaccgtgaaggtcg 59
60 tgtggccagcaagccggccggttctactgaagcgtgtgacaaagccccatacgctcgagg 119
120 accggacgcgacgccgccgctgcctttcgggcccgtcccccnnnnnnnnnnacggcggcc 179
180 caacacaccagccgggctggagggttagcaatgacgctcggacaggcatgccccccggaa 239
240 tgccagggggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcacggaattctgcaattcaca 299
300 ttacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaaccaagagatccgttgttga 359
360 aagttttaattgattgattgtatactcaaacggcaaccttccaggcagcgttccaggggt 419
LOMY 782
87
LOMY 806
Paecilomyces variotii souche ATCC
AY373941 518/518 (100%)
22319
Paecilomyces variotii isolat wb556 AF455416 515/515 (100%)
Ab.G
Paecilomyces variotii souche NRRL
AF033395 500/500 (100%)
1115
Paecilomyces variotii AY247956 390/390 (100%)
1 agaaaaatataggtgatggccagcaagccggccggttctactgaagcgtgtgacagagcc 60
61 ccatacgctcgaggaccggacgcgacgccgccgctgcctttcgggcccgtcccccgggga 120
121 ggggggacggcggcccaacacaccagccgggctggagggttagcaatgacgctcggacag 180
181 gcatgccccccggaatgccagggggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcacgga 240
241 attctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaaccaa 300
301 gagatccgttgttgaaagttttaattgattgattgtatactcagacggcaaccttccagg 360
361 cagcgttccaggggtcttcggcgggcgcgggcccgggggcgtgaaccccccggcggccgg 420
421 ggcgtgaaccacggcgggcccgccgaagcaacaggtgtcaggacaacacggatgggaggt 480
481 tgggccccgagggaccctcactcggtaatgatccttcc 518
LOMY 806
88
Genre Penicilium
ZNM 75
Penicillium expansum souche VIC AY425984 547/547 (100%)
Penicillium crustosum souche FRR AY373907 547/547 (100%)
Penicillium commune isolat wb193 AF455527 547/547 (100%) Ab.G
Penicillium commune isolat wb555 AF455418 547/547 (100%)
Penicillium griseoroseum souche VIC AY425983 546/546 (100%)
Identification morphologique Penicillium viridicatum
Penicillium expansum est un anamorphe d’Eupenicillium expansum.

Synonymes: Penicillium crustosum et Penicillium glaucum.
Cette espèce est souvent responsable de la pourriture des pommes et poires en stockage. Il est
isolé de tissus de divers végétaux, de textiles, de papier, de produits laitiers et carnés, etc. Il
produit des mycotoxines: la patuline, et la clavacine détectée dans les pommes altérées.
Penicillium commune est un anamorphe d’Eupenicillium commune.
Synonymes: Penicillium verrucosum var. Album.
Penicillium crustosum est anamorphe d’Eupenicillium crustosum.
Synonyme: Penicillium solitum var. Crustosum.
Penicillium griseoroseum est un anamorphe de Eupenicillium griseoroseum.
Synonymes: Penicillium concentricum et Penicillium cyaneofulvum.
1 GGCCGTAGACAACAGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTT 60
61 GATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGAC 120
121 GGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAGATCGGGGGACGGGGCCC 180
181 AACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATA 240
241 CCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTA 300
301 CGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAG 360
361 TTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCT 420
421 TCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCG 480
481 AAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTA 540
541 ATGATCCTTCCGCAGGTTCACCCT
565
ZNM 75
Les champignons N°: ZNM 6 et ZNM 36 sont similaires, du point de vue

89
ZNM 60
Identification morphologique Penicillium verrucosum
1 CAGCGGGTAATCCCACCTGACTTCAGATCATAGTCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAA 60
61 NTTNGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACG 120
121 CTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAGATCGGGGG 180
181 ACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCC 240
241 CCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAA 300
301 TTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGT 360
361 TGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCG 420
421 AGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCG 480
481 GGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCT 540
541 CACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 571
ZNM 60
Tableau 37: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 89
ZNM 89
90
1 CCTTTAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTT 60
121 CGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAGATCGGGGGACGGGGCCC 180
541 ATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 561
ZNM 89
ZNM 92
Identification morphologique Penicillium verrucosum
1 CCTTTAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTT 60
601 ATGATCCTTCCGCAGGTTCACTAT 624
ZNM 92
91
LOMY 781
Penicillium citrinum souche FRR 1841 AY373904 508/515 (98%)
Penicillium citrinum souche NRRL
AF484404 492/499 (98%)
31486
AF484402 492/499 (98%)
31478
AF484401 492/499 (98%)
31475 Ab.G
AF484400 492/499 (98%)
31468
Penicillium citrinum souche NRRL 800 AF033423 492/499 (98%)
AF484403 491/499 (98%)
31481
Penicillium sartoryi souche NRRL 783 AF033421 490/499 (98%)
Penicillium citrinum est synonyme de Penicillium aurifluum et Penicillium sartoryi.
Penicillium citrinum est l'une des forme de vie eucaryotique les plus commune sur terre, il est
présent abondamment dans la terre, les végétaux pourris, les aliments, les textiles et autres
matériaux biodégradable. Il élabore une toxine importante, la citrinine, à l’origine de
néphrotoxicoses. Certaines souches produisent des aflatoxines.
1 ATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGAGATAATTAAAGGTTGGGGGTCGGCTGGCGCCG 60
61 GCCGGGCCTACTAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCG 120
121 CCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGCNNNNNNNACGGGGCCCAACACACAAGCCGGG 180
181 CTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAGAGGGCGCAATG 240
241 TGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCG 300
301 CTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTAATTTC 360
361 GTTATAGGTCTCAGACTGCAACTTCAGACAGCGTTCAGGGGGGCCGTCGGCGGGCGCGGG 420
421 GCCCGCCGAGGCAACATAGGTTCGGGCAACACGGGTGGGAGGTTGGGCCCCGAGGGGCCC 480
481 GCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC 515
LOMY 781
92
LOMY 815
Penicillium crustosum souche souche FRR AY373907
520/520 (100%) Ab.G
1669
1 ataaaaatttgggttgatcggcaagcgccggccgggcctacagagcgggtgacaaagccc 60
61 catacgctcgaggaccggacgcggtgccgccgctgcctttcgggcccgtcccccggagat 120
121 cgggggacggggcccaacacacaagccgggcttgagggcagcaatgacgctcggacaggc 180
181 atgccccccggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgattcactgaat 240
241 ttgcaattcacattacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaaccaagag 300
301 atccgttgttgaaagttttaaataatttatattttcactcagacttcaatcttcagacag 360
361 agttcgagggtgtcttcggcgggcgcgggcccgggggcgtaagccccccggcggccagtt 420
421 aaggcgggcccgccgaagcaacaaggtaaaataaacacgggtgggaggttggacccagag 480
481 ggccctcactcggtaatgatccttccgcaggttcacctac 520
LOMY 815
Les champignons N°: LOMY 839; 847; 814; 816; 817; 852; 804 sont similaires, du point
de vue morphologique, à LOMY 815.
93
LOMY 841
Identification moléculaire N°d’accession Probabilité Gap
Penicillium crustosum souche FRR
AY373907 528/528 (100%)
1669
1 tcaacctggataaaaatttgggttgatcggcaagcgccggccgggcctacagagcgggtg 60
61 acaaagccccatacgctcgaggaccggacgcggtgccgccgctgcctttcgggcccgtcc 120
121 cccggagatcgggggacggggcccaacacacaagccgggcttgagggcagcaatgacgct 180
181 cggacaggcatgccccccggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgat 240
241 tcactgaatttgcaattcacattacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccgg 300
301 aaccaagagatccgttgttgaaagttttaaataatttatattttcactcagacttcaatc 360
361 ttcagacagagttcgagggtgtcttcggcgggcgcgggcccgggggcgtaagccccccgg 420
421 cggccagttaaggcgggcccgccgaagcaacaaggtaaaataaacacgggtgggaggttg 480
481 gacccagagggccctcactcggtaatgatccttccgcaggttcaccta 528
LOMY 841
LOMY 846
AY373907 547/547 (100%)
1669
Ab.G
94
1 tatccctacctgatccgaggtcaacctggataaaaatttgggttgatcggcaagcgccgg 60
61 ccgggcctacagagcgggtgacaaagccccatacgctcgaggaccggacgcggtgccgcc 120
121 gctgcctttcgggcccgtcccccggagatcgggggacggggcccaacacacaagccgggc 180
181 ttgagggcagcaatgacgctcggacaggcatgccccccggaataccagggggcgcaatgt 240
241 gcgttcaaagactcgatgattcactgaatttgcaattcacattacgtatcgcatttcgct 300
301 gcgttcttcatcgatgccggaaccaagagatccgttgttgaaagttttaaataatttata 360
361 ttttcactcagacttcaatcttcagacagagttcgagggtgtcttcggcgggcgcgggcc 420
421 cgggggcgtaagccccccggcggccagttaaggcgggcccgccgaagcaacaaggtaaaa 480
481 taaacacgggtgggaggttggacccagagggccctcactcggtaatgatccttccgcagg 540
541 ttcacct 547
LOMY 846
Les champignons N°: LOMY: 851; 849 sont similaires, du point de vue
morphologique, à LOMY 846.
LOMY 848
AY373907 549/550 (99%)
1669 Ab.G
1 gggtatccctacctgatccgaggtcaacctggataaaaatttgggttgatcggcaagcgc 60
61 cggccgggcctacagagcgggtgacaaagccccatacgctcgaggaccggacgcggtgcc 120
121 gccgctgcctttcgggcccgtcccccggagatcgggggacggggcccaacacacaagccg 180
181 ggcttgagggcagcaatgacgctcggacaggcatgccccccggaataccagggggcgcaa 240
241 tgtgcgttcaaagactcgatgattcactgaatttgcaattcacattacgtatcgcatttc 300
301 gctgcgttcttcatcgatgccggaaccaagagatccgttgttgaaagttttaaataattt 360
361 atattttcactcagacttcaatcttcaaacagagttcgagggtgtcttcggcgggcgcgg 420
421 gcccgggggcgtaagccccccggcggccagttaaggcgggcccgccgaagcaacaaggta 480
481 aaataaacacgggtgggaggttggacccagagggccctcactcggtaatgatccttccgc 540
541 aggttcacct 550
LOMY 848
95
Genre Rhizomucor
Tableau 44: Identification morphologique et moléculaire de la souche KLM 166.
KLM 166
Rhizomucor pusillus AF461764 590/594 (99%) 3/594 (0%)
Rhizomucor pusillus AY211270 566/566 (100%) Ab.G
Rhizomucor pusillus AJ278365 536/537 (99%) 1/537 (0%)
Identification morphologique Rhizopus sp.
Rhizomucor pusillus.
Synonyme: Mucor pusillus.
Rhizomucor est un genre appartenant à l’ordre des Mucorales et la famille des Mucoraceaes.
Il contient 3 espèces : pusillus, miehei et variabili. La morphologie du Rhizomucor observée
sous microscope est intermédiaire entre Rhizopus et Mucor.
1 agcgggtaatcccatctaagttcagatccatagttgaaatttatttgtggttgattgacc 60
61 tttatacttgatcatctcgaagcacactggtaaaaaattagataccaatgcaagccctca 120
121 aggaaatatcaagggtcaacaacatacaaattgttcgggtagcttgaacggatgaaaatc 180
181 catcagcaccgcaaatccaaagatttatcaaaaaataaacctttaggggttaataaagat 240
241 actgaactagacgtacccaatggatgaaccaaagggtgcaaggtgcgttcgagaattcga 300
301 tgattcgcaaaggctgcagatcgcattacttttcgcaatttgctacgctcttcatcgatg 360
361 cgagaaccaagtgatccattgcttaaagttgttttgaaattttatcgtcttgaatcattt 420
421 ctgatccaaaactttcaatttgttaaacaacagtcaatcaaatatgtaaaataaaaggtc 480
481 gagagatctggagcaatccctcagaacatttcacaaaaaggagagaatcgcggctcacca 540
541 atagaggtcaccacgatttccacaactttttaatgatccttccgcaggttcacc 594
KLM 166
Figure 70: Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche KLM 166.
96
Genre Thanatephorus
LOMY 794
Thanatephorus cucumeris isolat wb348 AF455463 591/591 (100%)
Thanatephorus cucumeris isolat wb407 AF455445 591/591 (100%) Ab.G
Thanatephorus cucumeris.
Fungi; Basidiomycota; Hymenomycetes; Homobasidiomycetes; Ceratobasidiales;

Ceratobasidiaceae; Thanatephorus.
Synonymes: Hypochnus cucumeris.
1 GGGTAGTCCTACCTGATTTGAGCTCAGAGTTCAGAAATTTGTCCGAAGACGGTTAGAAGC 60
61 GCGAACACTAGAATACCCTCCACAGCAACGCAGATAATTATCACGCTGAAGCGGCTGGTA 120
121 ACGTTCGCACTAATGCATTTCAGAGGAGCCGACTACGAGAGCCGGCACGACCTCCAAGTC 180
181 CAAGCCTTCGTCAATAAAGCCGAAGGTTGAGAATTCCATGAGACTCAAACAGGCATGCTC 240
241 CTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCA 300
301 ATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCG 360
361 TTGCTGAAAGTTGTATATAAATTGCGTTATAGCAAAGTATGACATTCTAAAACTGAATCG 420
421 TTTGTAGTAAAGCATAAGCCCGACACCTACAAGTGCGCGAACGCACCCACAAGCCGGCCT 480
481 ATGAAAAGTGCACAGAAGTTGAGAGTGGATGAGACAGGCGTGCACATGCCCTTGCGAGCC 540
541 AGCAGACAACCCGTTCAAAACTCGATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC 591
LOMY 794
97
Genre Trichoderma
Tableau 46 : Identification morphologique et moléculaire de la souche LOMY 786.
LOMY 786
Hypocrea virens Ir. 11 AY154945 583/586 (99%) 1/586 (0%)
Trichoderma virens souche GL-21 AF099008 583/586 (99%) 1/586 (0%)
Trichoderma virens souche GLi 39 AF099005 583/586 (99%) 1/586 (0%)
Identification morphologique Trichoderma sp.
Hypocrea virens est la nouvelle espèce téléomorphe de Trichoderma virens. Très utilisée
dans la lutte biologique.
Position dans la classification :
Fungi ; Ascomycota ; Pezizomycotina ; Scordariomycètes ; Hypocreomycetidae ;

Hypocreales ; Hypocreacese ; Hypocrea.
1 TCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAAGTTTGGGGTGTTTAACGGCTG 60
61 TGGACGCGCCGCGCTCCCGATGCGAGTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGA 120
121 GACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGCCCCGTAAAGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCC 180
181 GGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGG 240
241 CGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCG 300
301 CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAT 360
361 TCATTTTCGAAACGCCCACGAGGGGCGCCGAGATGGCTCAGATAGTAAAAAACCCGCGAG 420
421 GGGGTATACAATAAGAGTTTTGGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCTTGGTCCGGGGCTGCGA 480
481 CGCACCCGGGGCAGAGATCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGG 540
541 GAGTTGTAAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGAGG 589
LOMY 786
98
4- Discussion
Le séquençage total des régions ITS1, ITS2, du gène ribosomal 5.8S et partiel des
gènes ribosomaux 18S et 28S nous a permis de délimiter les espèce des champignons
filamenteux isolés des Maâsras marocaines. Sur les 53 souches représentatives de la collection
de départ de 134 souches, nous sommes parvenus à amplifier l’ADN de 39 souches et
identifier 37 souches (tableau 47).
Tableau 47: Résultats d’identification moléculaire des souches regroupées par genre.
Souches Identification Identification moléculaire (% similarité)

morphologique
LOMY 807 Acremonium sp. Fusarium sporotrichioides (98 %)
Fusarium kyushuense (98 %)
ZNM 20 Aspergillus awamori Aspergillus tubingensis (98 %)
Aspergillus niger (98 %)
ZNM 9 Aspergillus awamori Aspergillus tubingensis (98 %)
ZNM 10 Aspergillus carbonarius Aspergillus tubingensis (98 %)
ZNM 85 Aspergillus carbonarius Aspergillus niger (98 %)
Aspergillus foetidus (98 %)
Aspergillus awamori (98 %)
ZNM 1 Aspergillus flavus Aspergillus oryzae (98 %)
Aspergillus flavus (98 %)
H1 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus (86 %)
LOMY 1 Aspergillus fumigatus Aspergillus oryzae (98 %)
ZNT 15 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus (95 %)
99
Tableau XLVII (suite)

morphologique
ZNT 16 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus (88 %)
LOMY 791 Aspergillus niger Aspergillus niger (98 %)
Aspergillus foetidus (98 %)
Aspergillus awamori (98 %)
ZNM 13 Aspergillus niger Aspergillus tubingensis (98 %)
LOMY 367 Aspergillus ochraceus Aspergillus ochraceus (97 %)
LOMY 803 Geotrichum sp. Galactomyces geotrichum (98 %)
Dipodascus australiensis (97 %)
LOMY 840 Geotrichum sp. Galactomyces geotrichum (98 %)
LOMY 855 Geotrichum sp. Fusarium redolens (99 %)
Fusarium oxysporum (98 %)
Fusarium annulatum (98 %)
LOMY 788 Mucor sp. Mucor racemosus (97 %)
LOMY 794 Mucor sp. Thanatephorus cucumeris (100 %)
LOMY 837 Mucor sp. Mucor fragilis (98 %)
LOMY 781 Penicillium sp. Penicillium citrinum (98 %)
LOMY 782 Penicillium sp. Paecilomyces variotii (97 %)
LOMY 806 Penicillium sp. Paecilomyces variotii (100 %)
LOMY 815 Penicillium sp. Penicillium expansum (100 %)
Penicillium commune (100 %)
Penicillium griseoroseum (100 %)
100
Tableau XLVII (suite)

morphologique
ZNM 83 Penicillium sp. Galactomyces geotrichum (98 %)
ZNM 86 Penicillium sp. Galactomyces geotrichum (98 %)
ZNM 89 Penicillium sp. Penicillium expansum (100 %)
ZNM 60 Penicillium verrucosum Penicillium expansum (100 %)
ZNM 92 Penicillium verrucosum Penicillium expansum (100 %)
ZNM 75 Penicillium viridicatum Penicillium expansum (100 %)
KLM 166 Rhizopus sp. Rhizomucor pusillus (100 %)
Lomy 786 Trichoderma sp. Trichoderma virens (99 %)
Lomy 785 Ulocladium sp. Ceratocystis adiposa (99 %)
On constate une concordance au niveau du genre entre l’identification moléculaire et

celle établie selon l’approche morphologique chez 73 % de souches. Cependant, la
congruence entre l’espèce morphologique et moléculaire laisse encore à désirer. Ceci pourrait
être expliqué, d’une part, soit par le fait que l’identification morphologique établie se limite
souvent au niveau du genre, soit par une identification erronée de l’espèce. D’autre part,
l’identification moléculaire pourrait aussi être mise en question.
101
L’analyse des séquences de certaines souches appartenant au genre Penicillium donne

un pourcentage de similarité de 100 % entre les espèces expansum, commune et
griseoroseum. Celui du genre Aspergillus est de 98 % de similarité entre l’espèce oryzae et
flavus. C’est également le cas pour les espèces de Fusarium : sporotrichioides, kyushuense,
pulverosum, redolens, oxysporum et annulatum avec un pourcentage de similarité de 98 et
97 %. Ce qui n’est guère discriminant et nous incite à mettre en question la robustesse de la
précision de l’espèce de certaines souches.
Face à cette situation, nous avons tenté de pousser davantage l’analyse des séquences
en question en faisant appel à la phylogénie pour mieux affiner notre identification
(Figure 75). Or, elle n’a pas donnée les résultats escomptés.
La difficulté que nous avons rencontrée pour la délimitation de l’espèce de certaines

souches nous a incité à faire la quête de solutions plausibles. Dans ce qui suit, nous allons
présenter également quelques facteurs vraisemblablement à l’origine de ces résultats.
Le séquençage automatique des amplifiats d’ADN est accompagné par un bruit de

fond de l’appareil séquenceur. Des perturbations sont alors engendrées au niveau de la
correspondance entre les bases nucléotidiques et les pics du chromatogramme. Lors de
l’analyse par le logiciel Chromas, nous nous retrouvons contraints à supprimer les parties de
la discordance située au début et à la fin de la séquence (Figure 73). Cette suppression peut
atteindre une cinquantaine de bases. Ce qui se traduit éventuellement par des répercussions
sur l’aptitude de la délimitation de l’espèce, puisque la taille de la séquence se trouve
fortement réduite.
Les données génétiques correspondant à certains microorganismes fongiques ne

proviennent pas forcément de souches types ayant fait l’objet d’études approfondies et
bénéficiant de l’unanimité de la communauté scientifique. De même, elles n’appartiennent pas
à des collections internationalement reconnues telles que : American Type Culture Collection
(ATCC), Collection de l’Institut Pasteur (CIP), Japan Collection of Microorganisms (JCM) ou
Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBh (DSMZ).
L’identification devient assujettie à quelques imprécisions. Ce constat révèle que la
consultation de ces banques peut conduire et a probablement conduit à des erreurs concernant
l’identification d’espèces. Les travaux de Turenne et al. (2001) ont montré que, sur soixante-
102
dix-neuf séquences d’ADNr 16S du genre Mycobacterium, seules 23 % présentaient une

similarité de 100 % avec les séquences de GENBANK. Parmi les séquences d’ADNr 16S de
mycobactéries, vingt-et-une faisaient référence à des noms d’espèces non validés.
C’est vrai que la mise en commun de données est un atout formidable des banques
dites généralistes comme GENBANK, mais la libre soumission des séquences et de leurs
caractéristiques par les auteurs conduit à des imprécisions, des omissions, voire même des
erreurs tant au niveau des séquences que des annotations.
Figure 73: Interface du logiciel Chromas montrant. La partie de la séquence à supprimer(à droite).
L’amplification de la région ITS pourrait bien évidemment être entreprise par des
amorces autres que ITS1 et ITS4. Larena et al., (1999), ont noté que l’utilisation des paires
d’amorces ITS5-ITS4A et ITS1F-ITS4A pour l’amplification de la région ITS a conduit à une
meilleure discrimination au sein des Ascomycètes (figure 74).
Figure 74: Représentation schématique de la région ADNr avec les positions des nouvelles amorces
ITS1F et ITS4A.
103
Figure 75: Arbre phylogénique réalisé avec l’algorithme du voisin le plus proche (Neighbor Joining) et
basé sur l’analyse de la séquence de la région ITS de la souche LOMY 807 et les séquences de
ses voisins les plus proche provenant de GENBANK. Les chiffres indiquent la valeur de
boostrap de chaque nœud.
104
L’approche commune utilisant la méthode de PCR pour la détection moléculaire des

champignons filamenteux s’effectue en amplifiant les gènes d’ARNr (Kappe et al., 1996;
Vanittanakom et al., 2002; Zhou et al., 2000), qui sont hautement conservés et présents en
multiples copies dans le génome fongique. Les résultats insatisfaisants du séquençage des
gènes de l’ARNr 18S et 28S de Penicillium expansum, ont mené Marek et al., (2003) à
sélectionner une paire d’amorces (PEF) sens et (PER) antisens basées sur le gène
polygalacturonase (Pepg1) codant pour l’enzyme responsable de la pourriture des fruitS (Yao
et al., 1996; Yao et al., 1998). L’amplification d’une région conservée à l’intérieur de ce gène
a montré la spécificité de ces amorces (figure 76).
Figure 76: Amplification de l’ADN de quelques espèces de Penicillium et d’E. coli révélée sur gel
d’agarose
Les couloirs du gel sont définis comme suit : piste 1 : marqueur de poids moléculaire 1
kb-plus ladder ; 2 : P. expansum 132; 3 : P. expansum 46; 4 : P. expansum M-8; 5 : P.
expansum C-1; 6 : P. expansum FRR 1600; 7 : P. expansum NRRL 2304; 8 : P. expansum
1745; 9 : P. expansum 1801; 10 : P. expansum 1835; 11 : P. expansum 2220; 12 : P.
expansum 2350; piste 13, Penicillium roqueforti; 14 : Penicillium solitum; 15 : Penicillium
eschinulatum; 16 : Penicillium crustosum; 17 : Penicillium commune; 18 : Penicillium
notatum; 19 : Penicillium chrysogenum; 20 : E. coli.
A l’instar de ces résultats, nous croyons fort que la recherche d’amorces spécifiques à
un gène particulier pourrait être la solution pour la discrimination de l’espèce des souches
difficilement identifiables par les amorces universelles.
105
CONCLUSION
Conclusion générale
Dans le cadre du stage du mémoire de fin d’études, il nous a été confié d’identifier des
souches de champignons filamenteux isolées des olives, de grignons d’olive et des margines,
lors des compagnes oléicoles 2003-2004 et 2004-2005 en utilisant les techniques de la
biologie moléculaire. Ces souches ont été identifiées auparavant suivant l’approche
morphologique par l’équipe de recherche de l’IAV Hassan II, Rabat, Maroc et l’IRD,
Marseille, France. Et ce dans le cadre du PRAD (04/15) sur la biodiversité des moisissures
dans les unités traditionnelles de trituration des olives ‘Maâsras’ au Maroc.
D’une manière très générale, l’identification moléculaire des genres fongiques

concorde avec celle établie morphologiquement lors des travaux précédents. Quant à la
congruence entre l’espèce moléculaire et morphologique, elle mérite d’être approfondie.
La technique de PCR couplée au séquençage, largement appliquée pour l’identification

des souches de champignons filamenteux, nous a permis d’identifier 37 souches appartenant
aux genres : Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Fusarium, Mucor, Rhizomucor,
Galactomyces, Ceratocystis, Dipodascus, Thanatephorus et Trichoderma.
Les résultats obtenus démontrent l’intérêt de cette approche dans le domaine agro-
industriel tant en terme de délai et de qualité que de simplicité d’identification. Des retombées
sont notamment attendues dans le domaine des biotechnologies (production d'enzymes,
d'acides organiques et d'antibiotiques). Le consommateur est de plus en plus exigeant sur la
qualité des aliments qu'il consomme. L'ouverture des marchés impose aux entreprises des
exigences sévères en matière d'hygiène des aliments. Afin de répondre à cette problématique,
les cadres de ce secteur doivent disposer de méthodes rapides, en l’occurrence les outils de
biologie moléculaire, leur permettant d'évaluer la qualité et la sécurité de leurs produits. Le
secteur de l'alimentation, en particulier celui de l’huile d’olive doit plus que jamais apporter la
preuve de la qualité et de la sécurité de ses produits.
Dans ce cadre d’application, les banques de séquences sont un élément clef et
incontournable de l’identification. Or, quelques résultats obtenus à partir de la banque de
données GenBank de NCBI présentent certaines confusions. Ceci est dû, d’une part, à la
double classification que connaît la systématique fongique. Ainsi, Trichoderma virens est
106
CONCLUSION
appelée également Hypocrea virens quand il s’agit de la forme téléomorphe. D’autre part, les
noms des genres et des espèces listés après la soumission des séquences au logiciel Blast ont
souvent des noms obsolètes et/ou plusieurs synonymes tel est le cas de Penicillium expansum
et Penicillium crustosum.
Ces bases de données contiennent outre les données génétiques de souches types, les
séquences de souches dont les travaux aboutissant à leur réalisation ne sont pas publiés et/ou
faisant référence à des noms d’espèces non validés.
Au terme de notre travail et au vu de nos résultats nous suggérons ce qui suit :
Afin d’éviter la suppression d’un grand nombre de nucléotides et de comparer ainsi la

séquence en sa quasi-totalité, il est préférable que le séquençage soit effectué dans les deux
sens.
L’approche de type multilocus est, à notre sens, recommandable. L’utilisation
combinée des séquences de plusieurs gènes permet d’augmenter la capacité de discrimination
des espèces.
En amont de ces techniques moléculaires combinant amplification et séquençage, le

développement d’outils bio-informatiques adaptés est primordiale. D’où la nécessité de la
construction de banques de données dites « propres » comportant des séquences parfaites,
sans ambiguïté, de taille normalisée avec un système d’annotation homogène.
107
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Zaouia N., Gaime I., Lamrani K., Ismaili Alaoui M., Roussos S. (2005).
Mycoflore des Maâsras marocaines : Toxinogenèse des souches isolées et analyse des
mycotoxines dans l’huile d’olive. Mémoire de troisième cycle. Filière des Industries Agricoles
et Alimentaires. Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Rabat, Maroc.
113
Zhao J., Kong F., Li R., Wang X., Wan Z., Wang D. (2001).
Identification of Aspergillus fumigatus and related species by nested PCR targeting ribosomal
DNA internal transcribed spacer regions. J. Clin. Microbiol. 39.p. 2261-66.
Zhou G., Whong W.-Z., Ong T., Chen B. (2000).

Development of a fungal-specific PCR assay for detecting low-level fungi in an indoor
environment. Mol. Cell. Probes 14.p. 339–48.
114

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Mémoire du troisième cycle

IDENTIFICATION MOLECULAIRE PAR AMPLIFICATION ET

Présenté & soutenu publiquement par

Pr. Moussa ETTALIBI (I.A.V Hassan II- RABAT) Président

‫ﺍﻝﻐﺫﺍﺌﻴﺔ‬ ‫ﺃﺭﻭﺤﺔ ﺍﻝﺴﻠﻙ ﺍﻝﺜﺎﻝﺙ ﻝﻨﻴل ﺸﻬﺎﺩﺓ ﻤﻬﻨﺩﺱ ﺩﻭﻝﺔ ﻓﻲ ﺍﻝﺼﻨﺎﻋﺎت‬

‫أ م ا &‪ %‬ا ‪:  #$‬‬

‫‪# #! 18‬ز ‪2005‬‬

Le secteur oléicole bénéficie d’une importance cruciale sur le plan socio-économique

A partir d’une collection de 134 souches de champignons filamenteux isolées des

Les techniques utilisées, largement appliquées pour l’identification des souches de

Table des matières

Chapitre II : Champignons Filamenteux et Identification Moléculaire ...... 14

II- Identification des champignons filamenteux ................................................. 20

III- Techniques de biologie moléculaire ............................................................. 23

IV- Etude morphologique et moléculaire de quelques genres de moisissures .. 40

RESULTATS ET DISCUSSION ....................................................... 65

Conclusion générale ...................................................................................... 10665

Liste des figures

Figure 1 : Principaux pays producteurs d’huile d’olive en 2003. ............................................ 6

Figure 15 : Schéma des différentes étapes de la méthode d’AFLP.......................................... 35

Figure 20 : Caractères morphologiques des structures asexuées des Aspergillus.................... 41

Figure 24 : Structures morphologiques de l’espèce Trichoderma viride. ................................ 47

Figure 54 : Séquence nucléotidique de la région ITS de la souche LOMY 840...................... 84

Liste des tableaux

Tableau 30: Identification morphologique et moléculaire de la souche ZNM 83. .................. 85

Liste des abréviations

Pour terminer ma formation d’ingénieur en Industries Agricoles et Alimentaires au

isolées ont aussi un intérêt biotechnologique puisqu’elles se sont révélées productrices

La classification morphologique des champignons filamenteux a dominé la

- Section 1 : Revue bibliographique.

- Section 2 : Matériel et Méthodes.

- Section 3 : Résultats et discussion.

Chapitre I Secteur Oléicole

Chapitre I : Secteur Oléicole

La Picholine marocaine constitue la variété majoritairement cultivée au Maroc, soit

1- Situation oléicole mondiale

Le secteur de l'huile d'olive représente un créneau économique important pour la

1.1- Production d’huile d’olive

Figure 1: Principaux pays producteurs d’huile d’olive en 2003.

1.2- Consommation d’huile d’olives

Figure 2: Principaux pays consommateurs d’huile d’olive en 2002.

L'évolution de la production et de la consommation de l’huile d’olives depuis 1970

Le parallélisme des courbes de consommation mondiale et européenne d’huile

Figure 4: Tendance de la production nationale d’olive (DPV, 2004).

Figure 5: Tendance de la production nationale d’huile d’olive (DPV, 2004).

3- Maâsra : unité traditionnelle de trituration d’olive

Au Maroc les unités traditionnelles de trituration des olives sont appelées

Figure 6: Maâsra traditionnelle.

Les circuits de production et de transformation des olives, particulièrement auprès des

Afin de mieux appréhender les traitements post-récoltes des olives destinées à la

Le degré de maturité des olives, la méthode de récolte, les conditions de manutention

3.1- Récolte des olives

Les méthodes de récoltes des olives au Maroc sont généralement traditionnelles. La

3.2- Stockage des olives

4- Contamination fongique naturelle des olives

Les conditions particulières de récolte, de stockage et de trituration des olives auprès

(Errachidia Fés Méknés Rabat et Khémisat). Ainsi, 84 souches mésophiles appartenant à 9

Genre Nombres de souches isolées Mycoflore totale mésophile (%)

Salih (2004) a prélevé 14 échantillons d’huile d’olive des différents maâsras de la

‫ﺍﻝﻐﺫﺍﺌﻴﺔ‬ ‫ﺃﺭﻭﺤﺔ ﺍﻝﺴﻠﻙ ﺍﻝﺜﺎﻝﺙ ﻝﻨﻴل ﺸﻬﺎﺩﺓ ﻤﻬﻨﺩﺱ ﺩﻭﻝﺔ ﻓﻲ ﺍﻝﺼﻨﺎﻋﺎت‬

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