TEMA 27.

- EXPLORACIÓN DE LA
RESPUESTA MEDIADA POR
ANTICUERPOS: Reacciones de
precipitación, aglutinación y lisis.
Técnicas con reactivos marcados.
 Técnicas de diagnóstico
inmunológico

• Evidenciar la presencia de Ag o Ac
• Formación del inmunocomplejo (Ag?-Ac/Ag-Ac?)
• Visualización del inmunocomplejo
- Directamente (Ej.: Precipitación, Aglutinación)
- Utilizando marcadores que emitan alguna señal
(Fluorescencia (IF), Color (IEA), Radiactividad (RIA))
• Cualitativas, cuantitativas
 Reacciones de precipitación
Antígenos solubles Suero del Paciente

Precipitación
Fenómeno
SOPORTE deLÍQUIDO
zona
FENOMENO DE ZONA

O SEMISÓLIDO (Agar o agarosa)

Exceso de Antígenos
Exceso de Anticuerpos
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN

• Difusión espontánea
– Doble Difusión (DD)
– Inmunodifusión Radial (IDR)
– Inmunoelectroforesis
• Difusión forzada
– Contrainmunoelectroforesis (CIEF)
– Electroinmunodifusión (EID)
 Doble difusión (Ouchterlony)

Técnica cualitativa
 FENOMENO DE ZONA
Exceso de Antígenos Exceso de Anticuerpos

Reacción Negativa

PUNTO DE EQUIVALENCIA

Reacción positiva
 INMUNODIFUSIÓN RADIAL

Agar con Ag incorporado

Adición de suero patrón

(ac) y dos sueros problema (ac?)

Difusión por el gel

Formación de los anillos

de precipitación

Medida del diámetro

Técnica Suero patrón Sueros problema

Suero patrón Sueros problema
cuantitativa
 Inmunoelectroforesis

Añadir Antígeno

Electroforesis

Añadir suero
problema

Difusión del
antígeno y del
anticuerpo

Observación de
los arcos de
precipitación

Separación de fracciones antigénicas en función carga/masa

 CONTRAINMUNOELECTROFORESIS
CONTRAINMUNOELECTROFORESIS

Es
Esuna unadoble
dobledifusión
difusiónforzada
forzadapor
poraplicación
aplicacióndedecampo
campoeléctrico.
eléctrico.
Se
Se trabaja a un pH al que los anticuerpos tengan carga +,de
trabaja a un pH al que los anticuerpos tengan carga +, demodo
modoque
quedifunden
difundenhacia
hacia
elelcátodo, y los antígenos, carga -, para que se desplacen al ánodo
cátodo, y los antígenos, carga -, para que se desplacen al ánodo
 ELECTROINMUNODIFUSIÓN
ELECTROINMUNODIFUSIÓN

IDR forzada por

aplicación de
campo
Técnica eléctrico
cuantitativa
 REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

Suero ?

Antígenos insolubles

Y
Y
YY Y

Y Y
YY
Y
TIPOS DE REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

Aglutinación directa: Los antígenos son insolubles per se

Aglutinación indirecta: Los antígenos son solubles y se
hacen insolubles por adsorción a:
Soporte inerte
Látex
Carbón activo
Células
Hematíes (Hemaglutinación)
 Aglutinación de látex

Ag adsorbido Anticuerpos
a bolitas de látex
 Hemaglutinación

+ -
 Inhibición de la hemaglutinación
(Detección de anticuerpos)
Patógeno
Patógenoque
queaglutina
aglutinahematíes
hematíes

Suero
Suero??

Aglutinación
Aglutinación
 REACCIONES DE LISIS

BASADAS EN LA CAPACIDAD LÍTICA DEL COMPLEMENTO

• Capacidad hemolítica 50

• Dye test o test de Sabin Feldman

CAM
LISIS CELULAR
 CAPACIDAD HEMOLÍTICA 50
1. Sensibilizar eritrocitos carnero Cantidad suero que produce
Y

Y
Y el 50% de hemólisis
+
Eritrocito Hemolisina Eritrocito sensibilizado

2. Añadir diluciones suero problema

C CC C C C Agua destilada
Y
Y

Y Y Y
Y

Y
Suero 1/10 Suero 1/50 Control
Suero 1/100
100% hemólisis

Lectura
 Dye-Test (Test de Sabin Feldman)
(Detección de anticuerpos anti-Toxoplasma)
Y Y
+ Suero positivo
inactivado

+ Suero negativo Toxoplasma

inactivado
Y Y Y
Y C Y
C
+ + Complemento (C)
C
Ac anti-Toxoplasma

- + Complemento (C)

Y Y C C
Y C
C C Y C Y Y
+ Membrana
Azul de alterada
metileno
-
Membrana
intacta
• Parásitos vivos coloreados
• Parásitos muertos no teñidos
 REACCIONES QUE EMPLEAN
MARCADORES

• INMUNOFLUORESCENCIA
– FLUOROCROMO
• INMUNOENZIMÁTICAS
– ENZIMA + CROMÓGENO
• RADIOINMUNOANÁLISIS
– ISÓTOPO RADIACTIVO
DIRECTA: Detección de antígenos (ac marcados)
INDIRECTA: Detección de anticuerpos (anti-ac marcados)
 INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

Fluorocromo

Conjugado
(Ac)

Ag particulado (problema)
 IFI

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Fluorocromo
Conjugado
(anti-Ac)

Ac problema

Ag particulado
ENZIMOINMUNOENSAYO
1- EN PLACA DE MICROTITULACIÓN
Enzima
Sustrato Producto coloreado soluble

ELISA
Determinación de antígeno
- Sandwich
Determinación de anticuerpos

- Indirecto
- Captura
2- EN MEMBRANAS
Sustrato EnzimaDE NITROCELULOSA
Producto coloreado insoluble

DOT-ELISA)
 ?

ELISA SANDWICH PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS

 Ac ?

ELISA INDIRECTO PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

 ELISA INDIRECTO (Detección de ac)
Ac ?

Conjugado
(anti-ac ?)

1. Tapizado
2. Postapizado (bloqueo)
3. Adición suero ?
4. Adición conjugado
5. Adición sustrato
ELISA CAPTURA PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

Y Y Anti-Ig humana

Y Ig humana ?

Y
(suero problema)

Y Y Ac marcado

Antígeno
Western blot (Inmunotransferencia ó Inmunoblot)
(Detección de Ag)

Marcadores
PM Muestra

Revelado

Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE)
Transferencia a Detección del Ag con
nitrocelulosa Ac específico marcado
(conjugado)
Western blot (Inmunotransferencia ó Inmunoblot)
(Detección de Ac)

Revelado

Electroforesis del Ag
(PAGE)

Transferencia a Adición suero Adición conjugado

nitrocelulosa problema (Ac) (anti-Ac)
 INMUNOCROMATOGRAFÍA
Detección de anticuerpos
Ag K39
?? Complejo
Oro-coloidal-proteína A

+
Suero ?
Leishmania

+ -
IgG especifica IgG no especifica

Ag K39

Ac antiproteina A

LÍNEA CONTROL
 Enzimoinmunoensayo por cromatografía
(Detección de anticuerpos)
Complejo
Oro-coloidal-proteína A

Las tiras llevan fijado:

Antígeno recombinante K39 (banda diagnóstica)
Ac anti-ProtA (banda control) +
Suero ?
Técnica:
1.- Incubar los sueros problemas con el
complejo oro-coloidal-Prot A.
2.- Las IgG en la muestra se fijan al complejo
oro-coloidal- Prot.A.
3.- Las IgG especificas anti K39 serán captados
por el antígeno recombinante K39 situado en la
banda diagnóstica. Como esos Ac están unidos
a ProtA-oro coloidal, aparecerá la banda
coloreada (banda diagnóstica).
4.- Las IgG no fijadas al K39, pero unidos a la
Prot A, continúan su migración hasta la banda
control, donde ésta es captada por los
anticuerpos anti-prot A, dando una banda
coloreada (banda control).

Así en los casos positivos se colorearan ambas

bandas y en los negativos solo la banda control.
 Enzimoinmunoensayo por cromatografía
(Detección de anticuerpos)
Complejo
Oro-coloidal-proteína A

Las tiras llevan fijado:

Antígeno recombinante K39 (banda diagnóstica) +
Ac anti-ProtA (banda control) Suero ?

Técnica:
1.- Incubar los sueros problemas con el
complejo oro-coloidal-Prot A.
2.- Las IgG en la muestra se fijan al complejo
oro-coloidal- Prot.A. IgG especifica
3.- Las IgG especificas anti K39 serán captados
IgG no especifica
por el antígeno recombinante K39 situado en la
banda diagnóstica. Como esos Ac están unidos
a ProtA-oro coloidal, aparecerá la banda
coloreada (banda diagnóstica).
4.- Las IgG no fijadas al K39, pero unidos a la
Prot A, continúan su migración hasta la banda
control, donde ésta es captada por los
anticuerpos anti-prot A, dando una banda
coloreada (banda control).

Así en los casos positivos se colorearan ambas

bandas y en los negativos solo la banda control.
 Enzimoinmunoensayo por cromatografía
(Detección de anticuerpos)
Complejo
Oro-coloidal-proteína A

Las tiras llevan fijado:

Antígeno recombinante K39 (banda diagnóstica) +
Ac anti-ProtA (banda control) Suero ?

Técnica:

+ -
1.- Incubar los sueros problema con el complejo
oro-coloidal-Prot A.
2.- Las IgG en la muestra se fijan al complejo
oro-coloidal- Prot.A. IgG especifica
3.- Las IgG especificas anti K39 serán captados
IgG no especifica
por el antígeno recombinante K39 situado en la
banda diagnóstica. Como esos Ac están unidos
a ProtA-oro coloidal, aparecerá la banda
Ag K39
coloreada (banda diagnóstica).
4.- Las IgG no fijadas al K39, pero unidos a la
Prot A, continúan su migración hasta la banda
control, donde ésta es captada por los
anticuerpos anti-prot A, dando una banda
coloreada (banda control).

Así en los casos positivos se colorearan ambas

bandas y en los negativos solo la banda control.
 Enzimoinmunoensayo por cromatografía
(Detección de anticuerpos)
Complejo
Oro-coloidal-proteína A

Las tiras llevan fijado:

Antígeno recombinante K39 (banda diagnóstica) +
Ac anti-ProtA (banda control) Suero ?

Técnica:

+ -
1.- Incubar los sueros problemas con el
complejo oro-coloidal-Prot A.
2.- Las IgG en la muestra se fijan al complejo
oro-coloidal- Prot.A. IgG especifica
3.- Las IgG especificas anti K39 serán captados
IgG no especifica
por el antígeno recombinante K39 situado en la
banda diagnóstica. Como esos Ac están unidos
a ProtA-oro coloidal, aparecerá la banda
Ag K39
coloreada (banda diagnóstica).
4.- Las IgG no fijadas al K39, pero unidos a la
Prot A, continúan su migración hasta la banda
control, donde ésta es captada por los
anticuerpos anti-prot A, dando una banda
coloreada (banda control).

Así en los casos positivos se colorearan ambas Ac anti-ProtA

bandas y en los negativos solo la banda control.
 INMUNOCROMATOGRAFÍA: Detección de Ag

Control

Test

Resultado final - Resultado final +

Muestra ? (Ag) + ac marcados

(conjugado)
 RADIOINMUNOENSAYO: Detección de Ag
Ag marcado

En ausencia de antígeno frío (no radioactivo),

todos los complejos Ag-Ac serán radioactivos.
La radioactividad medida en el precipitado
es máxima

Ag ? no marcado (frío)
En presencia de antígeno ? frío (no radioactivo),
éste compite con el antígeno radioactivo
para unirse al anticuerpo. Por tanto la
radioactividad medida es menor.
El descenso es proporcional a la concentración
de Ag frío presente en la muestra
COMPARACION ENTRE DISTINTOS MÉTODOS DE
DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO

ELISA RIA IF ID IEF HAI AL IT

Especificidad* +++ +++ +++ +++ ++++ ++ ++ ++++

Sensibilidad +++ ++++ ++/+++ + + +++ ++ ++

Objetividad ++++ ++++ ++ +++ +++ ++ ++ +++

de resultados
Uso en condiciones de +++ + ++ +++ + +++ ++++ +
campo
Posibilidad de ++++ ++++ ++ ++ + + + +
automatización
Coste por análisis ++ +++ ++ + ++ ++ + +++

Capacidad de proce- ++++ ++++ ++ ++ + +++ ++++ +

sar gran número de
muestras
Rapidez en el ++++ ++++ ++++ ++++ + +++ ++++ +
diagnóstico

ELISA: “Enzyme-linked immunosorbent assay”; RIA: Radioinmunoensayo; IF: Inmunofluorescencia;

ID: Inmunodifusión radial; IEF: Inmunoelectroforesis; HAI: Hemaglutinación indirecta;
AL: Aglutinación de látex; IT: Inmunotransferencia