M Alcaloides

Rev. Soc. Qum. Mx.
2004, 48, 67-94
Revisin
Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

Vctor M. Loyola-Vargas*, Patricia Snchez-Iturbe, Blondy Canto-Canch, Luis C. Gutirrez-Pacheco, Rosa M. Galaz-valos y Oscar Moreno-Valenzuela
Unidad de Bioqumica y Biologa Molecular de Plantas, Centro de Investigacin Cientfica de Yucatn, Calle 43 No. 130, Colonia Chuburn de Hidalgo, CP 97200, Mrida, Yuc. Correo electrnico: [email protected]. Tel. (999)-9813961, fax (999)-9813900 Recibido el 4 de noviembre del 2004; aceptado el 8 de enero del 2004
Resumen. Los alcaloides son uno de los grupos de metabolitos secundarios ms diversos encontrados en los organismos vivos. Este grupo incluye alrededor de 12,000 productos, entre los cuales se encuentran los alcaloides indlicos, alcaloides derivados del triptofano que conforman alrededor de la cuarta parte de todos ellos. Los alcaloides se han reportado en varias familias vegetales, pero principalmente en las Apocinacea, Loganiaceae y Rubiaceae, todas del orden Gentianales. Entre los alcaloides ms importantes se tiene a los de tipo bisindlico como la vinblastina, utilizada en el tratamiento del mal de Hodgkin, y a la vincristina empleada en el tratamiento de la leucemia; adems de los alcaloides monoterpn-indlicos ajmalicina y serpentina utilizados como agentes antihipertensivos contra las arritmias cardiacas y el mejoramiento de la circulacin cerebral. La complejidad de los procesos genticos, catalticos y de transporte en la biosntesis de los alcaloides monoterpn indlicos, es actualmente uno de los retos intelectuales ms estimulantes en el rea de los metabolitos secundarios. Si bien se requieren ms de 50 pasos metablicos para sintetizar los alcaloides ms importantes producidos por C. roseus, hasta ahora solamente se han determinado y caracterizado, en algn grado, 20 de las enzimas requeridas. Faltan an por elucidar un importante nmero de pasos metablicos, para despus purificar las correspondientes enzimas e intentar clonar sus genes. Tambin es necesario elucidar los diversos aspectos de la regulacin de la biosntesis de los alcaloides, tanto en el nivel celular como en el molecular, pero sobre todo determinar cual es su funcin en las plantas que los producen. En esta revisin se presenta un anlisis del estado actual que guarda el conocimiento en las rutas de biosntesis de los alcaloides monoterpn-indlicos en C. roseus. Abstract. Alkaloids are one of most diverse groups of secondary metabolites found in living organisms. This group includes around 12,000 products, among them we can find indole alkaloids, which are derived from tryptophan and comprise around 25% of all alkaloids. These types of alkaloids are present in several family plants, mainly Apocinaceae, Loganiaceae and Rubiaceae, all of them from the Gentiales order. The most economically important alkaloids are the bisindolics vinblastine, used for treating Hodgkins disease, and vincristine, used for childrens leukemia. Furthermore, the monoterpene alkaloids ajmalicine and serpentine are utilized as antihypertensive agents against cardiac arrythmias and the improvement of the brains blood circulation. The complexity of the genetic, catalytic and transport processes of the monoterpene indole alkaloid biosynthesis are actually one of the more stimulating intellectual challenges in plant secondary metabolism field. More than 50 metabolic steps are required to synthetize the most important alkaloids in Catharanthus roseus. Until now about only 20 of the 50 enzymes required for their biosynthesis have been determined and characterized. Hence, there is still an important number of enzymes that need to be characterized and genes to be isolated and cloned. It is also fundamental to elucidate the regulatory aspects of their biosynthesis, both at the cellular and the molecular level, in order to address the question of their function in the plants producing them. In this review, an analysis of the state of the art related to the biosynthesis of the monoterpene indole alkaloids is presented.
Keywords: Catharanthus roseus, alkaloid, biosynthesis, secundary metabolism.
Palabras clave: Catharanthus roseus, alcaloide, biosntesis, metabolitos secundarios.
Introduccin
Los alcaloides son uno de los grupos ms diversos de metabolitos secundarios encontrados en los organismos vivos. Si bien los alcaloides han sido aislados tradicionalmente de las plantas, de las cuales alrededor del 20% los contienen [1], actualmente se ha reportado la presencia de un nmero creciente de este tipo de metabolitos en animales, insectos, invertebrados marinos y microorganismos [2]. Una gran cantidad de alcaloides han sido empleados en la medicina, y muchos de ellos an son prominentes frmacos hoy en da [3]. En el grupo de sustancias qumicas conocidas como alcaloides, alrededor de unas 12,000 [1], se agrupan a una gran variedad de constituyentes qumicos, por lo que estos metabolitos se han estructurado de acuerdo con su origen biogentico.
Con base en esta clasificacin se tienen cuatro grupos: 1) alcaloides derivados de aminocidos tales como ornitina/arginina, lisina, histidina, fenilalanina/tirosina, triptofano, y del cido antranlico y el cido nicotnico; 2) alcaloides purnicos; 3) terpenos aminados y 4) alcaloides polictidos. Entre los alcaloides derivados del triptofano se encuentran los alcaloides indlicos, mismos que pueden ser reagrupados en monoterpernos o indol terpenos (iridoides). Dentro del grupo de alcaloides indlicos existen numerosos subgrupos, los cuales dependen del modo de ciclizacin despus de la remocin del residuo de glucosa de la estrictosidina (Figura 1). En este caso se pueden reconocer 8 subgrupos: corinante, aspidosperma, iboga, estricnano, plumerano, eburnano, valesiacontamano y aparicino [4].
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Vctor M. Loyola-Vargas, et al.
Fig. 1. Alcaloides indlicos sintetizados a partir de la estrictosidina [4, 5].
Alcaloides monoterpn indlicos

Los alcaloides monoterpn-indlicos (AMIs) conforman una familia de ms de 3,000 miembros, de los cuales slo en algunos casos se conoce su efecto fisiolgico en los mamferos [6; 7]. Este tipo de alcaloides se han encontrado en varias familias vegetales, pero principalmente en las Apocinacea, Loganiaceae, Nissaceae y Rubiaceae, todas del orden Gentianales. Entre las plantas ms conocidas y estudiadas que producen AMIs se tienen a Catharanthus roseus, Tabernaemontana divaricata y Rauvolfia serpentina [8,9]. Catharanthus roseus Catharanthus roseus (L.) G. Don, es una planta perenne de la familia de las Apocinaceas de distribucin pantropical originaria de Madagascar, que ha sido cultivada con fines ornamentales gracias a que durante la mayor parte del ao presenta flores de color rosa o blanco [10]. Esta planta ha sido usada en la medicina tradicional como agente hipoglucmico [11]; el inters por esta planta se debe a que sigue siendo una fuente importante de agentes quimioteraputicos con actividad anticancergena [3,10] y a que produce una gran variedad de AMIs [10,12], la mayora de los cuales poseen actividad farmacolgica. Entre los alcaloides ms importantes producidos por C. roseus estn los del tipo bisindlico que incluyen a la vinblastina, utilizada en el tratamiento del mal de Hodgkin [3], y a la vincristina empleada en el tratamiento de la leucemia [3]; esta planta tambin produce los agentes antihipertensivos ajmalicina y serpentina [13] utilizados contra las arrit-
mias cardiacas y el mejoramiento de la circulacin cerebral [3; 14]. Actualmente el costo de la vinblastina en el mercado es de aproximadamente un milln de dlares por kilogramo; tenindose una produccin anual de 12 Kg. Por otra parte, la vincristina alcanza un costo de 3.5 millones de dlares por kilogramo y su produccin anual es de 1 kilogramo. El alto costo de estos alcaloides se debe a que encuentran en concentraciones muy bajas en la planta (alrededor de 0.0005% PS) y su extraccin se lleva a cabo en presencia de otros 200 alcaloides con propiedades qumicas y fsicas similares [15,16]. Esta problemtica plante la necesidad de encontrar fuentes alternas para la obtencin de alcaloides bisindlicos. Al principio de la dcada de los ochentas se pensaba que el cultivo de tejidos vegetales podra ser la alternativa; sin embargo, hasta ahora, y despus de un gran esfuerzo de investigacin, los alcaloides de importancia farmacolgica de C. roseus slo han sido obtenidos en concentraciones muy bajas [12,14,17, 18]. Entre las principales causas de la falta de xito para la obtencin de alcaloides y otros productos de importancia econmica a partir de cultivo de tejidos vegetales, se encuentra la falta de conocimiento de las vas de biosntesis y degradacin de estos productos.
Biosntesis de AMIS
La biosntesis de los AMIs producidos por C. roseus (Figura 2) es extremadamente compleja y requiere de la conjuncin de dos vas metablicas: la va indlica y la va terpnica [19,20].
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Fig. 2. Estructura de los AMIs: ajmalicina (A), catarantina (B), vindolina (C) alcaloides monoterpn-indlicos y de los alcaloides bisindlicos vincristina (D, VCR) y vinblastina (D, VLB).
La enzima L-aminocido-aromtico carboxi-liasa (EC 4.1.1.28)1 (nc = triptofano descarboxilasa) cataliza la conversin de L-triptofano a L-triptamina, el derivado indlico de los AMIs y de esta manera deriva triptofano hacia el metabolismo secundario. La triptamina y la secologanina, el precursor monoterpn-glucoiridoide, son condensados para formar estrictosidina, un glucoalcaloide precursor de todos los alcaloides aislados de C. roseus. La enzima que cataliza la condensacin de la triptamina y de la secologanina es la 3-(S)estrictosidina triptamina-liasa (EC 4.3.3.2) (nc = estrictosidina sintasa). Los precursores inmediatos de los AMIs, triptamina y secologanina, requieren a su de vez precursores provenientes del metabolismo primario. En las plantas, al igual que en los animales y los microorganismos, los precursores de los aminocidos aromticos fenilalanina, tirosina y triptofano provienen de la va metablica del cido shikmico [21,22].
Biosntesis de secologanina
La va del mevalonato que da lugar a la biosntesis de la secologanina, es una ruta mucho ms compleja y ramificada que la va del cido shikmico. Las plantas poseen dos rutas independientes de biosntesis del isopentenil pirofosfato para la formacin de isoprenoides que funcionan en compartimientos celulares diferentes: 1) la ruta clsica del acetato/mevalonato
1 La primera vez que se nombra una enzima se da el nombre sistemtico y el
nmero asignado por la Comisin de Enzimas (EC) de la IUBMB (www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/) y entre parntesis se da el nombre comn; a partir de la segunda vez que se nombra la enzima, y en los pies de las figuras se utiliza el nombre comn.
para la biosntesis de terpenoides en el citoplasma, y 2) la ruta de la 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato en los plstidos (Figura 3) [23,24]. La ruta metablica del mevalonato est basada en las investigaciones realizadas sobre la biosntesis de los esteroles, principalmente en mamferos y levaduras [34]. En las plantas estos mecanismos son similares, sin embargo, la cantidad de productos finales que sintetizan los vegetales a partir de esta molcula, es mucho mayor. La va del mevalonato se inicia con la conjugacin de dos molculas de acetil-CoA por la acetil-CoA:acetil-CoA C-acetiltransferasa (EC 2.3.1.9) (nc = acetil-CoA C-acetiltransferasa) (Reaccin 1, figura 3). En el siguiente paso la acetiloCoA:acetoacetil-CoA C-acetiltransferasa (EC 2.3.3.10) (nc = hidroximetilglutaril-CoA sintasa) une al acetoacetil-CoA con otra molcula de acetil-CoA para formar la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (Reaccin 2, figura 3), la cual es reducida a (R)mevalonato por la enzima (R)-mevalonato:NADP oxidorreductasa-CoA (CoA-acetilante) (EC 1.1.1.34) (nc = hidroximetilglutaril-CoA reductasa, HMGR) (Reaccin 3, figura 3). El (R)-mevalonato es fosforilado dos veces, primero por la ATP:(R)-mevalonato-5-fosfotransferasa (EC 2.7.1.36) (nc = mevalonato cinasa) (Reaccin 4, figura 3) y luego por la ATP:(R)-5-fosfomevalonato fosfotransferasa (EC 2.7.4.2) (nc = fosfomevalonato cinasa) (Reaccin 5, figura 3) para obtener (R)-5-difosfomevalonato. Por ltimo, el (R)-5-difosfomevalonato es descarboxilado por la ATP:(R)-5-difosfomevalonato carboxiliasa (deshidratante) (EC 4.1.1.33) (nc = difosfomevalonato descarboxilasa) a isopentenil pirofosfato (IPP) (Reaccin 6, figura 3). El IPP es convertido a su ismero reactivo el dimetilalil difosfato (DMAPP) por la isopentenil-difosfato 3-2 isomerasa (EC 5.3.3.2) (nc = isopentenil-difosfato -isomerasa)
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Fig. 3. Ruta para la biosntesis del isopentenil pirofosfato (IPP). Los nmeros dentro del crculo indican las enzimas: acetil-CoA C-acetiltransferasa (1); 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA sintasa (2); 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa (3); mevalonato cinasa (4); 5-fosfomevalonato cinasa (5); difosfomevalonato descarboxilasa (6); 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (7); 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (8); 2-Cmetil-D-eritriol 4-fosfato citidiltransferasa (9); 4-(citidina 5-difosfo)-2-C-metil-D-eritriol cinasa (10); 2-C-metil-D-eritriol 2,4-ciclodifosfato sintasa (11); 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-il difosfato sintasa (12); 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa (13), isopentenil difosfato isomerasa (14) [23-33].
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(Reaccin 14, figura 3; reaccin 1, figura 4). La condensacin del DMAPP con una molcula de IPP es llevada a cabo por la dimetilalil-difosfato:isopentenil-difosfato dimetilaliltranstransferasa (EC 2.5.1.1) (nc = dimetilaliltrans transferasa) (Reaccin 2, figura 4) y genera el geranil-difosfato (GPP), inicindose de esta forma la biosntesis de los monoterpenos; posteriormente la geranil-difosfato:isopentenil-difosfato geraniltranstransferasa (EC 2.5.1.10) (nc = geraniltranstransferasa) cataliza la unin del GPP con una molcula de IPP y producir trans, trans-farnesil difosfato (Reaccin 3, figura 4) y dirigirse a la biosntesis de los sesquiterpenos, triterpenos, diterpenos, etc. [35] (Figura 4). A diferencia de los animales, en las plantas algunas de las enzimas descritas para esta parte de la ruta se encuentran formando complejos multienzimticos; en rbano (Raphanus sativus) [36] y en C. roseus [37] se ha detectado la existencia de una enzima membranal que presenta la actividad de acetoacetil-CoA C-acetiltransferasa y de hidroximetilglutaril-CoA sintasa juntas. Hasta principios de la dcada de los noventas se crea que todos los isoprenoides eran biosintetizados a partir de mevalonato [38-41] y que la enzima HMGR podra representar un paso limitante para la biosntesis de los isoprenoides vegetales, como ocurre para la biosntesis del colesterol en los animales [42]. Tambin se pensaba que el IPP se biosintetizaba exclusivamente en el citosol y se metabolizaba all mismo, o se transportaba a los plstidos. Sin embargo, Heintze et al. [43], observaron que los plstidos de trigo son capaces de bio-
sintetizar carotenos a partir de [14C]-acetato, lo que sugiere que en ellos tambin se lleva a cabo la biosntesis de IPP. Como se crea que la HMGR tendra que estar involucrada (y sta se localiza en el retculo endoplsmico) se propuso la existencia de una HMGR plastdica. Sin embargo, este no fue el caso, lo que se obtuvo fue una nueva ruta metablica para la sntesis del IPP plastdico [44, 45]. La ruta de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa, descubierta en Escherichia coli por Rohmer et al. [48], se inicia con la condensacin entre el piruvato y el gliceraldehdo-3-P para dar la 1-deoxi-D-xilulosa-5-P, en una reaccin dependiente de tiamina y catalizada por la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (EC 2.2.1.7) [49] (Reaccin 7, figura 3). Esta enzima fue aislada por primera vez en plantas de Mentha x piperita y tiene una masa molecular de 71 kDa [50]. En las plantas esta va alterna de biosntesis genera el IPP en los plstidos para la biosntesis de isoprenoides, [25,27,49,50]. De acuerdo con Contin et al. [51], la secologanina proviene principalmente de la va alterna de biosntesis del IPP, aunque los datos de la literatura sugieren que la va del mevalonato tambin participa en la biosntesis de este monoterpeno, si bien en menor grado. En nuestro laboratorio hemos determinado que races transformadas de C. roseus, llevando la HMGR truncada de hmster sin el dominio por el cual se une a la membrana, son capaces de modificar la biosntesis de alcaloides y de esteroles [52]. En el caso con menor actividad de la enzima soluble se obtuvo un aumento en la biosntesis de
Fig. 4. Biosntesis de isoprenoides. Los nmeros dentro del crculo indican las enzimas: isopentenil-difosfato D-isomerasa (1), dimetilaliltranstransferasa (2); geraniltranstransferasa (3); farnesiltranstransferasa (4) [30,46,47].
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ajmalicina y de catarantina al mismo tiempo que disminuy la biosntesis de campesterol. Cuando la actividad de la HMGR soluble fue mxima, no se detect catarantina y los niveles de campesterol y serpentina aumentaron [52]. La coexistencia de ambas vas tambin se ha propuesto para la biosntesis de otros terpenos como el -caroteno, el fitol y la lutena en C. roseus [26] y para los sesquiterpenos de Matricaria recutita [25]. En C. roseus slo se han determinado algunas de las enzimas que se requieren para la biosntesis de la secologanina (Figura 5); las enzimas mejor conocidas son la HMGR (Reaccin 3, figura 3), enzima que biosintetiza al mevalonato [12]; la geraniol 10-hidroxilasa (Reaccin 3, figura 5), determinada, aislada y purificada de suspensiones celulares [5355]; la enzima NADPH:citocromo P-450 reductasa, reconocida como un componente de la geraniol 10-hidroxilasa, fue purificada hasta homogeneidad por cromatografa de intercambio inico [56]; una monoterpeno-alcohol oxido-reductasa no especfica soluble que funciona en presencia de NAD(P)+ (Reaccin 4, figura 5), capaz de catalizar la oxidacin del 10hidroxigeraniol a los correspondientes aldehdos [57]. Recientemente nuestro grupo ha sido capaz de determinar en races transformadas de C. roseus y utilizando el verdadero sustrato de la monoterpn iridodial ciclasa, la enzima que cataliza la primera ciclizacin en la va de biosntesis de la secologanina (Reaccin 5, figura 5) [58]. Tambin se ha determinado a la (S)-adenosil-L-metionina-cido lognico-metiltransferasa, en semillas de C. roseus; esta enzima cataliza la formacin de loganina a partir de cido lognico o del cido secolognico y de la (S)-adenosil-L-metionina (Reaccin 6, figura 5) [59]. Recientemente se ha determinado la secologanina sintasa (Reaccin 7, figura 5), una protena de la familia de las P450 [60, 61]. No todas las enzimas han sido purificadas y nicamente la geraniol 10-hidroxilasa se ha visto que es inhibida por uno de los alcaloides producidos por C. roseus, la catarantina. En general se sabe muy poco sobre la biosntesis de la secologanina. La ruta se ha postulado a partir de experimentos llevados a cabo con trazadores in vivo administrando glucosa, mevalonato, geraniol u otros precursores intermedios marcados con 3H o 14C. Para ello se han empleado suspensiones celulares de C. roseus, Rawolfia serpentina, Gardenia jasminoides, Teucrium marum y Nepetia cataria, as como plantas de diversas especies del gnero Lonicera [51]. El primer producto que compromete a los esqueletos hidrocarbonados hacia la biosntesis del monoterpeno es el geraniol. Se ha propuesto que entre ste y la secologanina existen al menos 11 pasos enzimticos, de las cuales nicamente se conocen seis: la geraniol 10-hidroxilasa (Reaccin 3, figura 5), la NADP+:monoterpn oxidorreductasa (Reaccin 4, figura 5), la monoterpn (iridodial) ciclasa (Reaccin 5, figura 5), la 7deoxiloganina,NADPH:oxgeno oxidorreductasa (7-hidrolasa) (EC 1.14.13.74) (Reacciones 6 y 8, figura 5), la (S)-adenosil-L- metionina:loganato 11-O-metiltransferasa (EC 2.1.1.50) (Reacciones 7 y 10, figura 5), la loganina:oxgeno oxidorreductasa (EC 1.3.3.9) (Reacciones 9 y 11, figura 5). La mayo-
ra de estas enzimas se han caracterizado de manera superficial por lo que se sabe poco sobre ellas. Se ha propuesto que el primer paso de regulacin en la biosntesis de la secologanina se encuentra al nivel de la oxigenacin del geraniol. La reaccin es catalizada por la enzima geraniol 10-hidroxilasa (Reaccin 3, figura 5) y se ha sugerido que esta enzima es la que compromete los esqueletos carbonados a la biosntesis de la secologanina. Algunas observaciones que apoyan el hecho de que esta enzima pudiera representar un punto de control son: su actividad es inducida en condiciones en las que se produce un aumento en el contenido de alcaloides e, inversamente, la adicin de fosfatos, que provoca una disminucin en el contenido de alcaloides, inhibe su actividad [63]. Otras condiciones que provocan un aumento o una disminucin en el contenido de alcaloides tambin correlacionan con la actividad de la geraniol 10-hidroxilasa [53], por lo que su papel parece fundamental para la biosntesis de este tipo de metabolitos. Adems, esta enzima es inhibida por la catarantina (Ki=1 mM) [64], lo cual pudiera tener un significado fisiolgico al acumularse este alcaloide en el mismo organelo, e inhibirla por producto final [19]. Como se mencion con anterioridad slo se conocen algunas de las enzimas de la ruta de biosntesis de la secologanina, a continuacin se hace un anlisis de las enzimas que mejor se conocen. 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa. Mientras que en clulas animales y en levaduras participan dos enzimas en la biosntesis de la hidroximetilglutaril-CoA [la acetil-CoA Cacetiltrans transferasa (EC 2.3.1.9) (Reaccin 1, figura 3) y la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (EC 2.3.3.109 (Reaccin 2, figura 3)], en las plantas parece ser que es una sola enzima la encargada de ambas reacciones. An cuando el equilibrio de la reaccin de la tiolasa est orientado hacia la formacin de la acetil-CoA, ms que hacia la biosntesis de la acetoacetil-CoA, la razn de lo anterior reside en el mecanismo de la reaccin, pues incluye una condensacin tipo Claisen, ya que una de las dos molculas de acetil-CoA acta como un carbanin que luego se adiciona nucleoflicamente sobre la otra molcula de acetil-CoA; si bien la eliminacin del protn en el metilo del acetilo, para convertirlo en carbanin, es energticamente desfavorable, la reaccin general de biosntesis de la hidroximetilglutaril-CoA logra llevarse a cabo, de manera termodinmicamente favorable, debido a que la reaccin de condensacin aldlica, que realiza la 3-hidroxi3-metilglutaril-CoA sintasa (Reaccin 2, figura 3), se combina con la que realiza la Acetil-CoA C-acetil transferasa (Reaccin 1, figura 3) [65, 66]. La hidroximetilglutaril-CoA puede seguir tres caminos diferentes una vez que ha sido sintetizada: a) puede interactuar con la enzima hidroximetilglutaril-CoA liasa (EC 4.1.3.4), para contribuir a la formacin de cuerpos cetnicos en las mitocondrias de las clulas animales (aunque se ha detectado su presencia en plantas [65,67], an no se conoce con certeza su papel dentro de la fisiologa vegetal y permanece como un rea no explorada), b) puede servir como sustrato de la 3-
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Fig. 5. Biosntesis del monoterpeno iridoide secologanina. Los nmeros encerrados en los crculos corresponden a las enzimas: geraniol pirofosfato sintasa (1); fosfatasa (?) (2); geraniol 10-hidroxilasa (3); NADP+: monoterpn oxidorreductasa (4); monoterpn (iridodial) ciclasa (5); 7deoxiloganina, NADPH:oxgeno oxidorreductasa (7-hidrolasa) (6 y 8); S-denosil-L-metionina:loganato 11-O-metiltransferasa (7 y 10); y loganina:oxgeno oxidorreductasa (9 y 11). Al principio de la va se seala la posicin de la fosfatasa especfica para el geranil pirofosfato, propuesta por el grupo del Dr. R. Verpoorte [62], pero cuya existencia no ha podido ser demostrada hasta el momento. Las flechas punteadas indican pasos no caracterizados o probables. Varias flechas en el mismo paso indican que probablemente se trata de varios pasos metablicos. Paso inhibido por la catarantina. Diagrama basado en De Luca [20], Gershenzon y Croteau [35] y Meijer [19].
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metilglutaconil-CoA hidratasa (EC 4.2.1.18), para formar 3hidroxi-3-metilglutaconato (reaccin involucrada en el catabolismo de la leucina; la 3-metilglutaconil-CoA hidratasa ha sido purificada de hepatocitos de oveja y semipurificada de C. roseus [68]) y c) la HMGR (EC 1.1.1.34) puede convertirla en mevalonato con la ayuda del poder reductor de dos molculas de NADPH. La localizacin de la enzima se complica por el hecho de que el origen del IPP depende del tipo de tejido y del estadio de desarrollo, e.g., un estudio con cloroplastos en desarrollo de cebada, demostr que mientras que los cloroplastos de tejidos juveniles son capaces de biosintetizar isopentenil pirofosfato, aquellos pertenecientes a tejidos de hoja madura, dependen de la importacin de IPP desde el citosol [69]; por otro lado, en tricomas glandulares aislados de pimienta, la formacin de isopentenil pirofosfato en el citosol es bloqueada a nivel de la HMGR en el momento en que la acumulacin de aceite es ms rpida, por lo que la biosntesis de monoterpenos y sesquiterpenos recae exclusivamente en el isopentenil pirofosfato derivado de plstidos [70]. Se sabe que la biosntesis de isoprenoides se reparte en tres compartimientos subcelulares semiautnomos: el citosol/retculo endoplsmico para la biosntesis de sesquiterpenos y triterpenos; los plstidos para la biosntesis de monoterpenos, diterpenos y tetraterpenos (as como para las porciones prenilo de la clorofila, las plastoquinonas y los tocoferoles); y la mitocondria (y/o el aparato de Golgi) para la biosntesis de ubiquinona [66]. Para explicar los eventos anteriores se han propuesto recientemente una serie de modelos; en uno de ellos Chappell, sugiere que existen canales metablicos regulados de manera independiente dedicados a la produccin de tipos especficos de isoprenoides [41]. Mientras que en las clulas de los mamferos la HMGR es una enzima codificada por un solo gen, en las plantas esta misma enzima se presenta como mltiples isoenzimas y es codificada por una pequea familia de genes. Miembros especficos de esa familia de genes son expresados diferencialmente durante el desarrollo de la planta o en respuesta a factores ambientales y distintas isoformas de la enzima pueden ser crticas en la direccin de los intermediarios de la va hacia isoprenoides especficos [41,71,72]. La HMGR de las plantas es una enzima que est estrechamente regulada por fitocromo (de manera post-transduccional) [73], fitohormonas, mecanismos de retroalimentacin y factores protecos endgenos [74]; adems, existen evidencias de que la HMGR de plantas est regulada por fosforilacin reversible, al parecer mediante una cascada de dos ciclos. De hecho ya se han encontrado algunas cinasas que actan sobre la HMGR [75-79]. Chappell divide los mecanismos de regulacin de la biosntesis de isoprenos en finos y gruesos, y propone que el aumento en la transcripcin de la enzima est mediado por una disminucin de los oxiesteroles citoslicos que interactan con factores en trans, y que stos a su vez, se unen a los elementos reguladores de la biosntesis de los esteroles, los cuales se encuentran en el promotor del gen de la HMGR [39].
A este respecto recientemente se encontr que el promotor del gen Hmgr2 de jitomate, posee un elemento regulador positivo en el interior de la regin 5UTR y uno ms que consiste en un rizo localizado corriente arriba del codn de inicio [80]. El incremento en la eficiencia traduccional del ARNm de la HMGR resulta, en parte, del procesamiento del ARNm de manera alternada, que se da en clulas sometidas a bajas concentraciones de mevalonato. Daraselia, tambin sugiere que el extremo amino terminal, el cual se encuentra insertado en la membrana, es el responsable de la regulacin de la degradacin de la enzima [80]. La HMGR de mamferos se inactiva por una fosforilacin reversible, que parece no estar relacionada con el mecanismo de control por retroalimentacin pero si con la actividad de una cinasa dependiente de AMP [71]. Con respecto a las modificaciones post-traduccionales, en un estudio reciente se demostr que los metabolitos no esteroidales derivados del mevalonato y sintetizados entre el escualeno y el lanosterol, disminuyen la biosntesis de la HMGR en clulas de hmster tratadas con lovastatina (un inhibidor de la HMGR), con TMD (4,4,10--trimetil-trans-decal-3-ol, inhibidor de la escualeno ciclasa) y con mevalonato; y que la regulacin se da en el nivel transduccional y por lo tanto aumenta la degradacin de la enzima [81]. Se tienen evidencias de que los inhibidores de la HMGR provocan la aparicin de mecanismos regulatorios presentes de manera implcita [81]. Lopez et al. [82], han demostrado que los inhibidores son capaces de revelar mecanismos de regulacin transcripcional, controlados por el colesterol de la dieta, y mecanismos de degradacin de la enzima controlados por el farnesol. Hampton et al. [83], hacen una propuesta interesante estableciendo dos categoras para regular la actividad de la HMGR: a) inhibicin por retroalimentacin y b) regulacin cruzada. La regulacin por retroalimentacin implica que la actividad de la enzima es reducida en respuesta a los productos provenientes de la va del mevalonato. En mamferos, por ejemplo, este tipo de regulacin se logra a travs de una modulacin coordinada de la biosntesis y degradacin de la protena; el dominio amino terminal que se ancla en la membrana es tanto necesario como suficiente para mediar la degradacin regulada de la HMGR. Por otra parte, entre los mecanismos de regulacin cruzada se tiene la fosforilacin por una cinasa dependiente de AMP. Un estudio reciente sobre la regulacin por fosforilacin, en extractos de hoja de Spinacea oleracea L., demostr la capacidad de las proten-cinasas para activar y desactivar, mediante fosforilacin, tanto a la nitrato reductasa como a la HMGR1 de Arabidopsis thaliana. La proten cinasa fosforil ms rpidamente a la HMGR1, hacindolo adems en la serina 577, y apoyando la propuesta hecha por Dale et al. [77], en el sentido de que este residuo es el punto de regulacin de la fosforilacin [79]. Este hallazgo traer como consecuencia replanteamientos acerca de cmo se ven las interrelaciones entre la asimilacin del nitrato y el metabolismo de la sacarosa y de los isoprenoides. Mienras que en los mamferos las citocinas aumentan los niveles de ARNm de la HMGR; en las plantas el dao causado por patgenos dispara,
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la mayora de las veces, la induccin de algunas isoenzimas de la HMGR y la represin de otras [84]. Tambin se sabe que las isoenzimas de HMGR estn reguladas por desarrollo como sucede en jitomate, en el cual las isoenzimas son sintetizadas en tejidos especficos [85]. El mismo evento se ha observado en tubrculos de Solanum tuberosum L., en donde los miembros de la familia de la HMGR se expresan, de acuerdo al estadio de desarrollo, mediante la produccin de isoformas especficas para la biosntesis de productos finales diferentes en tejidos particulares [86]. En resumen, la regulacin de la HMGR se da a cuatro niveles: en la transcripcin, en la traduccin de su ARNm, en la modificacin covalente por fosforilacin y en la degradacin de la enzima. La HMGR ha demostrado ser una enzima difcil de purificar. Slo ha sido purificada de Hevea brasiliensis [87], S. tuberosum [88], R. sativus [89], Zea mays [90] y A. thaliana [77]; y se ha semipurificado de Parthenium argentatum [91]; N. cataria [92], y C. roseus [93,94]. Bach et al. [89], establecieron una metodologa para purificar HMGR basada en la extraccin de la enzima por medio de detergentes, utilizando membranas aisladas a partir de plntulas etioladas de R. sativus. La enzima fue caracterizada molecular y cinticamente y se determin que tiene una masa molecular de 180 kDa, con 4 subunidades de 45 kDa cada una y que se trata de una protena ligeramente cida, con un pI de 5.9. Por otro lado Kondo y Oba [88], desarrollaron una metodologa para purificar HMGR a partir de S. tuberosum, logrando solubilizar la enzima utilizando la digestin con tripsina en lugar de detergentes y obteniendo un porcentaje de recuperacin del 1.8%, con una actividad especfica de 7,910 nmoles de mevalonato formados min-1 mg de prot-1 e identificando que la enzima est constituida por dos subunidades de 55 kDa y una masa molecular total de 110 kDa. En tanto que las HMGR de aves y mamferos presentan estructuras monomricas de entre 90 y 97 kDa [95], en Pseudomonas mevalonii [96] y levaduras la enzima es tetramrica con una masa molecular de 260 a 280 kDa [97, 98]. Se han determinado diferentes valores de K m para la hidroximetilglutaril-CoA, tanto para la fraccin membranal como para la fraccin citoslica en semillas de Pisum sativum; para la primera se determin un valor de 0.385 M y de 80 M para la segunda, lo que sugiere la existencia de isoenzimas en la clula [99]. El valor de 27 M de la Km para el NADPH y de 1.5 M para la Km de la hidroximetilglutarilCoA de la HMGR en R. sativus es ligeramente menor que el determinado para la enzima de mamferos y levaduras [100]. Una afinidad elevada hacia el NADPH, como se ha visto en R. sativus, podra permitir la regulacin de la actividad de HMGR in vivo a travs de un cambio rpido en la relacin NADP+/NADPH [89]. Recientemente Dale et al. [77], lograron expresar en E. coli, en una forma catalticamente activa, el dominio cataltico de la HMGR1 de A. thaliana y lo purificaron. La alta eficiencia del sistema de expresin bacteriano, aunado a la simplicidad del protocolo de purificacin, result en la obtencin de
grandes cantidades de la enzima pura (cerca de 5 mg L-1 de cultivo), con una actividad especfica final de 17 U mg prot-1; lo anterior, expresado en pkat mg prot-1, da un valor de 2.82 108, siendo sta la actividad especfica ms elevada reportada hasta la fecha para cualquier HMGR purificada a partir de tejidos vegetales. Los valores de las Km para el NADPH y la hidroximetilglutaril-CoA fueron de 71 7 M y 8.3 1.5 M, respectivamente. En este mismo modelo se comprob que la HMGR1 de A. thaliana es inactivada por fosforilacin en la serina 577. Por otra parte, Galaz-valos detect dos picos de actividad al eluir extractos de races transformadas de C. roseus a travs de una columna de intercambio aninico. Estos componentes presentan actividades especficas de 284.61 y 210.58 pkat mg prot-1 y poseen una masa molecular cercana a los 200 kDa [93]. Geraniol 10-hidroxilasa. La geraniol 10-hidroxilasa es una monooxigenasa de la familia de las protenas P450 [101] y se encuentra localizada en las membranas de las vacuolas [102]. Esta enzima cataliza la hidroxilacin del geraniol en la posicin 10 y requiere O2 y NADPH (Reaccin 3, figura 5) [101]. Los electrones del NADPH son transferidos al grupo hemo de la monooxigenasa a travs de la NADPH: citocromo P450 reductasa [103]. Esta flavoprotena es absolutamente necesaria para que la monooxigenasa realice su catlisis y est formada por dos componentes: la citocromo P-450 reductasa NADPH dependiente y el citocromo P-450, con actividad propia de geraniol 10-hidroxilasa [104]. El primer componente es una flavoproteina membranal que ha sido purificada a homogeneidad, su masa molecular es de aproximadamente 78 kDa y tiene como cofactores al FMN y al FAD [56, 57, 102, 105]. El segundo componente es una proteina de masa molecular de 56 kDa que ha sido purificada aparentemente a homogeneidad; acepta nicamente como sustrato al geraniol y no al geraniolP o al nerol-P, lo cual podra considerarse como evidencia de que existe una desfosforilacin previa durante la ruta metablica [53]. Esta enzima tiene como inhibidor no competitivo reversible a la catarantina (Ki = 1 mM), es estimulada por DTT y es inhibida por CO, aunque esta inhibicin es revertida por la luz [57,101,105]. El ADNc de la citocromo P-450 reductasa que codifica para un pptido de 78.9 kDa, ha sido clonado empleando como sonda regiones altamente conservadas entre estas protenas [104]; sin embargo, cuando este ADNc se emple para transformar Nicotiana tabacum y A. thaliana, la protena se expres pero no se detect actividad de geraniol 10-hidroxilasa. Los anticuerpos generados contra la protena que codifica el ADNc cruzaron con la protena purificada por la Meijer [106]. Monoterpn acclica de alcoholes primarios: NADP+ oxidorreductasa. Se ha establecido que esta enzima juega un importante papel en la biosntesis de la secologanina [18], y cataliza la oxidacin reversible del 10-hidroxigeraniol en presencia de NADP+, para producir 10-oxogeraniol 10-hidroxigeranial (Reaccin 4, figura 5); al parecer sta es una enzima
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inespecfica en cuanto al grupo OH que es capaz de oxidar [107]. Se ha purificado de clulas de R. serpentina, su masa molecular es de 44 kDa y su pI es de 5.4. Es inactivada por iodoacetamida y por N-etilmaleimida, lo que sugiere que requiere de grupos SH para su actividad [108]. El valor de la Km para el NADP+ y el NADPH es de 25 y 5.5 M respectivamente, teniendo nerol (oxidacin) o neral (reduccin) como sustrato. Esta enzima no utiliza NAD+ ni NADH como cofactores y puede aceptar alcoholes allicos primarios con cadenas mayores a seis carbonos como sustratos; sin embargo, no acepta alcoholes secundarios, ni etanol [18]. Monoterpn (iridodial) ciclasa. Esta enzima cataliza la reaccin de formacin de iridodial a partir de 10-oxogeranial y utiliza NADPH como agente reductor (Reaccin 5, figura 5). Esta enzima ha sido semipurificada 440 veces de R. serpentina [107, 109] y parece ser un homotetrmero con una masa molecular de 118 kDa y un pH ptimo de 7.0. Nuestro grupo la ha semipurificado de races transformadas de C. roseus [58]. 7-deoxi:loganina, NADPH:oxgeno oxidorreductasa [7hidroxilante] (EC 1.14.13.74). Esta enzima cataliza puede utilizar como sustrato tanto al 7-deoxiloganato como a la 7deoxiloganina (Reacciones 6 y 8, figura 5). La reaccin es inhibida por mjonxido de carbono, as como por diversos inhibidores de las protenas citocromo P450, indicando que esta enzima pertenece a la familia de los citocromos P450. La Km para la 7-deoxiloganina y el NADPH es de 170 y 18 M respectivamente [110]. Loganina:oxgeno oxidorreductasa (EC 1.3.3.9). Esta enzima cataliza el ltimo paso de la biosntesis de secologanina a partir de loganina, que involucra una ruptura oxidativa del anillo del metilciclopentano de la loganina (Reaccin 11, figura 5). La enzima tambin reconoce como sustrato al cido lognico (Reaccin 7, figura 5). Es un miembro de la familia de protenas citocromo P450 y se encuentra presente en la fraccin microsomal de suspensiones celulares de C. roseus, as como en la epidermis de sus hojas [60]. Tambin ha sido determinada en suspensiones celulares de Lonicera japonica [61, 111]. S-adenosil-L-metionina:loganato 11-O-metiltransferasa (EC 2.1.1.50). Esta enzima cataliza la O-metilacin del grupo carbonilo del cido lognico. Puede catalizar la transferencia del grupo metilo de la (S)-adenosil-L-metionina indistintamente al cido lognico (Reaccin 9, figura 5) o al cido secolognico (Reaccin 10, figura 5), pero no acepta al cido 7desoxilognico como sustrato; lo anterior indica que en la va de biosntesis de la secologanina, la hidroxilacin antecede a la metilacin. Esta enzima ha sido purificada parcialmente a partir de plntulas etioladas de C. roseus; los valores de Km para la (S)-adenosil-L-metionina y para el cido lognico son de 0.06 y 12.5 mM, respectivamente [19].
Biosntesis de los AMIS

La mayora de las investigaciones realizadas para caracterizar a las enzimas de la ruta de biosntesis de los AMIs se han llevado a cabo tomando en cuenta la enorme complejidad de la ruta. Para una revisin profunda sobre el tema se puede recurrir a las excelentes revisiones que sobre el tema han realizado De Luca [1,20] y Meijer et al. [19]. La lista de las enzimas que han sido estudiadas en menor o mayor grado incluye a la triptofano decarboxilasa, la geraniol 10-hidroxilasa, la NADPHcitocromo P450 reductasa, la oxidorreductasa de NADP+dependiente, la monoterpn (iridodial) ciclasa, la secologanina sintasa, la SAM-loganato O-metiltransferasa, la 7-deoxiloganina 7-hidroxilasa, la estrictosidina sintasa, la estrictosidina--Dglucosidasa, la catenamina reductasa, la tabersonina 16-hidroxilasa, la S-adenosil-L-metionina:16-hidroxitabersonina-16-Ometiltransferasa, la S-adenosil-L-metionina:16-metoxi 2, 3dihidro-3-hidroxitabersonina-N-metiltransferasa, la desacetoxivindolina-4-hidroxilasa, la acetilCoA:4-O-desacetilvindolina-4-O-acetiltransferasa, la tabersonina 17-hidroxilasa y la minovincinina 19-O-acetiltransferasa (Tabla 1). El precursor indlico triptamina se sintetiza a partir del triptofano (Reaccin 1, figura 6), en una reaccin catalizada por la enzima L-aminocido aromtico carboxi-liasa (EC 4.1.1.28) (Nombre comn: triptofano decarboxilasa, TDC) que emplea como cofactor al piridoxal fosfato; esta reaccin tambin puede emplear como sustrato al 5-hidroxitriptofano. Los dos precursores, la secologanina y la triptamina, son condensadas para producir la estrictosidina-O-glucosa, en una reaccin catalizada por la 3- (S)-estrictosidina triptaminaliasa (EC 4.3.3.2) (Nombre comn: estrictosidina sintasa, SS) (Reaccin 2, figura 6) [112]; el producto de esta reaccin, la 3 (S) estrictosidina, es desglucosilado por la estrictosidina D-glucohidrolasa (EC 3.2.1.105) para formar finalmente la molcula de estrictosidina aglicona (Reaccin 3, figura 6), precursor de los aproximadamente 200 alcaloides indlicos de C. roseus, incluyendo a la vindolina y la catarantina [113, 114]. La estrictosidina aglicona se convierte en 4,21-didehidrogeissoschizina, en forma expontnea, la cual puede ser transformada en catenamina, precursor directo de la ajmalicina y la serpentina [115], o puede ser reducida enzimticamente a geissoschizina (Reaccin 4, figura 6). Por catalizar pasos cruciales de la biosntesis de los AMIs, las enzimas TDC y SS han sido ampliamente estudiadas [118,119]. La TDC se ha purificado tanto de clulas en suspensin [120] como de races transformadas de de C. roseus [121]. La TDC es una enzima citoplsmica formada por dos subunidades idnticas de 55 kDa, tiene una masa molecular aproximada de 110 kDa, un pI de 5.9, un pH ptimo de 8.5 y es modulada por diversos factores; se ha determinado que la actividad de la TDC aumenta en cultivos de C. roseus como respuesta a la adicin de homogenizados fngicos [122] o de enzimas hidrolticas [123]. En el primer caso, se sabe que el aumento de su actividad se debe al incremento en la trascripcin del gen y en la traduccin del mensajero.
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Fig. 6. Biosntesis de la estrictosidina, precursor universal de los alcaloides monoterpn-indlicos. Los nmeros indican la posicin en la va de las enzimas: Triptofano decarboxilasa (1); estrictosidina sintasa (2); estrictosidina glucosidasa (3); geissoschizina deshidrogenasa (4). Las flechas cortadass indican varios pasos metablicos [19; 20; 116; 117].
Por otra parte, contrario al efecto del homogenizado fngico, las auxinas provocan represin de la expresin de la TDC [124]. El valor de Km para triptofano de la TDC es de 75 M y de 13 M para el 5-hidroxitriptofano; el D-triptofano resulta ser un inhibidor no competitivo y la triptamina (producto de la reaccin) es un inhibidor competitivo [121,125]. La TDC, adems de estar regulada por factores externos (ataques fngicos, etc.) est tambin sujeta a regulacin tejido especfica y por desarrollo. En plntulas de C. roseus provenientes de semillas germinadas in vitro, bajo condiciones de oscuridad, su actividad es transitoria; comienza a detectarse a los 3 das, alcanza su mximo a los 5 das y luego declina [126]. En general en las plntulas, su actividad es mayor en las partes areas (siendo mayor en hojas jvenes que en las maduras); mientras que en la planta adulta su actividad es mayor en las races [122]. A pesar de que la TDC deriva el triptofano al metabolismo secundario, la sobre-expresin del gen de la TDC en C. roseus no conlleva a una mayor produccin de AMIs, a pesar de que ocurre un aumento en la cantidad de la protena con actividad de TDC y en la produccin de triptamina [14]. La
sobresntesis de triptamina, ya sea por medios bioqumicos o moleculares, no se ve reflejada en una mayor biosntesis de alcaloides [12,19,127]. Este resultado sugiere que la enzima TDC no es el nico punto de regulacin en la biosntesis de estos metabolitos, confirmndose lo anterior en mltiples trabajos realizados con clulas en suspensin [128-130]. Por otra parte, y como era de esperarse, la actividad de la TDC puede disminuir sin afectar el contenido total de los AMIs. MorenoValenzuela et al. [131], desdiferenciaron un cultivo de races transformadas a clulas en suspensin, y posteriormente las rediferenciaron a races. Durante este proceso la actividad de la TDC se vio dramticamente alterada. En el paso de races a clulas, la actividad de la TDC disminuy en un orden de magnitud o ms y los AMIs disminuyeron de 10 a 2 mg g-1 PS durante este proceso. En las races rediferenciadas se encontr un nivel de actividad de TDC similar a la detectada en las clulas en suspensin, en tanto que la produccin de los alcaloides se recuper hasta en un 90% respecto a la produccin inicial. Estos datos sugieren que no se requieren niveles elevados de actividad de TDC para producir a los AMIs. Este resultado ha sido recientemente comprobado empleando cultivos transgnicos que sobreexpresan la actividad de TDC [132].
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Tabla 1. Enzimas caracterizadas en la ruta de biosntesis de los AMIs en Catharanthus roseus y Rauwolfia serpentina. Modificado de Meijer et al., [19]. AH = aparente homogeneidad; P = parcial; Pur = purificacin. Los espacios vacos indican que dichos parmetros no han sido determinados. Las referencias se citan a lo largo del texto. MM 10-3 Sustratos y Km* Trp 75 M Citoplasma AH S Epidermis hojas> raz C. roseus Plntulas C. roseus Plntulas C. roseus Races transformadas C. roseus y R. serpentina Plntulas C. roseus Localizacin Pur Clonacin Tejido 56
Enzima
Abreviatura
Triptofano decarboxilasa
TDC
Geraniol 10-hidroxilasa 79 10 oxogeranial; NADPH Vacuola? P Citocromo P-450a Membrana vacuola AH S
G10OH
56; 63
Geraniol 5.5 M Membrana vacuola AH Si
NADPH: citocromo P-450 reductasa
Monoterpn iridodial ciclasa
MIC
SAM: cido lognico metil transferasa
LAMT
SAM 0.06 mM; cido lognico 12.5 mM O2, NADPH 18 M, 7-deoxiloganina 170 M Microsomas O2, NADPH, loganina Retculo endoplsmico Vacuola AH Si
7-deoxiloganina 7-hidroxilasa
DL7H
Cultivo de tejidos L. japonica y C. roseus S Hoja C. roseus y cultivo de tejidos L. japonica S Epidermis hojas, yemas florales, cultivo de tejidos C. roseus y R. serpentina
Secologanina sintasa
SS
Estrictosidina sintasa
ES
39
Triptamina 0.9 2 mM; 5.8 mM; secologanina 30 Mb; 2.6 mM Estrictosidina 0.1 0.2 mM Retculo endoplsmico
Estrictosidina -D-glucosidasa SG 63; 230; 450
AH
Si
Hoja>raz>tallo>flor Cultivo de tejidos C. roseus y R. serpentina 35x Cultivo de tejidos C. roseus
Geissoschizina deshidrogenasa
GD
Geissoschizina 83 M, NADP+ 77 nM Aldehdo de polineuridina
Polineuridina aldehdo esterasa
PNAE
AH
Si
Cultivo de tejidos R. serpentina
Catenamina sintasa Catenamina reductasa 81 15
CS CR
4, 21-geissoschizina Catenamina Catenamina imonium 62 M Catenamina + vindolina Vacuola P P
Tetrahidroalstonina sintasa
Peroxidasa
Peroxidasa O2, NADPH 14 M y tabersonina 11 M Retculo endoplsmico Retculo endoplsmico Membranas de los tilacoides Citoplasma P Si P Plntulas C. roseus P Plntulas C. roseus Hojas jvenes y cultivo de tejidos C. roseus 16-hidroxitabersonina
37
Ajmalicina
Vacuola
Tabersonina 16-hidroxilasa
T16OH
SAM 16-hidroxitabersonina O-metil-transferasa 16-metoxi-2, 3-dihidro-3hidroxi-tabersonina 45 O2, 2-oxoglutarato Desacetilvindolina AcetilCoA 6.5 M Deacetilvindolina 1.3 M Citoplasma AH Si Minovincinina Si
OMT
SAM: 16-metoxi-2, 3-dihidro-3hidroxitabersonina-N-metil-transferasa
NMT
Deacetoxivindolina 4-hidroxilasa
D4H
Idioblastos/latidferas hoja, tallo y flores C. roseus Idioblastos/latidferas hoja, tallo y flores C. roseus Clulas corticales raz C. roseus Cultivo de tejidos C. roseus
AcetilCoA: deacetilvindolina 4-O-acetil-transferasa
DAT
54 (33+22)
Minovincinina 19-O-acetiltransferasa
MAT
Anhidrovinblastina sintasa (peroxidasa) VS 31 16-epi-vellosimina 19.4 M Acetil-CoA 64 M Vomilenina y NADPH
45
Vindolina y catarantina
Vacuola
AH AH
Vinorina sintasa
Cultivo de tejidos R. serpentina 20.6 Cultivo de tejidos R. serpentina
Vomilenina reductasa
VR
43
Vinorina hidroxilasa
VH
O2, NADPH 3 M, vinorina 26 M
Microsomal
Cultivo de tejidos R. serpentina
* En el caso de que se presenten varios valores para la Km, se refiere al hecho de que stos han sido determinados por diferentes autores. a En ensayos in vitro tambin puede reducir al sustrato artificial citocromo c (K 7.8 M) con NADPH (K 5.7 M) como el donador de electrones. m m b El valor de K de 30 M es para todas las isoenzimas [140] m
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Se ha aislado y caracterizado una clona genmica de la TDC a partir del genoma de C. roseus. El gen para esta enzima se encuentra presente en una sola copia [133]. La cuantificacin de los niveles de TDC en plntulas y en suspensiones celulares muestran que tanto la expresin del gen como la actividad enzimtica son inducibles en forma transiente, sugiriendo que la actividad de la TDC est regulada en los nivel transcripcional, traduccional y postraduccional [122, 130,134,135]. La otra enzima, la SS, cataliza la condensacin estereoespecfica de la secologanina con la triptamina para producir la 3-(S)-estrictosidina. La enzima es altamente especfica para sus dos sustratos, i. e. no acepta al cido secolognico ni al triptofano como sustratos, pero muestra una ligera actividad con anlogos sustituidos en las posiciones 5, 6 o 7 de la triptamina. Hasta ahora no se tienen indicios de que esta enzima sea inhibida por alguno de los alcaloides, productos finales de esta ruta metablica [136-138]. La SS fue purificada a finales de los setentas y se caracteriz como una enzima soluble de masa molecular entre 35 y 38 kDa [138]. Diez aos ms tarde se report la identificacin de cuatro diferentes formas de SS en clulas en suspensin y hojas de C. roseus [139]. Recientemente, De Waal et al. [140], determinaron que el nmero de SSs es mayor; estos investigadores purificaron seis diferentes SSs, distinguibles por electroforesis empleando geles de alta concentracin (20% de acrilamida). En C. roseus se han detectado siete isoenzimas de la SS, cuatro de las cuales pueden ser separadas por sus actividades catalticas (diferente valor de Km) y por su pI (entre 4.3 y 4.8). Pfizer y Zenk [139], sugieren que por tratarse de una enzima glucosilada hay diferencias entre isoenzimas en la cadena hidrocarbonada. Por otra parte, se tienen evidencias de que la ocurrencia de isoformas no est relacionada con el estadio de desarrollo ni con alguna regulacin tejido-especfica, ya que se encontr que las isoformas se expresan tanto en clulas en suspensin, como en hojas, tallos y races [140]. Estos datos sugieren que las diferentes isoformas se deben a glucosilaciones de la protena original, aunque no se han caracterizado los tipos de carbohidratos presentes [140]. Hasta el momento no se conocen las funciones, en la planta, de las diferentes isoformas de SS. A diferencia de la TDC que muestra regulacin tejido especfica, la SS presenta niveles de actividad similares en los diferentes rganos de la planta [126], y su actividad no se altera cuando los cultivos in vitro de C. roseus son transferidos al medio de produccin de alcaloides (8% de sacarosa) [134]. Esta enzima tampoco parece estar regulada por el proceso de desarrollo [126], por lo que pareciera no estar sujeta a mecanismos de regulacin. Sin embargo, durante el proceso descrito por Moreno-Valenzuela et al. [131], sobre la desdiferenciacin-rediferenciacin de races transformadas de C. roseus, la actividad de la SS disminuy en un 60% cuando las races se desdiferenciaron a clulas en suspensin. La actividad de la SS slo se recuper a la mitad, en tanto que el patrn de isoformas cambi, cuando las clulas se rediferenciaron a races,
por lo que no es claro an si esta enzima es regulada por el proceso de desarrollo [131]. Existen evidencias que sugieren que la SS no constituye un paso limitante en la biosntesis de los alcaloides indlicos en plntulas de C. roseus; se ha encontrado que al transferir un cultivo de clulas en suspensin de C. roseus, de un medio de mantenimiento a uno de induccin para producir alcaloides, el aumento en la acumulacin de alcaloides no correlaciona con un incremento en la actividad de la SS; sin embargo, en callos de C. roseus transformados con el gen de la SS se observ una correlacin directa entre el aumento de la actividad enzimtica y la acumulacin de alcaloides [141,142]. Resultados similares se han obtenido en Cinchona ledgeriana [143,144] y en plntulas de C. roseus [144]. Lo anterior sugiere la posibilidad de que la SS es un punto de regulacin de esta ruta metablica; sin embargo, la informacin es poco precisa y en ocasiones contradictoria, lo cual puntualiza la necesidad de profundizar en las investigaciones que permitan establecer su papel real en la biosntesis de los AMIs. La SS es codificada por un solo gen, sugiriendo que las isoformas son el resultado de modificaciones postransduccionales de un precursor simple [145, 146]; esta enzima fue la primera del metabolismo de los AMIs en ser clonada, primero de R. serpentina [147] y luego de C. roseus [145]. El mensajero para la SS presenta una regin que codifica para un pptido seal de 31 aminocidos que la dirige a la vacuola [122], lo cual apoya diversos ensayos que sugieren que se trata de una enzima vacuolar [119,148]. Doireau et al. [149], y Stevens et al. [150], han medido la actividad de la TDC y de la SS, as como las concentraciones de triptamina en cultivos de clulas de C. roseus y de otras especies. Estos autores observaron que existe una acumulacin de triptamina a pesar de haber una elevada actividad de SS; estos resultados apoyan la hiptesis de que la limitante para la biosntesis de estrictosidina y sus mltiples derivados es el contenido del precursor terpnico secologanina. Los resultados de nuestro grupo de trabajo [131], tambin sugieren que los principales puntos de regulacin para la produccin de la estrictosidina se ubican en alguna(s) enzima(s) que participan en la biosntesis de la secologanina.
Biosntesis de los primeros AMIS

Despus de la sntesis de estrictosidina el siguiente paso en la biosntesis de los AMIs es la desglucosilacin de la estrictosidina por la estrictosidina -D-glucohidrolasa (EC 3.2.1.105) para producir estrictosidina-aglicona (Reaccin 3, figura 6), un producto inestable que despus de varios rearreglos, los cuales no se conocen con precisin, se convierte en 4,21didehidrogeissoschizina, la cual a su vez es reducida a geissoschizina por la geissoschizina: NADP+ 4,21 oxidorreductasa (EC 1.3.1.36) (Reaccin 4, figura 6) [151]. La estrictosidina -D-glucohidrolasa es una glucoprotena localizada en el retculo endoplsmico [7]; es altamente espe-
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cfica para la estrictosidina o su derivado 10-metoxi y en su forma nativa parece encontrarse en forma de agregados, en los cuales cada subunidad de 63 kDa se une a las otras por interacciones hidrofbicas [152]. Se ha demostrado que la estrictosidina -D-glucohidrolasa se encuentra codificada por un solo gen que ha sido clonado recientemente y se expresa en diferentes niveles en flores, tallos, hojas y races, lo que sugiere una regulacin tejido especfica; adems, la actividad enzimtica cuantificada en cada rgano es proporcional al nivel de ARNm detectado [7]. Su expresin es inducida por metil jasmonato (MeJa) y en los cultivos que acumulan AMIs la actividad de esta enzima es elevada [150], de ah que se le considere un paso clave en la biosntesis de estos compuestos. Por otra parte la informacin sobre la geissoschizina: NADP 4,21 oxidorreductasa es escasa, slo se tiene el reporte de una purificacin parcial a partir de clulas en suspensin de C. roseus y en comparacin con otras enzimas de esta va su actividad especfica es muy baja [151].
A partir de la 4, 21-didehidrogeissoschizina la ruta de biosntesis que lleva a la biosntesis de ajmalicina, catarantina y tabersonina se encuentra poco documentada . La ruta biosinttica hacia la produccin de ajmalicina comienza cuando la 4, 21-didehidrogeissoschizina es convertida en catenamina (Reaccin 1, figura 7) por la catenamina sintasa [19]. La catenamina es reducida a ajmalicina por la catenamina reductasa (Reaccin 2, figura 7). Las enzimas involucradas en esta parte de la va se han estudiado muy poco y slo se sabe que la catenamina reductasa es dependiente de NADPH [153]. Hasta ahora se han separado dos isoenzimas, una de las cuales interviene en la biosntesis de la ajmalicina y la otra convierte la forma iminium de la catenamina en tetrahidroalstonina [19]. Se desconoce como se regulan estas dos enzimas. La catenamina reductasa (Reaccin 2, figura 7) que cataliza la reduccin de la catenamina a ajmalicina, tiene un pH ptimo de 6.6 y una masa molecular de 81 kDa. La caracterizacin de la enzima tetrahidroalstonina sintasa (Reaccin 4,
Fig. 7. Biosntesis de la ajmalicina y serpentina. Los nmeros encerrados en un crculo corresponden a las enzimas: catenamina sintasa (1), catenamina reductasa (2); peroxidasa inespecfica (3), y tetrahidroalstonina sintasa (4). Las flechas cortadas indican varios pasos metablicos. Existe la posibilidad de quela ruta no inicie con la 4,21-dehidrogeissoschizina, si no que inicie con la 20,21-aldehido de dehidrocorinanteina. [5,116,117].
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figura 7), la cual cataliza la formacin de tetrahidrolstonina a partir de la forma iminium de la catenamina, muestra que ambas enzimas poseen el mismo pH ptimo y la misma masa molecular. La forma parcialmente purificada de la tetrahidroalstonina sintasa muestra una Km de 62 M para la catenamina y utiliza al NADPH pero no al NADH como cofactor [154]. La ajmalicina es oxidada a serpentina por peroxidasas bsicas que se encuentran dentro de las vacuolas [155] y se sabe que su produccin esta fuertemente influenciada por la luz [156]. Hasta ahora no se han purificado estas peroxidasas bsicas y tampoco se tienen datos sobre su especificidad, pues la ajmalicina en presencia de peroxidasa de rbano es oxidada a serpentina. Aparentemente esta conversin permite a las clulas vegetales mantener la ajmalicina almacenada dentro la vacuola. En clulas en suspensin de C. roseus la oxidacin de la ajmalicina parece estar regulada por luz, pues en su presencia los cultivos producen una gran cantidad de serpentina mientras que los cultivados en oscuridad slo acumulan ajmalicina [155,156]. De Luca [20], ha sugerido que la reduccin de la geissoschizina por la geissoschizina NADP+ 4,21 oxidorreductasa es reversible (Reaccin 4, figura 6) y que la ramificacin de la va puede ocurrir a partir de una modificacin diferente a la ciclizacin de la catenamina, este ltimo producto se reduce para formar ajmalicina, en tanto que la forma iminium tambin se reduce para formar tetrahidroalstonina (Reaccin 4, figura 7) [154]. Mientras que la catarantina se ha detectado en la mayora de los cultivos in vitro [157-160], la vindolina hasta hace poco tiempo slo se haba determinado en el nivel de trazas [161,
162]. Recientemente se ha reportado la seleccin de una lnea de callos de C. roseus capaz de acumular hasta 0.45 mg-1 g PS de vindolina en cultivos de callos incubados con luz [163]. La biosntesis y acumulacin de vindolina est asociada a la luz y al estadio de desarrollo de la planta y en tanto que la expresin de las enzimas para su biosntesis es rgano-especfica [1, 20, 118, 126, 135, 164-169]. La 4, 21-didehidrogeissoschizina representa tambin el precursor de inicio de biosntesis de la ajmalina, esta es una molcula altamente compleja y que contiene nueve carbonos quirales [170]. La biosntesis de la ajmalina involucra cerca de 10 pasos enzimticos (Figura 8). El primer paso metablica que deriva 4,21-didehidrogeissoschizina a la biosntesis de ajmalina es la oxidacin de este compuesto a geissoschizina, en una reaccin catalizada por la geissoschizina deshidrogenasa (EC 1.3.1.36) (Reaccin 1, figura 8), la cual adiciona, de forma estereoespfica, un hidrgeno en el carbono 21 en la posicin . La enzima ha sido purificada 35 veces de supensiones celulars de C. roseus; la enzima requiere de un pH ptimo de 7.6 y el valor de su Km para geissoschizina y para NADP+ es de 83 M y 77 nM, respecitvamente [151]. La polineuridina aldehdo esterasa (EC 3.1.1.78) cataliza la conversin del aldehdo polinueridina a 16-epi-vellosimina (Reaccin 3, figura 8) [170]. Produce un precursor inmediato para la biosntesis del esqueleto ajmalano que conduce a la biosntesis de ajmalina; esta enzima ha sido purificada recientemente 423 veces a homogeneidad a partir de suspensiones celulares de R. serpentina, posee una masa molecular de 30 kDa y un pI de 5.9; ha sido clonada mediante el escrutinio de una biblioteca de ADNc. La enzima pura tiene una actividad
Fig. 8. Biosntesis de la ajmalina. Los nmeros encerrados en un crculo corresponden a las enzimas: geissoschizina dehidrogenasa (1), vomilelina reductasa (2), polineuridina aldehdo esterasa (3), vinorina sintasa (4), vinorina hidroxilasa (5); 1,2-dihidrovomillenina:NADP+ oxidoreductasa (6). Las flechas punteadas indican que no se conocen las enzimas que catalizan dicha transformacion. Varias flechas indican varios pasos metablicos [170,171].
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especfica de 160.8 nkat mg prot.-1, es altamente especfica para la polineuridina aldehido como sustrato para el cual tiene una Km de 0.83 mM y pertenece a la familia de las /-hidrolasas [170]. El siguiente paso en la ruta de biosntesis de la ajmalina, es la biosntesis de vinorina y es catalizada por la acilCoA:16-epivellosimina O-acetiltransferasa (ciclizante) (nombre comn: vinorina sintasa) (EC 2.3.1.160) (Reaccin 4, figura 8). Esta enzima ha sido purificada 160 veces de suspensiones celulares de R. serpentina. Entre sus propiedades ms interesantes se encuentra su elevado pH (8.5) y temperatura ptima 35C, un pI de 4.4 y una masa molecular de 31 kDa. La Km para sus sustratos 16-epi-vellosimina y acetil-CoA es de 19.4 y 64 M, respectivamente, y al igual que otras enzimas de la ruta de biosntesis de la ajmalina es altamente especfica para sus sutratos [172]. La vinorina es hidroxilada a vomilenina por la vinorina, NADPH:oxgeno oxidorreductasa (21-hidrolizante)(EC 1.14.13.75) (Reaccin 5, figura 8). La enzima es completamente dependiente de NADPH y oxgeno molecular, se encuentra localizada en la fraccin microsomal y es inhibida por los inhibidores tpicos de las protenas citocromo P450, por lo que seguramente se trata de una citocromo P450 monooxigenasa. La enzima tiene un pH ptimo de 8.3 y su Km para el NADPH y la vinorina es de 3 y 26 M, respectivamente [173]. El ltimo paso conocido de la biosntesis de ajmalina es la saturacin del doble enlace de la indolmina de la vomilenina en forma estereoespecfica para producir la 2(R)-1,2-dihidrovomilenina por medio de la 1,2-dihidrovomilenina:NADP+ oxidorreductasa (EC 1.5.1.32) (Reaccin 6, figura 8). La enzi-
ma que cataliza la reaccin de reduccin es dependiente de NADPH y ha sido aislada recientemente de suspensiones celulares de R. serpentina; tiene una masa molecular de 43 kDa [171].
Biosntesis de catarantina y tabersonina

La biosntesis de la catarantina as como la de la tabersonina inicia en el 20, 21-aldehido de dehidrocorinantena y procede posiblemente va catenamina to estemmadenina y dehidrosecodina, el precursor de los alcaloides con esqueletos iboga o Aspidosperma (Figura 9) [116]. No se conoce nada acerca de la naturaleza de las enzimas involucradas en la conversin de la catenamina a catarantina y tabersonina.
Biosntesis de vindolina
Las suspensiones celulares de C. roseus poseen la capacidad de sintetizar catarantina y tabersonina [14,17] y de transformar tabersonina en 16-metoxitabersonina [174] pero no poseen la actividad enzimtica necesaria para la biosntesis de vindolina [118;164;175]. Por esta razn una gran cantidad de trabajos se han canalizado al estudio de las enzimas y los mecanismos de regulacin involucrados en la biosntesis de vindolina. Vzquez-Flota et al. [176], han determinado que cultivos de races transformadas retados con MeJa aumentan la produccin de catarantina. Estos resultados sugieren que probablemente algunas de las enzimas que estn participando en la
Fig. 9. Biosntesis de la catarantina y tabersonina. Las flechas punteadas indican pasos metablicos y enzimas desconocidas. Las flechas continuas varios pasos metablicos [116].
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biosntesis de este alcaloide estn sujetas a regulacin y pueden ser utilizados para el estudio de la ruta de biosntesis de la catarantina (Figura 9). La biosntesis de vindolina a partir de la tabersonina consta de seis pasos enzimticos (Figura 10) catalizados por la tabersonina NADPH:oxgeno oxidorreductasa (16-hidroxilante) (EC 1.14.13.73) (nombre comn: tabersonina 16-hidroxilasa), la S-adenosil-L-metionina:11-O-dimetil-17-O-deacetilvindolina 11-O-metiltransferasa (EC 2.1.1.94) (nombre comn: 11-O-dimetil-17-O-deacetilvindolina O-metiltransferasa), una hidroxilasa no caracterizada, la S-adenosil-L-metionina:16metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-tabersonina N-metiltransferasa (EC 2.1.1.99) (nombre comn: 16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-tabersonina N-metiltransferasa), la desacetoxivindolina,2 oxoglutarato:oxgeno oxidorreductasa (4-hidroxilante (EC 1.14.11.20) (nombre comn: desacetoxivindolina-4-hidroxilasa), y la acetilCoA:17-O-deacetilvindolina 17-O-acetiltransferasa (EC 2.3.1.107) (nombre comn: 17-O-deacetilvindolina Oacetiltransferasa) [118,135,164,168,169,174,175,177,178]. Los resultados reportados sugieren que la ruta de biosntesis de la vindolina est regulada por los procesos de desarrollo y restringida a las partes areas de la planta adulta, principalmente en hojas jvenes y en los cotiledones, pues es en estos tejidos en los que se han detectado los mayores niveles de ARNm y la actividad ms elevada de estas enzimas (Figura 12) [164,174,179]. Esta presencia va disminuyendo con la edad y con el tipo de rgano, siendo ya poco preponderante en hojas adultas, tallos, races y yemas florales. En cultivos celu-
lares de C. roseus se ha detectado actividad de tabersonina 16hidroxilasa y de 11-O-dimetil-17-O-deacetilvindolina Ometiltransferasa pero no de 16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxitabersonina N-metiltransferasa, desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y 17-O-deacetilvindolina O-acetiltransferasa [118,167, 174]. La regulacin de esta va ocurre por medio de un mecanismo complejo y a diferentes niveles. Esta regulacin comprende desde factores que afectan la presencia de estas enzimas en los niveles transcripcional, post-transcripcional y posttraduccional, hasta su localizacin dentro de la clula, del tipo de clula y, como se mencion con anterioridad, la edad del tejido. En plntulas de C. roseus se ha reportado que las enzimas tabersonina 16-hidroxilasa, (16-metoxi-2, 3-dihidro-3-hidroxitabersonina N-metiltransferasa, desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y 17-O-desacetilvindolina O-acetiltransferasa, alcanzan su mxima actividad seis das despus de la imbibicin [135]. Cuando estas plntulas son tratadas con luz, las enzimas tabersonina 16-hidroxilasa y desacetoxivindolina-4-hidroxilasa aumentan su actividad seis veces, en tanto que la 17-O-desacetilvindolina-17-O-acetiltransferasa lo hacen 10 veces [126, 174,175]. Este efecto de la luz sobre la actividad de las enzimas desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y 17-O-desacetilvindolina-17-O-acetiltransferasa, es mediado por fitocromo ya que son activadas por un pulso de luz roja (660 nm) y esta activacin es revertida por un pulso de luz roja lejana (710 nm) [183,184]. La 16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-tabersonina-N-
Fig. 10. Biosntesis de la vindolina. Los nmeros encerrados en un crculo corresponden a las enzimas: tabersonina 16-hidroxilasa (1), 11-Odimetil-17-O-deacetilvindolina O-metiltransferasa (2), hidroxilasa no caracterizada (3), 16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-tabersonina N-metiltransferasa (4), deacetoxilvindolina 4-hidroxilasa (5), 17-O-deacetilvindolina O-acetiltransferasa (6). [5,18,118,135,164,168,169,174,175,177, 178,180-182].
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metiltransferasa es la nica enzima de esta va cuya actividad no es afectada por la luz [126]. De todas las enzimas involucradas en la biosntesis de la vindolina, la desacetoxivindolina-4-hidroxilasa es la ms interesante. En plntulas de C. roseus los transcritos del gen D4h y la protena misma ya se encuentran presentes en la oscuridad. Al exponer las plntulas a la luz, la actividad enzimtica de la desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y los niveles de los transcritos del gen D4h se elevan significativamente. Los resultados reportados sugieren que este aumento en la actividad se debe a una isoenzima de pI 4.7, inactiva en la oscuridad, y la cual, en presencia de la luz, sufre una modificacin post-traduccional que la torna ms cida y activa [165; 184]. De manera coordinada la luz tambin induce la trascripcin del gen Dat y su producto, la 17-O-desacetilvindolina-17-Oacetiltransferasa, eleva su actividad enzimtica [185]. La TDC y la SS en estas plntulas exhiben un pico de actividad a los 5 das despus de imbibicin en todos los tejidos y ninguna de las dos es estimulada por luz [126,135]. Mientras el MeJa induce la acumulacin de vindolina y eleva las actividades enzimticas de la TDC, la SS, la desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y la 17-O-desacetoxivindolina-17-O-acetiltransferasa [144]. Tabersonina NADPH:oxgeno oxidorreductasa (16-hidroxilante) (EC 1.14.13.73). Esta enzima es una monoxigenasa P450 localizada en el retculo endoplsmico que requiere NADPH, O 2 y tabersonina para llevar a cabo su funcin (Reaccin 1, figura 10). Esta enzima es inhibida por CO, clotrimazol, miconazol y por citocromo C [174]. S-adenosil-L-metionina:11-O-dimetil-17-O-deacetilvindolina 11-O-metiltransferasa (EC 2.1.1.94). Esta metiltransferasa ha sido determinada tanto en cultivos celulares de C. roseus [169], como en plantas de la misma especie [135]. La enzima requiere (S)-adenosil-L-metionina como donador de grupos metilos y es altamente especfica para la 16-hidroxitabersonina (Reaccin 2, figura 10). S-adenosil-L-metionina:16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxitabersonina N-metiltransferasa (EC 2.1.1.99). Esta enzima se encuentra localizada en los tilacoides de los cloroplastos [118], requiere (S)-adenosil-L-metionina como donador de grupos metilo (Reaccin 4, figura 10) y es altamente especfica para su sustrato, la 16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-tabersonina [186]. La enzima ha sido parcialmente purificada tiene una masa molecular aparente de 60 kDa y es absolutamente dependiente de la presencia de un doble enlace en la posicin 2 [187]. Desacetoxivindolina,2oxoglutarato:oxgeno oxidorreduc tasa (4-hidroxilante (EC 1.14.11.20). Esta enzima es una dioxigenasa -cetoglutarato dependiente y cataliza, en el citoplasma, la adicin de O2 a la desacetoxivindolina y al -cetoglutarato produciendo deacetilvindolina, succinato y CO2; esta es la penltima reaccin de biosntesis de la vindolina (Reaccin 5, figura 10) [164,175,178]. Esta enzima es alta-
mente especfica, nicamente hidroliza el C-4 de la N(1)metil-desacetoxivindolina para formar la N(1)-metil desacetilvindolina; la adicin de cido ascrbico y iones ferrosos aumentan su actividad. La enzima, purificada a homogeneidad aparente a partir de hojas jvenes de C. roseus, es un monmero con una masa molecular de aproximadamente 45 kDa y posee tres isoformas con pI de 4.6, 4.7 y 4.8. La cintica de interaccin del sustrato con la enzima y los estudios de inhibicin del producto, sugieren que la reaccin se lleva a cabo mediante un mecanismo Ter-Ter ordenado. En este mecanismo el primer sustrato es el -cetoglutarato, seguido por el O2 y al final la desacetoxivindolina; los valores de Km para el -cetoglutarato, el O2 y la desacetoxivindolina son de 45, 45 y 0.03 M, respectivamente [175,178,188,189]. Si bien esta enzima se encuentra en el nivel de trazas en plntulas etioladas de C. roseus, su actividad aumenta sustancialmente con la presencia de la luz y con ella, la biosntesis de vindolina [164,182]. Las plntulas etioladas comienzan a acumular cantidades importantes de transcritos de la hidroxilasa y de la protena, pero prcticamente no hay actividad durante los diferentes estadios del desarrollo. Por el contrario, el tratamiento con luz produce un aumento importante en la actividad de la enzima, pero el aumento en los niveles del transcrito y de la protena es muy pequeo. Estos datos sugieren que el punto de regulacin por luz en la hidroxilasa se encuentra en el nivel post-traduccional [164,182]. Usando oligonuclotidos degenerados para el escrutinio de una biblioteca de ADNc de plntulas de C. roseus se obtuvieron 3 clonas, de las cuales dos representan alelos dimrficos cuyas secuencias difieren nicamente en el extremo 3 no traducido [165]. AcetilCoA:17-O-deacetilvindolina 17-O-acetiltransferasa (EC 2.3.1.107). El ltimo paso en la biosntesis de la vindolina es catalizado por la 17-deacetilvindolina-O-acetiltransferasa dependiente de acetil-CoA (Reaccin 6, figura 10) [168; 179]. La aparicin de la enzima se encuentra regulada por desarrollo en plntulas de C. roseus y la actividad enzimtica aparece slo despus de un tratamiento con luz de las plntulas etioladas [179]. Esta acetiltransferasa es una enzima dimrica que ha sido purificada a homogeneidad y tiene una masa molecular de 32/21 kDa [190] o 26/20 kDa [191]. La enzima pura est formada por cinco isoformas con pI en el rango de 4.3 y 5.4 [190, 191]. Los valores de Km para la acetil-CoA y para la deacetilvindolina son de 5.4 y 6.5 M y de 0.7 y 1.3 M, para las enzimas parcialmente purificadas [179] y purificadas a homogeneidad, respectivamente [190,191]. Los estudios de inhibicin muestran que la CoA es un poderoso inhibidor competitivo de la deacetilvindolina (Ki = 8 M) [179] similar a la tabersonina (50% de inhibicin a 45 M) [191]; mientras que la enzima no es inhibida significativamente por la vindolina hasta concentraciones de 2 mM [179,191]. El uso de oligonuclotidos degenerados para los extremos amino y carboxilo terminales y la amplificacin posterior de su producto por PCR permiti obtener una sonda con la cual
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se llev a cabo el escrutinio de una biblioteca de ADN genmico de C. roseus. Con lo anterior se obtuvo una clona que codifica para una protena de 439 aminocidos con la masa molecular predicha de 49,890 Da. La clona, conteniendo una extensin de seis histidinas en el amino terminal, se expres en E. coli mostrando niveles elevados de actividad. La actividad de la enzima recombinante es completamente dependiente de la presencia de deacetilvindolina o de acetil-CoA. El anlisis por Western blot de la protena recombinante de la de hojas de C. roseus, rinde una sola banda de 50 kDa de masa molecular, lo que sugiere que el heterodmero aislado durante la purificacin es probablemente un artefacto de la tcnica empleada [18]. Si bien an no se ha llevado a cabo la determinacin cintica de las enzimas de la biosntesis de la vindolina, existe suficiente evidencia para decir que los pasos limitantes de esta ruta son las dos reacciones de hidroxilacin (Reacciones 1 y 5, figura 10) [18].
te de la biosntesis de este tipo de alcaloides resulta ser la disponibilidad de los precursores monomricos [192-196]. Sin embargo, recientemente se ha purificado una enzima que cataliza especficamente dicho paso y ha sido denominada -3, 4-anhidrovinblastina sintasa (AVLBS) (Reaccin 1, figura 11). Esta enzima, dependiente de H2O2, que ha sido purificada a homogeneidad aparente (192 veces) a partir de hojas de C. roseus, tiene una masa molecular de 45.4 kDa y un pH ptimo de 6.5, si bien tambin presenta una actividad sustancial en el rango de pH de 4 5, el cual es el rango de pH comnmente determinado en las vacuolas. Adems de su actividad de AVLBS la enzima pura tiene actividad de peroxidasa. Su espectro visible de absorbancia muestra mximos de absorcin a 404, 501 y 633 nm sugiriendo que se trata de una proteina con hierro en un grupo hemo y que pertenece a la familia de las peroxidasas [197].
Compartamentalizacin Biosntesis de los alcaloides dimricos

La biosntesis de los alcaloides bisindlicos se inicia con la condensacin de la catarantina y la vindolina, para formar la 3,4-anhidrovinblastina, el precursor de la vinblastina, la vincristina, la leurosina y la catarina (Figura 11). Esta reaccin, al igual que la oxidacin posterior, parece ser llevada a cabo por peroxidasas inespecficas, lo que parece indicar que la limitanLa biosntesis de los AMIs es un proceso altamente compartamentalizado. La compartamentalizacin, y la localizacin en diferentes clulas de las distintas enzimas involucradas en esta va metablica, se pueden considerar como otro mecanismo de regulacin, ya que esta ubicacin requiere del transporte de los diferentes metabolitos de un punto a otro para su conversin. Prcticamente todos los compartimentos de la clula y
Fig. 11. Biosntesis de los alcaloides bisindlicos vincristina y vinblastina. Los nmeros encerrados en un crculo corresponden a kas enzimas: a-3,4-anhidrovinblastina sintasa (1). [117,192-197]. Las flechas punteadas indican que las enzimas correspondientes no han sido caracterizadas y/o se desconocen los pasos metablicos.
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diferentes tipos celulares intervienen en el proceso, e. g. el mensajero para la SS presenta una regin que codifica para un pptido seal de 31 aminocidos que lo dirige a la vacuola [122,148]; lo anterior apoya diversos ensayos que sugieren que se trata de una enzima vacuolar [119,148]. Por otra parte las enzimas estrictosidina glucosidasa y tabersonina 16-hidroxilasa se localizan en el retculo endoplsmico [7,174]. Las reacciones catalizadas por las enzimas TDC, 11-Odimetil-17-O-deacetilvindolina O-metiltransferasa, desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y 17-O-desacetilvindolina O-acetiltransferasa se llevan a cabo en el citoplasma [118,165,174]; la reaccin mediada por la enzima AVLBS se realiza en la vacuola [199]. La 11-O-dimetil-17-O-deacetilvindolina Ometiltransferasa se encuentra en los tilacoides de los cloroplastos (Figura 13) [118]. Los ARNm para la TDC y la SS se localizan en las clulas de la epidermis de los tallos, hojas y yemas florales, as como en las clulas corticales y del protoderma alrededor del meristemo apical de la raz [200]. En las races, la actividad enzimtica de la TDC se encuentra localizada en el citoplasma y en la regin apoplstica de las clulas meristemticas, as como en las clulas de la epidermis de la cpside de la raz [201]. Los ARNm de la desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y la 17-O-desacetilvindolina O-acetiltransferasa se localizan slo en los idioblastos y en las clulas laticferas de las hojas, tallos
y yemas florales [200]. Lo anterior sugiere mecanismos de translocacin de los intermediarios de una clula a otra, para la biosntesis de estos metabolitos [200]. Ms importante an es el hecho de que los primeros pasos en la biosntesis de la vindolina se llevan a cabo en diferentes compartimientos celulares a los de los ltimos pasos [182]. La tabersonina da origen a productos finales que se encuentran en tejidos diferentes en la planta (Figura 12) [180]. En este caso el ARNm para la minovincinina 19-O-acetiltransferasa (Reaccin 8, figura 12) slo se expresa en las clulas corticales de los meristemos radiculares; puesto que la TDC y la SS tambin se expresan en los mismos tipos de clula, se puede inferir que en ellas se llevan a cabo la biosntesis de la tabersonina y de sus derivados.
Regulacin
Investigaciones realizadas con la fraccin indlica, empleando clulas en suspensin de C. roseus, sugieren que no existe relacin directa entre los valores de mxima actividad de la enzima TDC y la produccin de alcaloides [131,202,203]; los datos de Eilert et al. [204], empleando inductores de origen fngico, tambin apoyan esta ltima conclusin. Sin embargo, tambin se ha reportado que variando la concentracin de
Fig. 12. Compartamentalizacin de la biosntesis de la vindolina y otros AMIs. Los nmeros encerrados en un crculo corresponden a las enzimas: tabersonina 16-hidroxilasa (1), (S)-adenosil-L-metionina-16-hidroxitabersonina-O-metiltransferasa (2), hidroxilasa no caracterizada (3), Sadenosil-L-metionina: 2, 3-dihidro-3- hidroxitabersonina-N-metiltransferasa (4), deacetoxylvindolina 4-hidroxilasa (5), acetil CoA: desacetilvindolina 4-O-acetiltransferasa (6), Tabersonina 19-hidroxilasa (7) y (10), minovincinina 19-O-acetiltransferasa (8), hidroxilasas (9) y (11) [13,18, 180,180-182,198].
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nutrimentos se observa una correlacin positiva entre la actividad de la enzima TDC y la acumulacin de alcaloides [205]. Es posible que la discrepancia entre resultados se deba a la clona en estudio [206]. La adicin de geraniol, 10-hidroxigeraniol y secologanina, precursores de la parte terpnica de la va, aumenta los niveles de alcaloides, particularmente de tabersonina, en cultivos de clulas en suspensin, lo que parece indicar que la produccin de alcaloides puede resultar limitada por una o ms etapas de la ruta terpnica [13,63,149,202,207,208]. Aunque esta conclusin no puede ser generalizada ya que existen evidencias contradictorias como el aumento en la produccin de alcaloides mediante la adicin de triptamina al medio de cultivo [209]. Por otra parte, la adicin de mevalonato no tiene efecto en la biosntesis de los AMIs [13]; sin embargo, es importante tomar en cuenta que recientemente se ha demostrado que los resultados dependen fundamentalmente de dos factores: la concentracin de los productos adicionados y la etapa en la que se encuentra el cultivo receptor. Mientras que bajas concentraciones de triptofano en la etapa temprana de la fase
estacionaria produce un aumento en la biosntesis de alcaloides la adicin de diversos precursores en la etapa tarda del ciclo de cultivo no produce ningn efecto [208]. Se ha utilizado lneas de C. roseus en suspensin celular que sobreexpresan a la TDC y a la SS para realizar experimentos de adicin de precursores [132,203,210]. En general, la adicin de secologanina al momento de la inoculacin produce un aumento importante en la cantidad de los AMIs; en tanto que la adicin, junto con la loganina, de triptofano o triptamina, produce un aumento an mayor en la biosntesis de los AMIs en ambas lneas transgnicas. La adicin de efectores externos como homogenados fngicos, cambo del pH del medio de cultivo, etc., tambin modifican, en algunos casos sustancialmente, la biosntesis de AMIs [176,211-218]. Mientras que la adicin de pectinasa aumenta los niveles de tabersonina 2.5 veces, la adicin de quitina eleva los niveles de ajmalicina en 50% y la adicin de cido jasmnico aumenta los niveles de lochnericina y horthammericina, pero no los de tabersonina [13]. La adicin tanto de homogenizados
Fig. 13. Compartamentalizacin de la biosntesis de los alcaloides indlicos en C. roseus. Redibujado de Meijer et al. [19] y Verpoorte et al. [221]. En la figura se muestra que todos los pasos se llevan a cabo en una sola clula, lo cual no es el caso. Los rayos indican enzimas que se sabe son reguladas por luz. Las flechas punteadas se refieren a reacciones que no estn del todo caracterizadas. Trp = triptofano; G = geraniol; MV = mevalonato; DAV = dacetilvindolina; MOH = 16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxitabersonina; 16 MT = 16-metoxitabersonina; 16-OHT = 16hidroxitabersonina; TAB = tabersonina; EG = Estrictosidina glicona; DG = Estrictosidina aglicona; 10-OHG = 10-hidroxigeraniol; VLB = vinblastina; VCR = vincristina; G10OH = geraniol 10-hidroxilasa; MIC = monoterpn (iridodial) ciclasa; LMT = (S)-adenosil-L-metionina:cido lognico metil transferasa; ES = estrictosidina sintasa; PDX = peroxidasa bsica; SG = estrictosidina glucosidasa; CR = catenamina reductasa; THA = tetrahidroalstonina sintasa; GDH = geizssoschizina deshidrogenasa; T16OH = tabersonina 16-hidroxilasa; OMT = 11-O-dimetil-17-Odeacetilvindolina O-metiltransferasa; NMT = 16-metoxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-tabersonina N-metiltransferasa; D4H = deacetoxilvindolina-4hidroxilasa; DAT = 17-O-deacetilvindolina O-acetiltransferasa. Los signos de interrogacin denotan enzimas que an se desconocen o que existen reportes contradictorios por el momento. Para una visin global de las diferentes clulas que intervienen en la biosntesis de los alcaloides indlicos en C. roseus ver la figura 14.
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de micelios fngicos, como de filtrados provenientes de cultivos de hongos aumentan de forma importante la acumulacin de diferentes AMIs [176,211,218]. Existen otros factores medioambientales que tambin modifican de manera importante la biosntesis de los AMIs; entre stos los extremos osmtico y salino se encuentran entre los ms importantes [211,213,219]. La adicin de KCl, NaCl, manitol y sorbitol incrementan la acumulacin de AMIs. Cuando conjuntamente se utiliza alguno de estos efectores y se adicionan precursores de la biosntesis de AMIs como triptamina y triptofano, la produccin de los AMIs mejora sustancialmente [219]. La biosntesis de la catarantina y de la vindolina se encuentra diferencialmente regulada. La biosntesis de la vindolina es regulada en cuatro diferentes niveles: tisular, celular, por desarrollo y el medio ambiente, en tanto que la de la catarantina no lo es. La localizacin tejido-especfica de las enzimas para la biosntesis de los AMIs, la regulacin ontognica de la biosntesis de vindolina como resultado de la expresin coordinada de las enzimas involucradas en el proceso, as como la presencia de alcaloides especficos en los tejidos de la raz y en la parte area de las plantas confirman que las rutas de biosntesis son expresadas de una forma tejido-especfica. Durante el desarrollo de la plntula, las actividades de la TDC y la SS son expresadas 36 48 horas antes que las de la desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y 17-O-desacetilvindolina O-acetiltransferasa [126]. La activacin de estas dos ltimas enzimas coincide con la transformacin cuantitativa de la tabersonina en vindolina y requiere de la participacin de la luz [126,164,182,183, 220]. Tambin se ha determinado que existe un gradiente basipetal de expresin de las enzimas TDC, SS, desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y 17-O-desacetilvindolina O-acetiltransferasa, lo que sugiere que la expresin de biosntesis de la vindolina ocurre transientemente durante el desarrollo temprano de la hoja, el tallo y la raz [1, 200] . La luz juega un papel central en la regulacin de la biosntesis de algunos alcaloides. En particular la luz activa algunos de los ltimos pasos de la ruta de biosntesis de la vindolina. La luz no participa en la formacin de los idioblastos ni de las clulas laticferas, por lo que an est por determinarse como ocurre la activacin por la luz de las enzimas que llevan a cabo la induccin de la biosntesis de los AMIs [182]. En suma, la catarantina es biosintetizada a lo largo de todos los tejidos de la planta, en tanto que la vindolina es biosintetizada slo en las partes areas. Las reacciones catalizadas por la TDC y la SS se encuentran localizadas en la epidermis superior e inferior de las hojas y en el protoderma de la raz y en las clulas corticales alrededor del meristemo apical. La desacetoxivindolina-4-hidroxilasa y la 17-O-desacetilvindolina O-acetiltransferasa se encuentran en los idioblastos y en las clulas laticferas (Figura 14). Es posible que la raz biosintetice catarantina y tabersonina y que stas sean transportadas va xilema a las clulas laticferas asociadas a las traqueidas. Estas ltimas clulas pueden convertir tabersonina en
Fig. 14. Compartamentalizacin de la biosntesis de alcaloides en C. roseus. (A) Corte transveral de una hoja de C. roseus y (B) corte longitudinal de una raz. E = epidermis. Las flechas llenas sealan idioblastos y las flechas vacas sealan clulas laticferas.
vindolina y sta acoplarse con catarantina para formar los alcaloides bisindlicos.
Diferenciacin celular
El proceso de desarrollo produce, adems de la morfognesis, la especializacin bioqumica de la clulas dando como resultado la biosntesis y/o acumulacin de metabolitos secundarios tales como alcaloides de diferente origen biosinttico [131, 222-227]. Se ha determinado que el contenido de hiosciamina, alcaloide derivado del tropano, en races transformadas de Hyosciamus muticus es similar al determinado en las races de plantas completas. Sin embargo, cuando las races son desdiferenciadas a callo, el contenido del alcaloide disminuye al nivel de trazas; cuando los callos son rediferenciados a races, el contenido de alcaloides vuelve a los niveles originales; este protocolo se puede repetir infinidad de veces con el mismo resultado [222]. En otros procesos tambin se ha determinado que existe una correlacin directa entre la diferenciacin celular y la biosntesis de metabolitos secundarios, e. g. la de monoterpenos en las glndulas epidrmicas de Mentha piperita [228]. En C. roseus se ha propuesto que la presencia de clulas laticferas son esenciales para la produccin de alcaloides monoterpnindlicos [135]; as, la vindolina, una de las dos unidades monomricas de los alcaloides bisindlicos, se biosintetiza en brotes pero no en los callos [229]. Se han obtenido resultados similares para el caso de la vinblastina, ya que este producto se acumula en brotes regenerados a partir de callos de C. roseus pero no en callos o en suspensiones celulares [230, 231]. La catarantina, por otra parte, se produce prcticamente en toda la planta [232-234].
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Conclusiones
Un problema importante a considerar en el estudio del metabolismo secundario en general, y en particular en el de C. roseus, es el hecho de que no se ha utilizado un solo modelo. En el caso de las enzimas involucradas en la biosntesis de los alcaloides monoterpn-indlicos, las enzimas estudiadas han sido aisladas de diferentes fuentes, y si bien es importante analizar la diversidad existente para estructurar un modelo para confrontarlo con la realidad, tambin lo es el poder tener una ruta biosinttica completa en un solo modelo. Se ha determinado que los niveles de alcaloides totales en las races en cultivo son de aproximadamente un orden de magnitud mayor que en las clulas en suspensin, confirmndose con esto que la diferenciacin celular juega un papel importante en la biosntesis de los alcaloides [235]. Las races transformadas de C. roseus poseen la capacidad de biosintetizar y acumular alcaloides indlicos en cantidades similares a los de las races de las plantas [235-239], adems de biosintetizar alcaloides que no haban sido reportados con anterioridad como la O-acetilvalesamina [239] y la 19(S)-epimisilina [240]. La elucidacin de la ruta de biosntesis que lleva a los productos naturales, slo puede alcanzarse mediante la purificacin de cada una de las enzimas. El conocimiento que se tiene hoy en da de la biosntesis de los AMIs es an fragmentado; mientras que ya se conoce con bastante profundidad la ruta de biosntesis de vindolina a partir de tabersonina, incluyendo la clonacin de algunos de los genes que codifican para las enzimas requeridas [18], an se est lejos de entender la biosntesis de la secologanina, la ajmalicina, la tabersonina, la catarantina y de varios de los intermediarios de la ruta de los AMIs, aunque sabemos que la luz y el estadio de desarrollo regulan la actividad y expresin de algunas de las enzimas. Se sabe que la biosntesis de la vindolina y de la catarantina son reguladas diferencialmente; la biosntesis de la primera se encuentra bajo un control celular (participan el cloroplasto, el citoplasma, el retculo endoplsmico y la vacuola), de desarrollo (los alcaloides se biosintetizan preferentemente en los tejidos jvenes), de tejido (participan por lo menos tres tipos de clulas) y medio ambiental (luz) ms estricto que la de la catarantina. Tambin sabemos que el uso de efectores que producen un aumento en el contenido de alcaloides en las clulas, provoca un incremento en la actividad de algunas de las enzimas o en los niveles de expresin de algunos de los genes que las codifican. Sin embargo, lo ms importante es el hecho de que se cuenta hoy en da con modelos experimentales tales como plntulas, cultivos celulares y races transformadas de C. roseus, as como con herramientas tales como anticuerpos, sondas moleculares y particularmente con las nuevas metodologas provenientes de la protemica. Recientemente se han planteado algunas de las preguntas que faltan por resolver: cual es el nmero de pasos de la va que se llevan a cabo en la epidermis o en los pices radicales; si la biosntesis de los alcaloides en las races y en la epider-
mis obedece a diferentes papeles biolgicos y funciones ecolgicas de los productos finales; que clase de tejidos produce intermediarios especficos para la biosntesis de la vindolina; como son movilizados los intermediarios en las clulas laticferas y en los idioblastos; para que se requiere un sistema tan sofisticado de biosntesis; que alcaloides se acumulan en las clulas laticferas, los idioblastos, la epidermis y las races [1]. Otra pregunta central para entender la biosntesis de los AMIs es porqu los efectores externos aumentan selectivamente la biosntesis de slo uno de los alcaloides y no la de todos, aunque ya se ha propuesto la existencia de canales metablicos para explicar estos resultados, y los de diferenciacin celular [131]. Tambin es importante determinar si existen transportadores especficos para el movimiento de los diferentes alcaloides entre los diferentes compartimientos celulares y los diferentes tejidos. Por otra parte, se debe evaluar el hecho de que varias de las enzimas involucradas en la biosntesis de los productos naturales tienen homologa con protenas relacionadas con patogenicidad. La complejidad de los procesos genticos, catalticos y de transporte de la biosntesis de los AMIs es uno de los retos intelectuales ms estimulantes en el rea de los metabolitos secundarios actualmente. Si bien se requieren ms de 50 pasos metablicos para sintetizar los alcaloides ms importantes de C. roseus, solamente se han determinado y caracterizada en algn grado alrededor de 20 de las enzimas requeridas (Tabla 1). Por lo que an faltan por elucidar un nmero importante de pasos metablicos, purificar las enzimas correspondientes y clonar sus genes. Tambin es necesario elucidar los diversos aspectos de su regulacin, tanto en el nivel celular como en el molecular, pero sobre todo determinar cual es la funcin de los AMIs en las plantas que los producen.
Agradecimientos
Los autores agradecen la revisin realizada por dos annimos evaluadores, y cuyos comentarios y observaciones mejoraron sustancialmente el presente trabajo. Para la nomenclatura de las enzimas se utilizaron las reglas de la Internacional Union of Biochemistry and Molecular Biology (http://www.chem. qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/).
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Rev. Soc. Qum. Mx.

2004, 48, 67-94

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

Keywords: Catharanthus roseus, alkaloid, biosynthesis, secundary metabolism.

Palabras clave: Catharanthus roseus, alcaloide, biosntesis, metabolitos secundarios.

Rev. Soc. Qum. Mx. 2004, 48

Vctor M. Loyola-Vargas, et al.

Fig. 1. Alcaloides indlicos sintetizados a partir de la estrictosidina [4, 5].

Alcaloides monoterpn indlicos

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

Rev. Soc. Qum. Mx. 2004, 48

Vctor M. Loyola-Vargas, et al.

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

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Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

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Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

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Biosntesis de los AMIS

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

Geraniol 10-hidroxilasa 79 10 oxogeranial; NADPH Vacuola? P Citocromo P-450a Membrana vacuola AH S

Geraniol 5.5 M Membrana vacuola AH Si

Rev. Soc. Qum. Mx. 2004, 48

NADPH: citocromo P-450 reductasa

Monoterpn iridodial ciclasa

SAM: cido lognico metil transferasa

Estrictosidina -D-glucosidasa SG 63; 230; 450

Hoja>raz>tallo>flor Cultivo de tejidos C. roseus y R. serpentina 35x Cultivo de tejidos C. roseus

Geissoschizina 83 M, NADP+ 77 nM Aldehdo de polineuridina

Polineuridina aldehdo esterasa

Cultivo de tejidos R. serpentina

Catenamina sintasa Catenamina reductasa 81 15

4, 21-geissoschizina Catenamina Catenamina imonium 62 M Catenamina + vindolina Vacuola P P

Vctor M. Loyola-Vargas, et al.

SAM: 16-metoxi-2, 3-dihidro-3hidroxitabersonina-N-metil-transferasa

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

AcetilCoA: deacetilvindolina 4-O-acetil-transferasa

Anhidrovinblastina sintasa (peroxidasa) VS 31 16-epi-vellosimina 19.4 M Acetil-CoA 64 M Vomilenina y NADPH

Cultivo de tejidos R. serpentina 20.6 Cultivo de tejidos R. serpentina

O2, NADPH 3 M, vinorina 26 M

Cultivo de tejidos R. serpentina

Rev. Soc. Qum. Mx. 2004, 48

Vctor M. Loyola-Vargas, et al.

Biosntesis de los primeros AMIS

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

Rev. Soc. Qum. Mx. 2004, 48

Vctor M. Loyola-Vargas, et al.

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

Biosntesis de catarantina y tabersonina

Rev. Soc. Qum. Mx. 2004, 48

Vctor M. Loyola-Vargas, et al.

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

Rev. Soc. Qum. Mx. 2004, 48

Vctor M. Loyola-Vargas, et al.

Compartamentalizacin Biosntesis de los alcaloides dimricos

Biosntesis de los alcaloides indlicos. Una revisin crtica

Rev. Soc. Qum. Mx. 2004, 48