C.

Método de aglutinación en tubo (semicuantificación)

Antígenos bacterianos MonlabTest® 1. Preparar una serie de tubos tal como sigue:
Diluciones 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 …
Aglutinación en porta y tubo Muestra (µL) 100 -- -- -- -- -- …
NaCl 9 g/L (mL) 1,9 1 1 1 1 1 …
Determinación cualitativa de anticuerpos febriles 1 mL
Para uso profesional de diagnóstico in vitro. Conservar a 2-8 ºC 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
desechar
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los Antígenos Bacterianos son una técnica de aglutinación en porta y tubo para la 2. Preparar 2 tubos más para Control Positivo y Negativo: 0,1 mL Control + 0,9 mL
detección y semicuantificación de anticuerpos anti-Salmonella, Brucella y Proteus en NaCl 9 g/L.
suero humano. Los reactivos, suspensiones bacterianas, coloreadas y estandarizadas, 3. Añadir una gota (50µL) de antígeno a cada tubo.
aglutinan en presencia del anticuerpo homólogo en las muestras ensayadas. 4. Agitar e incubar los tubos a 37ºC durante 24 h (Nota 3).
SIGNIFICADO CLÍNICO LECTURA E INTERPRETACIÓN (NOTA 4)
El diagnóstico de enfermedades febriles puede establecerse bien sea por el aislamiento Método de aglutinación en porta
del microorganismo en sangre, orina o heces o por la demostración del título de Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación
anticuerpos específicos, somáticos (O) y flagelares (H) en el suero del paciente. La inmediatamente después de retirar el porta del agitador y comparar los resultados
determinación de estos anticuerpos forma las bases para el ensayo de Widal que
con los sueros control.
establece que altos niveles de anticuerpos O y H superiores a 1/100 en suero, es
Los resultados obtenidos en el método de titulación en porta, son
indicativo de infección por estos microorganismos.
aproximadamente equivalentes a los que se obtendrían en el método de
REACTIVOS aglutinación en tubo con diluciones del suero de 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320
REACTIVO ANTÍGENO REFERENCIA TAMAÑO respectivamente. Cualquier resultado positivo, es aconsejable confirmar el título
Salmonella paratyphi AH a flagelar MO-165001 mediante el método de aglutinación en tubo.
Salmonella paratyphi AO 1,2,12, somático MO-165002 Método de aglutinación en tubo
Salmonella paratyphi BH b flagelar MO-165003 Examinar macroscópicamente el modelo de aglutinación (Nota 5) y comparar los
Salmonella paratyphi BO 1,4,5,12 somático MO-165004
resultados con los obtenidos en los tubos control.
Salmonella paratyphi CH c flagelar MO-165005
El control positivo debe mostrar aglutinación parcial o completa. El Control negativo
Salmonella paratyphi CO 6,7 somático MO-165006
Salmonella typhi H d flagelar MO-165007 5 mL (100 Tests) no debe mostrar ningún tipo de aglutinación.
Salmonella typhi O 1,9,12 somático MO-165008 Se considera como resultado positivo cualquier grado de aglutinación parcial o
Brucella abortus * somático MO-165009 completa, con diversos grados de clarificación del sobrenadante. El título de la
Brucella melitensis somático MO-165010 muestra se define como la dilución mayor que muestra resultado positivo.
Proteus OX2 somático MO-165011 CONTROL DE CALIDAD
Proteus OX19 somático MO-165012
Se recomienda utilizar el control positivo y negativo para controlar la funcionalidad
Proteus OXK somático MO-165013
Control + MO-165014
de los reactivos, así como modelo de comparación para la interpretación de
1 mL resultados.
Control - MO-165015
(*): Adecuada también para determinación de anticuerpos anti-Br. suis Todo resultado distinto al resultado que da el control negativo, se considerará
PRECAUCIONES positivo.
R: EUH208-Contiene Formaldehído. Puede provocar una reacción alérgica. EUH210- VALORES DE REFERENCIA
Puede solicitarse la ficha de datos de seguridad. Son indicativos de infección reciente:
Control +/- : H317-Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Contienen Salmonellas: Títulos  1/80 (anticuerpos somáticos) y  1/160 (anticuerpos
2-Metilisotiazol-3(2H)-ona (Proclin 950). flagelares).
Seguir los consejos de prudencia indicados en la FDS y etiqueta del producto Brucellas: Títulos  1/80.
COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS Proteus: Una elevada proporción de individuos normales da resultados positivos con
- Antígenos Bacterianos: Suspensión de Salmonellas, Brucellas y Proteus en tampón los antígenos de Proteus, especialmente en el ensayo de aglutinación en porta. Un
glicina, pH 8,2. Conservante. título inferior a 1/160 no debe considerarse significativo.
- Controles: Suero animal. Conservante. El nivel normal de anticuerpos febriles varía ampliamente según los diferentes
países y comunidades. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus
CALIBRACIÓN
propios valores de referencia.
No existe referencia internacional para la estandarización de la sensibilidad de estos
reactivos, por lo que se utiliza un control interno constituido por suero animal que CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
contiene anticuerpos frente a cada uno de los antígenos citados anteriormente y que Todas las características diagnósticas de los distintos reactivos de Antígenos
ha sido titulado con reactivos comerciales de calidad reconocida. Bacterianos pueden encontrarse en los correspondientes Informes Técnicos que se
PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD encuentran a disposición del usuario que lo solicite.
Antígenos Bacterianos: Listos para el uso INTERFERENCIAS
Controles: Listos para el uso. Bilirrubina (20 mg/dL), hemoglobina (10 g/L), lípidos (10 g/L) y factores
Mezclar los reactivos suavemente antes de usar. reumatoides (300 UI/mL) no interfieren.
Indicadores de deterioro de los reactivos: Presencia de partículas y agregados. LIMITACIONES DEL MÉTODO
Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el
- Las infecciones recientes, la inmunodepresión, el efecto prozona (Brucelosis) y la
envase cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y
se evita la contaminación durante su uso. No congelar. terapia con antibióticos (somáticos), pueden ocasionar falsos negativos.
- Se han descrito reacciones cruzadas con Brucela en casos de infección o
MATERIAL ADICIONAL
vacunación con algunas cepas de Vibrio cholerae, Pasteurella, Proteus OX19 e
- Agitador rotatorio de velocidad regulable a 80-100 r.p.m. Y. enterocolitica (serotipo 9).
- Estufa a 37ºC / - Agitador vortex / - Pipetas de 50 µL.
NOTAS
MUESTRAS
1. En los ensayos de anticuerpos anti-Brucela, se recomienda reducir la muestra a 20 µL para
Suero fresco. Estable 8 días a 2-8ºC o 3 meses a –20ºC. evitar el efecto prozona.
Las muestras con restos de fibrina deben ser centrifugadas antes de la prueba. No 2. En determinadas áreas geográficas, con elevada prevalencia de enfermedades febriles, se
utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas. recomienda diluir la muestra 1/4 en NaCl 9 g/L antes de realizar el ensayo en porta.
PROCEDIMIENTO 3. Se puede acelerar los tiempos de incubación de la siguiente manera:
- Antígenos somáticos (O) y Proteus: 48-50ºC, 4 h.
A. Método de aglutinación en porta (cualitativo) - Antígenos flagelares (H): 48-50ºC, 2 h.
1. Dejar atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La 4. Un resultado positivo aislado es menos significativo que una variación de títulos obtenidos en
sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas. ensayos realizados a distintos intervalos de tiempo. El diagnóstico clínico no debe realizarse
2. Depositar 50 µL de la muestra a ensayar (Nota 1 y 2) y 1 gota (50 µL) de cada control únicamente con los resultados del laboratorio, sino que debe considerarse al mismo tiempo los
datos clínicos del paciente.
en círculos separados de un porta.
5. La aglutinación somática se caracteriza por ser fina y granular, de formación lenta y
3. Mezclar el reactivo vigorosamente o con el agitador vortex antes del ensayo. Añadir difícilmente disgregable. La aglutinación flagelar es algodonosa, de formación rápida y
una gota (50 µL) de antígeno próxima a la muestra a ensayar. fácilmente disgregable.
4. Mezclar con ayuda de un palillo, procurando extender la mezcla por toda la BIBLIOGRAFÍA
superficie interior del círculo.
1. Edward J Young. Clinical Infectious Diseases 1995; 21: 283-290.
5. Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 80-100 r.p.m., durante 1 minuto. 2. Coulter JBS. Current Pediatrics 1996; 6: 25-29.
B. Método de aglutinación en porta (titulación) 3. David A et al. Current Opinion in Infectious Diseases 1994; 7: 616-623.
1. Utilizando una micropipeta, dispensar 80, 40, 20, 10 y 5 µL de muestra no diluida en 4. David R et al Current Opinion in Infectious Diseases 1993; 6: 54-62.
círculos separados de un porta. 5. Bradley D Jones. Annu Rev Immunol 1996; 14: 533 – 61.
2. Depositar 1 gota (50 µL) de antígeno en cada círculo próximo a la muestra a SÍMBOLOS UTILIZADOS PARA COMPONENTES Y REACTIVOS IVD
ensayar.
Fabricante Uso de diagnóstico in vitro
3. Mezclar con ayuda de un palillo, procurando extender la mezcla por toda la
superficie interior del círculo. No reutilizar Consultar las instrucciones de uso
4. Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 80-100 r.p.m., durante 1 minuto.
Contiene suficiente para <n> test Mantener seco
n
Código Límite de temperatura

Número de lote Fecha de caducidad

Código: MO-165001 - MO-165015 Monlab SL Cobalto, 74 08940 Cornellà de Llobregat (Spain) Tel. +34 93 433 58 60 Fax +34 93 436 38 94 [email protected] www.monlab.com
Rev. Abril 2023
 C. Tube agglutination method
Bacterial Antigens MonlabTest® 1. Prepare a row of tube test for each sample as follows:
Dilutions 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 …
Slide and tube agglutination test Sample (µL) 100 -- -- -- -- -- …
NaCl 9 g/L (mL) 1.9 1 1 1 1 1 …
Qualitative determination of febrile antibodies
Only for professional in vitro diagnostic use. Store at 2 - 8ºC. 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
discard
PRINCIPLE OF THE METHOD
The Bacterial Antigens is a slide and tube agglutination test for the qualitative and
2. Prepare 2 tubes for Positive and Negative control: 0.1 mL Control + 0.9 mL
semi-quantitative detection of antibodies anti-Salmonella, Brucella and certain
Rickettsias in human serum. The reagents, standardized suspensions of killed and NaCl 9 g/L.
stained bacteria, agglutinate when mixed with samples containing the homologous 3. Add a drop (50µL) of antigen suspension to each tube.
antibody. 4. Mix thoroughly and incubate tube test at 37ºC for 24 h (Note 3).
CLINICAL SIGNIFICANCE READING AND INTERPRETATION (NOTE 4)
Febrile diseases diagnostic may be assessed either by microorganism isolation in Slide agglutination method
blood, stools or urine, or by titration of specific antibodies, somatic (O) and flagellar Examine macroscopically the presence or absence of clumps within 1 minute
(H). The detection of these antibodies forms the basis for the long-established
Widal test. This test dictates that a serum with high levels of agglutinating after removing the slide from the rotator comparing test results with control
antibodies to O and H >1/100 is indicative of the infection with these serums.
microorganisms. The reactions obtained in the slide titration method, are roughly equivalent
REAGENTS to those which would occur in tube test with serum dilutions of 1/20, 1/40, 1/80,
1/160 and 1/320 respectively. If a reaction is found it is advisable to confirm the
REAGENT ANTIGEN REF SIZE reaction and establish the titer by a tube test.
Salmonella paratyphi AH a flagellar MO-165001 Tube agglutination test
Salmonella paratyphi AO 1,2,12, somatic MO-165002 Examine macroscopically the pattern of agglutination (Note 5) and compare the
Salmonella paratyphi BH b flagellar MO-165003 results with those given by all control tubes. Positive control should give partial
Salmonella paratyphi BO 1,4,5,12 somatic MO-165004 or complete agglutination. Negative Control should not give visible clumping.
Salmonella paratyphi CH c flagellar MO-165005 Partial or complete agglutination with variable degree of clearing of the
Salmonella paratyphi CO 6,7 somatic MO-165006
supernatant fluid is recorded as a positive.
Salmonella typhi H d flagellar MO-165007 5 mL (100 Tests)
The serum titer is defined as the highest dilution showing a positive result.
Salmonella typhi O 1,9,12 somatic MO-165008
Brucella abortus (*) somatic MO-165009 QUALITY CONTROL
Brucella melitensis somatic MO-165010 Positive and Negative controls are recommended to monitor the performance of
Proteus OX2 somatic MO-165011 the procedure, as well as a comparative pattern for a better result interpretation.
Proteus OX19 somatic MO-165012 All result different from the negative control result, will be considered as a
Proteus OXK somatic MO-165013 positive.
Control + MO-165014
Control - MO-165015
1 mL REFERENCE RANGES
(*): Useful also for Brucella suis antibodies. Salmonellas: Titers  1/80 (O antibodies) and  1/160 (H antibodies) indicates
PRECAUTIONS recent infection.
R: EUH208-Contains formaldehyde. May produce an allergic reaction. EUH210- Brucellas: Titers  1/80 indicate infection.
Safety data sheet available on request Proteus: A great number of false positive reactions have been reported in
Control +/- : H317-May cause an allergic skin reaction. Contain 2-Methylisothiazol- healthy individuals with Proteus antigens, especially in slide agglutination test. A
3(2H)-one (Proclin 950). titer of less than 1/160 should not be considered significant.
Follow the precautionary advice given in the SDS and the product label. The level of “normal” agglutinins to these organisms varies in different countries
and different communities. It is recommended that each laboratory establish its
REAGENTS COMPOSITION
own reference range.
- Bacterial Antigens: Suspensions of Salmonellas, Brucellas and Proteus in glycine
buffer, pH 8.2. Preservative PERFORMANCE CHARACTERISTICS
- Controls: Animal serum. Preservative All the performance characteristics of the Bacterial Antigens may be found in the
CALIBRATION corresponding Technical Report and they are available on request.
There is not any International Reference for the sensitivity standardization of these INTERFERENCES
reagents. For this reason, we use an internal control that contains animal serum
with antibodies anti-Salmonellas, Brucellas and Proteus, and tittered with Bilirubin (20 mg/dL), hemoglobin (10 g/L), lipids (10 g/L) and rheumatoid
commercial reagents of certified quality. factors (300 IU/mL), do not interfere.
PREPARATION AND STABILITY LIMITATIONS OF PROCEDURE
Antigen suspensions: Ready to use. - False negative results can be obtained in early disease, immune-
Controls: Ready to use. unresponsiveness, prozone (Brucelosis), and antibiotic treatment (somatic).
Mix reagents gently before use. - Serological cross-reactions with Brucella have been reported in cases of
Reagents deterioration: Presence of particles and clumps. infection or vaccination with some strains of Vibrio cholerae, Pasteurella,
All the components of the kit are stable until the expiration date on the label when Proteus OX19 and Y. enterocolitica (serotype 9).
stored at 2-8ºC, protected from light and contaminations. Do not freeze. NOTES
ADDITIONAL EQUIPMENT 1. When testing for Brucella antibodies it is recommended to reduce sample
- Mechanical rotator adjustable to 80-100 r.p.m. volume to 20 µL in order to avoid prozone.
- Heater at 37ºC. / - Vortex mixer. / - Pippetes 50 µL. 2. In some geographical areas with a high prevalence of febrile antibodies, it is
SAMPLES recommended to dilute the sample 1/4 in NaCl 9 g/L before to perform the
assay.
Fresh serum. Stable 8 days at 2-8ºC or 3 months at –20ºC.
3. The incubation procedure may be accelerated incubating as follows:
The samples with presence of fibrin should be centrifuged before testing.
- Somatic (O) and Proteus antigens: 48-50ºC for 4 h.
Do not use highly hemolized or lipemic samples.
- Flagellar (H) antigens: 48-50ºC for 2 h.
PROCEDURE 4. A single positive result has less significance than the demonstration of a
A. Slide agglutination method (qualitative test) rising or falling antibodies titer as evidence of infection. A clinical diagnosis
1. Bring the reagents and samples to room temperature. The sensitivity of the test should not be made on findings of a single test result but should integrate
may be reduced at low temperatures. both clinical and laboratory data.
2. Place 50 µL of the sample to be tested (Note 1, 2) and 1 drop of each control into 5. A somatic reaction (O) is characterized by coarse, compact agglutination,
separate circles on the slide test. which tends to be difficult to disperse, while flagellar (H) has a characteristic
3. Mix the antigen vial vigorously or on a vortex mixer before using. Add 1 drop loose, flocculant agglutination.
(50 µL) of antigen to each circle next to the sample to be tested. BIBLIOGRAPHY
4. Mix with a disposable stirrer and spread over the entire area enclosed by the
1. Edward J Young. Clinical Infectious Diseases 1995; 21: 283-290.
circle. 2. Coulter JBS. Current Pediatrics 1996; 6: 25-29.
5. Place the slide on a mechanical rotator at 80-100 r.p.m., for 1 minute. 3. David A et al. Current Opinion in Infectious Diseases 1994; 7: 616-623.
B. Slide agglutination method (titration) 4. David R et al Current Opinion in Infectious Diseases 1993; 6: 54-62.
1. Using a micropipette, deliver 80, 40, 20, 10 and 5 µL of undiluted serum into 5. Bradley D Jones. Annu Rev Immunol 1996; 14: 533 – 61.
separate circles of the slide test. SYMBOLS FOR IVD COMPONENTS AND REAGENTS
2. Place 1 drop (50µL) of the antigen to each circle next to the sample to be tested.
3. Mix with a disposable stirrer and spread over the entire area enclosed by the For in vitro diagnostic
Manufacturer
circle. use only
4. Place the slide on a mechanical rotator at 80-100 r.p.m., for 1 minute. Consult instructions for
Don’t re-use
use
Contains sufficient for
n Keep dry
<n> tests
Catalogue Code Temperature limitation

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Rev. April 2023