PRÁCTICA DE LABORATORIO #3: ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

González Isabella; Ordoñez Valentina

Universidad Icesi
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Bioquímica
Laboratorio de Biocatálisis
Santiago de Cali, Colombia
Mayo 29 2021
[email protected] ; [email protected]

1. Introducción.

El estudio de la cinética enzimática es presenta la enzima fosfatasa alcalina

ampliamente aplicado en diversos (FAl; E.C.3.1.3.1) perteneciente a la
contextos tales como la industria o la superfamilia de metaloenzimas
medicina, ya que, permite realizar homodiméricas que hidrolizan (3)
variados análisis basados en la acción mono ésteres orto fosfóricos unidos a
de las enzimas aplicando variaciones nucleótidos, proteínas y muchos otros
en el proceso como, concentración de sustratos, a pH entre 8-11 y en
sustrato, de enzima, cofactores, entre presencia de iones Zn+2 y Mg+2 [6]
otros. Los resultados de dichos análisis [CITATION GIL12 \l 3082 ]. A dicha
permiten mejorar procesos industriales enzima se le hará una evaluación de
o pruebas diagnósticas parámetros cinéticos mediante
respectivamente. Los organismos, en simulador lo cual permitirá conocer
especial, los multicelulares, son una actividad enzimática aproximada a
altamente complejos porque para llevar la teórica.
a cabo sus funciones metabólicas
requieren de una gran red de La fosfatasa alcalina está ampliamente
mecanismos y proteínas organizadas presente en el ser humano. Se
para generar u obtener la energía encuentra cuatro tipos de isoenzimas:
necesaria para su supervivencia. Las la no específica a tejido (TNAP, por
proteínas están presentes en todos los sus siglas en inglés) que se encuentra
organismos, sin embargo, presentan en hueso, hígado y riñón y son
grandes variaciones de un organismo a codificadas por el cromosoma 1, la
otro, ya que se sabe que no todos isoenzima placental (PLAP), la de
poseen los mismos requerimientos, su células germinales (GCAP) y la
participación metabólica difiere a intestinal (IAP), de las cuales sus genes
razón de la complejidad del organismo se ubican en el cromosoma 2 del
y sus necesidades. Las enzimas son humano. Todas estas isoenzimas
tipos de proteínas encargadas de difieren en propiedades fisicoquímicas,
catalizar las reacciones metabólicas, antigénicas y catalíticas [6][ CITATION
permitiendo un mejor funcionamiento GIL12 \l 3082 ]. Cada una de ellas
y adaptación al organismo. permite a nivel médico determinar
enfermedades de diversos tipos
En el contexto de la presente práctica relacionadas a las partes anatómicas
se mencionadas, mediante pruebas de
laboratorio. [ CITATION Lab \l 3082 ].

Por otro lado, la enzima en cuestión La fosfatasa alcalina cataliza la

está presente también en la bacteria hidrólisis del pnitrofenil-fosfato, a un
E.coli , específicamente en su espacio
periplásmico [3][ CITATION JEC92 \l
3082 ]. La presencia en este tipo de
microorganismo permite diversos
estudios a nivel de laboratorio como,
por ejemplo, crear cepas con diferentes
características mediante modificación
en su ADN, tal es el caso que se Ilustración 1. Reacción de ctálisis del p-
presenta al cambiar los aminoácidos de nitrofenol-fosfato por la fosfatasa alcalina.
fuente: [ CITATION GIL12 \l 3082 ]
la enzima fosfatasa alcalina de tipo
salvaje producida por Escherichia coli, compuesto (p-nitrofenol) que absorbe a
donde se crea una fosfatasa alcalina los 405 nm de longitud de onda (Figura
mutante que no solo tiene un aumento 1). Esta reacción generalmente ha sido
de 36 veces en la actividad enzimática, explotada con fines analíticos, en
sino que también conserva la estudios cinéticos y de identificación
estabilidad térmica. de FAl aisladas de nuevas fuentes
naturales. Se han reportado diversos
A nivel industrial esta enzima, se grados de afinidad por este sustrato
utiliza como control de la adecuada (Km) que van desde 1x10-8 mM y
pasteurización de la leche y crema, 0.265 mM en organismos como
dado que la fosfatasa alcalina se Escherichia coli y bovinos hasta 5.0 o
inactiva por calentamiento. La 50.0 mM en isoenzimas humanas [1]
presencia y metabolismo microbiano [ CITATION ATY08 \l 3082 ].
de bacterias de alta resistencia térmica
como Mycobacterium tuberculosis, se 2. Materiales y métodos.
debe interrumpir por encima de los 70
°C [6]. Lo cual muestra la utilidad de Para este informe, no se realizó diagramas
la actividad de la FAl en estudios de de entradas y salidas. Sin embargo, se
calidad e impacto metabólico de empleó el software llamado NetLogo Web
diversos alimentos. Adicionalmente, en
para simular las condiciones de un
las ciencias ambientales, la actividad
de FAl en rizosferas y suelos también laboratorio evaluando así la actividad
ha sido propuesta como indicadores de enzimática a diferentes concentraciones de
fertilidad de suelos y/o de su nivel de sustrato y el efecto que tiene los
contaminación ya que las reacciones de inhibidores en la reacción.
fosforilación/desfosforilación
involucradas en la transducción de 3. Análisis de Resultados
señales son muy importantes en la
membrana plasmática de las células El modelo que se va a emplear para este
vegetales [6]. laboratorio es el descrito por Michaelis-
menten que se evidencia en la ecuación 1.
Para dar un contexto acerca de su valor
comercial se encuentra en páginas
K c K r E+S →[E−S]→ E + P K d
comerciales de internet como Labolan
en una presentación de 10 ml por un Ecuación 1. ecuación de Michaelis-Menten
costo de 52,00€ la unidad [4]
Donde E representa la enzima, S el
sustrato, [E-S] el complejo enzima sustrato
(enzima acomplejada), y P representa los Tabla 1. Diseño del experimento para obtener datos de
velocidades iniciales de la cinética enzimática
productos. Los demás valores representan:
Kc: constante cinética establece la Ensayo # Sustrato Vo
dirección de enzima sustrato hacia el (µg/mL)
1 50 1,61
complejo [E-S]
2 100 3,17
Kr: Constante de reversibilidad es la 3 150 4,42
constante que va en sentido contrario 4 200 5,58
como se da la reacción en sentido contrario 5 250 5,63
para formarse E + S forma libre disociar 6 300 6,53
Kd: complejo enzima sustrato después de 7 350 8,00
que se ha formado efectivamente realiza la 8 400 7,50
9 450 8,78
catálisis correspondiente generando el
10 500 9,28
producto deseado transformación del 11 550 9,22
sustrato al producto. 12 600 9,05
A continuación, se explicará cómo se 13 650 9,17
determinó el valor de una cada de las 14 700 9,22
constantes. 15 750 8,68
 Kc = 50, para lograr interacción rápida
del sustrato con la enzima y formación Es importante resaltar que se determinaron
del complejo enzima-sustrato. las velocidades iniciales con el software
 Kr = 25, con el fin de tener una menor NetLogo Web. Primero, se ajustaron los
tasa de disociación del complejo valores para cada constante cinética.
enzima sustrato evitando que vuelva a Segundo, se ajustó la concentración del
su estado inicial. sustrato empezando en 50 µg/mL con un
 Kd = 70, para lograr mayor tasa de aumento de 50 µg/mL de ahí en adelante.
disociación entre la enzima y el Tercero, se corría el simulador, el cual
sustrato. arrojaba las velocidades iniciales y se
Partiendo del supuesto que la simulación paraba después de haber transcurrido un
de la biocatálisis estará conformada a periodo de 20 segundos para cada ensayo
partir de una solución madre de enzima y con el fin de guardar este valor.
una solución de sustrato que tendrán un
volumen final de 2 mL fijo en todos los Fue de vital importancia estimar un
ensayos. periodo de tiempo en cual se pueda
observar una recta en la variación de la
En la siguiente tabla, se puede observar concentración, para evitar la saturación del
información de cada uno de los ensayos, la medio y que se genere una línea recta en la
concentración del sustrato (µg/mL) y la concentración de los productos.
velocidad inicial (V o ). Es de importancia
aclarar que estos primeros ensayos se
realizaron sin la adición de inhibidor.
 L-B SI
0.7
0.6
0.5 f(x) = 27.33 x + 0.06
0.4 R² = 0.99

1/Vo
0.3
0.2
0.1
0
0 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03
1/ Concentració n S

Figura 4. Linealización Lineweaver Burk para

Figura 2. Comportamiento de la reacción enzimática a experimento sin inhibidor
las diferentes concentraciones de sustrato
1 K 1 1
En la figura 2 se puede apreciar el = m ⋅ +
V 0 V max [S ] V max
comportamiento de las concentraciones del
reactivo, complejo enzima-sustrato y el Ecuación 2. Ecuación de linealización de Lineweaver-
Burke. 
producto.
Donde el eje y está dado por
Con los datos obtenidos en la tabla 1, se 1/V0(s*mL/ug), el eje x por 1/[S] (mL/ug),
realizó la gráfica del modelo cinético de la pendiente corresponde a Km/Vmax(s) y
Michaelis Menten como se muestra a el corte con el eje y corresponde a 1/Vmax
continuación. (s/ug).
Para la linealización con el método de
M-M SI Lineweaver-Burke, se tiene:
10
f(x) = 0.01 x + 3.04 y=27,333 x +0,0594
8 R² = 0.82
6
Tomando lo datos obtenidos
Vo

4 anteriormente, se procedió a calcular la

2 velocidad máxima de la reacción
0 empleando el corte con el eje y y el Km
0 100 200 300 400 500 600 700 800
empleando la pendiente de la curva:
Concentració n S
1
Figura 3. Gráfica de Michaelis Menten para b=
experimento sin inhibidor.
V max
1 1 ug
V max = = =16,83
Posteriormente se realizaron las b 0,0594 s∗mL
regresiones lineales de Lineweaver Burk,
Eadie Hofstee y Hanes Wolf, con el fin de Km
m=
determinar cuál linealización es más V max
acertada basándose en su coeficiente de
correlación, además de determinar los K m =m⋅V max
parámetros cinéticos Km y Vmáx de cada
ug
método para después compararlos en la K m =460,01
mL
tabla 2.
 E-H SI H-W SI
10
f(x) = − 337.92 x + 14.17 100

Concentración S/Vo
8 R² = 0.84
80
6 f(x) = 0.07 x + 22.86
60 R² = 0.95
Vo

4 40
20
2
0
0 0 100 200 300 400 500 600 700 800
0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04
Concentración S
Vo/Concentració n S
Figura 6. Linealización Hans Wolf para experimento sin
Figura 5. Linealización Eady Hofstee para experimento inhibidor.
sin inhibidor

V0 [S ] 1 Km
V 0=V max−K m ⋅ = ⋅ [S ]+
[S] V 0 V max V max ❑
Ecuación 3. Ecuación de linealización de Eadie-Hofstee. Ecuación 4. Ecuación de linealización de Hanes-Woolf.

Donde el eje y está dado por V 0(ug/s*mL), Donde el eje y está dado por [S ]/V 0(s), el
el eje x por V 0/[S] ( s−1 ), la pendiente eje x por [S] (ug/mL), la pendiente
corresponde a K m(ug/mL) y el corte con el corresponde a 1/V max (s*mL/ug) y el corte
eje y corresponde a V max (ug/mL*s). con el eje y corresponde a K m/V max (s).

Para la linealización con el método de Por último, para la linealización con el

Eadie-Hofstee, se tiene: método de Hanes-Woolf, se tiene:
y=−337,92 x +14,173 y=0,0735 x +22,863

Tomando lo datos obtenidos Tomando lo datos obtenidos

anteriormente, se procedió a determinar la anteriormente, se procedió a calcular la
velocidad máxima de la reacción a partir velocidad máxima de la reacción
del corte con el eje y y el Km empleando la empleando el corte con el eje y y el Km
pendiente de la curva: empleando la pendiente de la curva:
b=V max 1
m=
V max
ug
V max =14,173
s∗mL 1 1 ug
V max = = =13,605
m 0,0735 s∗mL
m=−K m
Km
K m =−m b=
V max
K m =−(−337,92 ug /mL) K m =b ⋅V max
K m =337,92ug /mL ug
K m =311,05
mL
A continuación, se muestra la tabla 2 con 8 400 6,05
los parámetros cinéticos hallados en cada 9 450 6,85
método de linealización. 10 500 6,89
11 550 7,37
Tabla 2. Parámetros cinéticos de cada método de
12 600 7,50
linealización. 13 650 7,53
Método Vmáx Km 14 700 8,11
(ug/mL*s) (ug/mL) 15 750 8,05
L-B 16,830 460,01
E-H 14,173 337,92 Por otro lado, en la figura 7 se puede
H-W 13,605 311,05 apreciar el comportamiento de las
concentraciones del reactivo, complejo
Una vez obtenidas las gráficas de las enzima-sustrato y el producto.
regresiones lineales, se comparó cada uno
de sus coeficientes de correlación,
llegando a la conclusión de que la
linealización más acertada para este
experimento es la de Lineweaver Burk
puesto que tiene un coeficiente de
correlación más alto y cercano a la unidad
que las demás regresiones lineales. Por
esto mismo, se cree que los valores de los
parámetros cinéticos hallados más
cercanos a los reales son los Figura 7. Comportamiento de la actividad enzimática de
la enzima con inhibidor presente en el medio
correspondientes al método de
linealización de Lineweaver-Burke. Con los datos obtenidos en la tabla 3, se
realizó la gráfica del modelo cinético de
Para determinar el impacto que tiene los Michaelis Menten como se muestra a
inhibidores en las reacciones enzimáticas continuación.
diseñaremos una simulación similar al
primer escenario, pero con la diferencia de M-M CI
la adición de 25 moléculas de inhibidor 10
que fueron constantes en cada uno de los 8 f(x) = 0.01 x + 2.16
6 R² = 0.9
15 ensayos.
Vo

4
2
Tabla 1 Diseño del experimento para obtener datos de
velocidades iniciales de la cinética enzimática con 0
0 100 200 300 400 500 600 700 800
inhibidor.
Ensayo # Sustrato Vo Concentració n S
(µg/mL)
1 50 1,26 Figura 8. Gráfica de Michaelis Menten para
2 100 2,26 experimento con inhibidor
3 150 3,63 En contraste, se puede decir que la
4 200 4,10
pendiente y la intersección con el corte x
5 250 5,00
6 300 5,89 sufrieron una leve disminución, lo que se
7 350 5,89 debe a la pequeña cantidad de inhibidor
que se adicionó. Además, se cree, que si se errores porque ambos ejes dependen de
hubiera adicionado mayor cantidad de una variable independiente [5][ CITATION
inhibidor se evidenciaría una mayor OLe05 \l 3082 ].
disminución tanto en la velocidad de
Teniendo en cuenta lo plasmado
reacción como en la pendiente y el corte
anteriormente, los valores de R2 hallados y
con x.
que se trabajó con concentraciones
relativamente altas, se llegó a la
4. Preguntas de la guía.
conclusión que el método de lineweaver
En cuanto a las regresiones lineales de la Burk era el método más confiable de
gráfica de Michaelis Menten, todas son todos, sin dejar de lado su fácil aplicación
circunstanciales, la linealización de a la ecuación de Michaelis-Menten.
lineweaver Burk no es recomendable de
emplear cuando se trabaja con bajas Siguiendo con lo anterior, se realizó esta
concentraciones puesto que puede tener un linealización para el experimento con
gran error, aunque sea un método sencillo inhibidor con el fin de realizar una
y es el único que tiene las variables comparación con la del experimento sin
dependientes e independientes separadas, inhibidor.
lo que permite tener buenos estimativos
para la Vmáx [5][ CITATION OLe05 \l L-B CI
3082 ]. 1
0.8
f(x) = 36.04 x + 0.07
Por otro lado, la linealización de Eady 0.6 R² = 1
1/Vo

Hofstee tiene una tasa de error baja a 0.4

concentraciones bajas, sin embargo, esta 0.2
afecta los ejes X y Y por la velocidad 0
0 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03
inicial en estos, de modo que, si esta tiene
1/Concentració n S
algún tipo de error, este se extiende a toda
la gráfica y no exclusivamente a un eje. Figura 9. Linealización Lineweaver Burk para
Así mismo, permite visualizar fácilmente experimento con inhibidor.
los parámetros cinéticos por no haber la
Del mismo modo que con la regresión
necesidad de efectuar cálculos adicionales,
lineal del experimento sin inhibidor, se
siendo necesario solo identificar el corte
determinaron los parámetros cinéticos,
con el eje y y la pendiente de la gráfica
obteniendo los siguientes resultados:
linealizada [5][ CITATION OLe05 \l
Vmáx = 14,85 ug/s*mL
3082 ].
Km = 535,49 ug/mL.

Por último, la linealización de Hanes Wolf

Con base en esto, se pudo observar que
representa la relación entre la
concentración de sustrato y la velocidad de con la adición del inhibidor se vio afectada
reacción (eje y) frente a la concentración la velocidad máxima que disminuyó y el
de sustrato [S] (eje x). Este método es Km que aumentó por lo tanto el tipo de
empleado, generalmente, para determinar inhibición que se llevó a cabo fue una
valores más exactos de la velocidad inhibición mixta. Para determinar si el tipo
máxima. Sin embargo, es muy sensible a
de inhibición es mixta competitiva o
acompetitiva, se observó de forma conditions. Russ. J. Phys. Chem.,
detenida las gráficas de regresión lineal, en 1947-1951.
las cuales se puede apreciar que el [2]CA.Alvarez, Acosta, E., & Caicedo, N.
intercepto con el eje x cambia, por lo que (2019). actividad enzimática de la
fosfatasa alcalina, guia de
la velocidad máxima cambia y la
laboratorio (19-01). Obtenido de
pendiente aumenta, lo que señala que no es
https://www.uco.es/dptos/bioquimi
acompetitiva, por lo tanto, es una ca-biol-
inhibición mixta con tendencia a mol/pdfs/30%20FOSFATASA
competitiva. %20ALCALINA.pdf.
[3]JE, C. (1992). "Estructura y mecanismo
Para calcular la actividad enzimática de la de la fosfatasa alcalina" . Revisión
fosfatasa alcalina se toma la velocidad anual de biofísica y estructura
inicial registrada más alta en el biomolecular ,
experimento sin inhibidor, y se procede a https://www.annualreviews.org/doi
cambiar las unidades de está empleando /pdf/10.1146/annurev.bb.21.06019
los factores de conversión y de 2.002301#article-
estequiometria correspondientes como se denialhttps://www.labolan.es/es/pr
muestra a continuación. oducto/fosfatasa-alcalina-
10ml.html .
9.28 ug Producto [4]Labolan. (s.f.). Labolan. Obtenido de
∗umol Producto https://www.labolan.es/es/producto
s∗mL
∗60 s /fosfatasa-alcalina-10ml.html
139.11ug Producto 1 umol S 4,002umol Sustrato
x =
[5]Levenspiel, O. (2005). Ingeniería de las
1 min 1 umol Producto min∗mL
reacciones químicas. .
[6]Mercado-Mercado, G., Duarte-Muñoz,
Una vez hecho esto se obtiene el valor de
N., Alvarez-Parrilla, E., Rosa, L. d.,
la velocidad en la que se hidroliza el & Wall-Medrano, A. (07 de 06 de
sustrato, a continuación, se multiplicará 2012). tecnociencia. Obtenido de
por el volumen de la reacción para obtener Fosfatasa alcalina (E.C.3.1.3.1):
el valor de la actividad enzimática y sus bioquímica y aplicaciones en las
unidades quedarán en umol/min de ciencias biomédicas, ecológicas y
sustrato, esta unidad será llamada DEA, la alimentarias (uach.mx)
cual hidrolizará 1umol de sustrato (4-
nitrofenil fosfato) por minuto [2]
[ CITATION CAA19 \l 3082 ].

4,002 umol S
Ae= ∗2 mL=8,005 DEA
min∗mL

Referencias
[1]ATYAKSHEVA, L. C. (2008). The
catalytic properties of alkaline
phosphatases under various