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Resumen

La microscopía de fluorescencia ha sido de suma importancia en diversos ámbitos de

investigación principalmente en la biología. La microscopía de fluorescencia se basa en los
mismos principios de óptica de la microscopía común, pero con diferencias en el manejo,
aplicación y diseño, ya que esta tiene una relación estrecha con la generación, transmisión y
emisión de longitudes de onda las cuales se ajustan a los fluorocromos que se desean
visualizar. Sus inicios se remontan entre 1911 y 1913 con Heimstaedt y Lehmann creadores
de los primeros microscopios de fluorescencia, que tenían como objetivo de observar la
autofluorescencia en bacterias y distintos tipos de tejidos, tiempo después a principios del
siglo XXI se revoluciona la biología debido al desarrollo de técnicas que hacían uso de
colorantes fluorescentes. La generación de luminiscencia a través de la excitación de una
molécula por fotones de luz ultravioleta, ha sido parte fundamental de grandes
descubrimientos por ello es importante conocer a fondo su trabajo junto con el microscopio
de fluorescencia.

Palabras clave: Fluorescencia, fluoróforo, microscopio, espejo dicroico, fuente de luz,

energía, longitud de onda, átomo, fotoblanqueo, temple, molécula, emisión, absorción,
electrones, irradiar, espécimen, filtro, luz, electrones, fotones, energía y radiación.

Abstract

Fluorescence microscopy has been of great importance in various fields of research,

mainly in biology. Fluorescence microscopy is based on the same optical principles as
common microscopy, but with differences in handling, application and design, since it has a
close relationship with the generation, transmission and emission of wavelengths which are
adjusted to the fluorochromes that you want to visualize. Its beginnings date back between
1911 and 1913 with Heimstaedt and Lehmann, creators of the first fluorescence microscopes,
whose objective was to observe autofluorescence in bacteria and different types of tissues,
later at the beginning of the century XXI revolutionizes biology due to the development of
techniques that made use of fluorescent dyes. The generation of luminescence through the
excitation of a molecule by photons of ultraviolet light has been a fundamental part of great
discoveries, therefore it is important to know in depth its work together with the fluorescence
microscope.

Keywords: Fluorescence, fluorophore, microscope, dichroic mirror, light source, energy,

wavelength, atom, photobleaching, quenching, molecule, emission, absorption, electrons,
irradiate, specimen, filter, light, electrons, photons, energy and radiation.
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Índice

Portada ................................................................................................................................ 1
Resumen ............................................................................................................................. 2
Palabras Clave ................................................................................................................... 2
Abstract .............................................................................................................................. 2
Key words............................................................................................................................ 2
Introducción ........................................................................................................................ 4
Objetivos ............................................................................................................................. 4
Desarrollo ......................................................................................................................... 5-9
Antecedentes ............................................................................................................ 5
Principio de operación ............................................................................................ 5-7
Teoría de la fluorescencia molecular ............................................................ 5-6
Ley de Stokes ............................................................................................... 6-7
Funcionamiento ......................................................................................................... 7
Características ....................................................................................................... 7-8
Tipos de fluorescencia............................................................................................... 8
Factores que afectan la fluorescencia ....................................................................... 9
Aplicaciones .............................................................................................................. 9
Conclusiones ..................................................................................................................... 9
Fuentes de Información .................................................................................................... 10
Glosario en términos ........................................................................................................ 11
Anexos ............................................................................................................................... 12
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Microscopio de fluorescencia
Introducción
La presente investigación se basa en el estudio del microscopio de fluorescencia, que
aborda desde sus antecedentes, los principios de su operación y teorías, hasta su
funcionamiento, sus características, tipos y aplicaciones.

En el mundo, todos los objetos y seres vivos tienen una composición más allá de lo
que nuestros ojos pueden observar, y actualmente podemos guiarnos mediante imágenes
que encontramos en libros o internet. Sin embargo, a lo largo de los años los científicos han
requerido de distintos instrumentos como auxiliares que permitieron el correcto
entendimiento.

Para el estudio detallado de diferentes componentes de células y tejidos animales o

vegetales se requiere del uso de instrumentos que permiten ampliar más veces la imagen de
las estructuras que los constituyen: el microscopio. Los microscopios son instrumentos de
óptica que nos permiten ver objetos muy pequeños o detalles estructurales imposibles de
distinguir a simple vista porque están por debajo del límite de resolución del ojo humano.

Hay diferentes clases de microscopios, según su configuración, características,

sistemas de iluminación, y elementos utilizados para la obtención de imágenes. Entre la
clasificación según su sistema de iluminación, tenemos el microscopio de fluorescencia. Los
microscopios de fluorescencia son aquellos que utilizan las propiedades de fluorescencia para
generar una imagen de la muestra. Este microscopio permite observar sustancias que emiten
luz propia cuando son iluminadas con una longitud de onda determinada.

La microscopía de fluorescencia es una técnica poderosa con altos niveles de

sensibilidad y resolución microscópica que se utiliza en varias áreas, como son la
microbiología, la ingeniería medioambiental, la biología celular, patología, entre otras más.

Queda claro que los microscopios de fluorescencia son trascendentales para

continuar con diversos estudios científicos que permitan la evolución de la humanidad. Es por
ello que a continuación se presentarán los aspectos más importantes acerca de este tipo de
instrumentos.

Objetivo General
Analizar el funcionamiento del microscopio de fluorescencia, así como su origen, las
leyes que lo rigen y sus características para comprender las aplicaciones e importancia que
este tiene en distintas áreas de investigación.

Objetivo específico
Exponer ante el grupo datos relevantes del microscopio de fluorescencia para dar a
conocer su funcionamiento dentro de la carrera de Ingeniería Química.
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Antecedentes

Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico convencional al que se le

es agregado un accesorio complementario de iluminación, denominado fluorescencia.

Los primeros microscopios de fluorescencia fueron desarrollados entre 1911 y 1913.

Por los físicos alemanes Otto Heimstaedt y Heinrinh Lehmann como un “sucedáneo” del
microscopio ultravioleta. Estos se emplearon para la observación de la autofluorescencia de
bacterias, tejidos animales y vegetales.

Poco después, Stanislav Von Provazek utilizó la microscopía de fluorescencia para

estudiar la unión del tinte de tejidos fijos y las células vivas. Pero, no fue hasta la década de
1940 que Albert Coons desarrolló una técnica para etiquetar anticuerpos con colorantes
fluorescentes. Esto fio lugar al campo de la inmunofluorescencia.

A comienzos del siglo XXI, el campo de la microscopía de fluorescencia provocó una

revolución en la biología celular. Este unió al poder de las imágenes de celular vivas, el
marcado múltiple de orgánulos individuales y complejos macromoleculares. Esto se logró con
el uso de sondas fluorescentes sintéticas y genéticamente codificadas.

Principio de operación
La microscopía básica se basa en teñir mediante colorantes los componentes
celulares que normalmente son incoloros y no se pueden distinguir al microscopio. Entonces
mediante el contraste se permite distinguir las estructuras para su estudio. La microscopía de
fluorescencia tomó esta idea fundamental y la modificó para su propio uso. Es por ello que
decidieron suplantar colorantes comunes por tintes fluorescentes que son moléculas capaces
de absorber la luz en una longitud de onda específica. Para posteriormente con cierto tiempo
de retraso emitir o reflectar su propia luz en una longitud de onda más larga de la que recibió.

Teoría de la fluorescencia molecular

La fluorescencia es el proceso de emisión de luz por electrones que son excitados con
radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental,
liberando su exceso de energía en forma de fotones (emisión de luz). En la fluorescencia se
excitan y relajan electrones de manera simultánea.

Figura 1. Excitación de electrones en fluorescencia

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Se trata de un fenómeno de luminiscencia de vida corta, y es la propiedad que tienen

ciertas moléculas denominadas fluorocromos (moléculas capaces de absorber fotones y
emitir fotones de menor energía, es decir, mayor longitud de onda) y fluoróforos (parte del
fluorocromo responsable de la emisión de fluorescencia). El fluorocromo es utilizado como un
marcador colorante fluorescente para crear contraste en zonas determinadas de elementos
de interés.

Figura 2. Diagrama de Jablonski que ilustra los procesos probables de excitación y relajación

Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque hay
diversas formas en las cuales un átomo o una molécula excitada liberan su exceso de energía
y se relajan a su estado fundamental. Dos de los mecanismos de relajación más importantes
son la relajación o desactivación no radiante (que incluye relajación vibracional y conversión
interna) y la relajación fluorescente (fluorescencia).

La fluorescencia por su parte, es un proceso radiactivo de relajación que en la figura

se ilustra con flechas sólidas. Se puede observar que las bandas de emisión son producidas
cuando las moléculas excitadas electrónicamente se relajan a cualquiera de los estados
vibracionales del estado electrónico fundamental. Esto ocurre en cuestión de segundos y
pasa directamente del estado excitado al estado basal, por lo cual la energía lumínica dura
muy poco y es necesario alumbrarla para que permanezca.

En cuestión del tiempo, hay un lapso entre la absorción o excitación y la emisión de

luz por la molécula. Si el lapso entre uno y otro proceso es de más 10^-4 segundos al
fenómeno se le llama fosforescencia, en tanto que, si el lapso es de menos de 10^-4 segundos
se le llama fluorescencia. Así, la diferencia entre la fluorescencia y la fosforescencia es la
capacidad de almacenar la energía. La fluorescencia absorbe la energía excitación e
inmediatamente emite la radiación luminosa. La fosforescencia, comienza igual, absorbiendo
energía de excitación, pero la almacena, retardando la emisión, siendo capaz de emitir esa
radiación luminosa poco a poco durante minutos u horas después de haber cesado la fuente
de radiación excitadora inicial

Ley de Stokes
En el microscopio de fluorescencia vemos la muestra por
reflexión de la luz. En este caso la luz se transmite desde una lámpara
de vapor de mercurio mediante el sistema colector de luz hasta el
objetivo de aumento que ayuda a su vez a concentrar la luz sobre la
muestra y ésta se refleja nuevamente con una longitud de onda mayor,
pero de menor energía.

Figura 3. Ley de Stokes en la Fluorescencia

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Las bandas de fluorescencia molecular por lo regular se observan a longitudes de

onda más largas, y en consecuencia a energías menores que la banda de radiación. Por lo
tanto, el material que absorbe radiación de una fuente específica lo hace muy rápidamente y
emite luz cuya energía es menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación que ha
absorbido, lo que provoca que el color sea diferente. Este desplazamiento hacia longitudes
de onda mayores se llama desplazamiento de Stokes.

Cuando iluminamos un objeto con luz blanca el color con el que lo vemos corresponde
al color que más refleja: un objeto de color verde absorbe todas las longitudes de onda y
refleja la verde. Un objeto de color negro absorbe todas las longitudes de onda y uno de color
blanco las refleja todas.

Funcionamiento

El funcionamiento del microscopio de fluorescencia comienza con el etiquetado de la

muestra de interés con una sustancia llamada fluoróforo (sustancia fluorescente), para que
posteriormente se ilumine por medio de un lente con luz de alta energía, después la luz será
absorbida por el fluoróforo y provocará la emisión de luz con baja energía y una larga longitud
de onda, están diseñados para esa longitud de onda en específico, posibilitando observar
todo lo que es fluorescente.

Una de las funciones principales del microscopio de fluorescencia es que permite que
la luz excitada irradie el espécimen, para así posteriormente separar la luz más débil que
emite la imagen.

Figura 4. Funcionamiento del microscopio de fluorescencia

El microscopio cuenta con un filtro que solo deja pasar la radiación con una longitud
de onda que sea semejante o la misma que la del material fluorescente, luego la radiación
choca con los átomos en el espécimen y la luz(electrones) es excitada a un nivel de energía
mayor, posteriormente los electrones se relajan y comienzan a emitir luz, de este modo ya
son visibles, después de esto se separa de la excitación más brillante con un segundo filtro
la fluorescencia emitida. Esto funciona gracias a que la luz emitida es de una energía menor
y con una longitud de onda mayor que la utilizada para la iluminación.

Características

El microscopio de fluorescencia es básicamente un microscopio óptico, pero

modificado estructuralmente ya que posee elementos como:
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● Fuente de luz: La luz que se emplea en este microscopio es de ciertos tipos

específicos para lograr la correcta absorción y posterior excitación de electrones, se
pueden utilizar lámpara de vapor de mercurio, LED y lámparas de arcón de xenón
● Fluorocromos: Son compuestos químicos fluorescentes típicamente algunos grupos
aromáticos combinados a moléculas planas o cíclicas que tienen la capacidad de
emitir luz tras la excitación por luz.
● Filtro de excitación: Es un filtro de banda que permite el paso de las longitudes de
onda específicas que son absorbidas por el fluorocromo y los electrones.
● Espejo dicroico: Funciona como segundo filtro un poco más específico, se usa para
pasar luz de forma selectiva en una precisa gama de colores.
● Filtro de emisiones: Funciona como tercer filtro de banda que solo permite el paso
de las longitudes específicas emitidas por el tinte fluorescente que bloquea la luz de
excitación

Figura 5. Partes del microscopio de fluorescencia

Tipos de fluorescencia
● Fluorescencia primaria (fluoróforos intrínsecos): Es la que se da
porque existe una configuración inherente a la estructura molecular, pues
es una propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz
fluorescente cuando son excitados con una determinada longitud de
onda. Ejemplo: clorofila, GFP (proteína verde fluorescente), aceite de
inmersión
● Fluorescencia secundaria (fluoróforos intrínsecos): Ocurre cuando
una molécula específica o un grupo capaz de fluorescer, se introduce en
la estructura de la muestra. Se genera al teñir una sustancia con una
reacción inmunoquímica y excitarla con una determinada longitud de
onda. Ejemplo: fluorocromo, sondas catiónicas planares como BrEt o
DAPI que se agregan a los ácidos nucleicos.

La fluorescencia secundaria se utiliza en el procedimiento para la mayoría de las

aplicaciones biológicas de la microscopía de fluorescencia. Los fluoróforos extrínsecos
pueden ser, a través de vectores de expresión, introducidos en bacterias, células u
organismos para dirigir la expresión tanto de las proteínas fluorescentes solas como
fusionadas a otra proteína de interés en el contexto del proceso biológico en estudio.

Figura 6. Fluorescencia secundaria aplicada a especies biológicas

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Factores que afectan la fluorescencia

1. Photobleaching: Es la disminución de la intensidad de emisión de la muestra debido
a la descomposición irreversible de la fluorescencia de las moléculas. Este fenómeno
está directamente relacionado con la intensidad de la excitación y con el tiempo
durante el cual estamos excitando la muestra.
2. Quenching: Disminución de la intensidad de la emisión debida a condiciones de
temperatura o presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales. También puede
ser debida a interacciones entre moléculas de fluorocromo, por lo que aumentar la
concentración de este no siempre supone un aumento de fluorescencia. Se debe
trabajar con agentes secuestradores de oxígeno.

Aplicaciones

Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en

biología y medicina:

● Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación

(membrana plasmática, núcleo, vacuolas, retículo endoplásmico, etc.)
● Estudio de células normales y patológicas.
● Estudios inmunológicos.
● Mineralogía
● Estudiar procesos celulares: división celular, muerte celular, cambios en el potencial
de membrana, endocitosis y exocitosis
● Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc
● Diferenciar partículas muy pequeñas que por contraste de fases no se resolverán
● Estudiar la interacción entre moléculas en vivo

Figura 7. Aplicaciones de la microscopía de fluorescencia

Conclusiones
Al dar por terminada esta investigación, logramos conocer y analizar el concepto de
microscopio de fluorescencia, así como su funcionamiento, un poco de su historia, las leyes
que lo rigen y sus características. Se puede apreciar las aportaciones que se han hecho con
este instrumento óptico a través de la historia, de igual manera, se logra comprender la
importancia se tiene en las diferentes áreas de investigación, puesto que con éste tipo de
equipo se ha podido llegar a rincones inimaginable; los cuales son poder identificar moléculas
en células y tejidos, mejorar el estudio de células patológicas, estudiar la interacción entre las
moléculas, etc. Siendo esto un gran avance en los campos de la biología y la medicina.
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Fuentes de información
● MicroPlanet. (09 de septiembre de 2016). ¿Qué es un microscopio de fluorescencia?. Blog
BioIndicacion. https://www.aguasresiduales.info/revista/blog/que-es-un-microscopio-de-
fluorescencia#:~:text=La%20ley%20de%20Stokes%20y%20los%20filtros%20de%20fluoresc
encia&text=Es%20la%20ley%20de%20f%C3%ADsica,onda%20y%20refleja%20la%20verde.
● Salido, F. (2004). Microscopía de fluorescencia. UNAM. [Archivo PDF].
http://revistas.unam.mx/index.php/rfm/article/view/73245/64624
● Medrano, T. (2014). Fluorescencia Molecular. IPN. [Archivo PDF].
http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/22287/Capitulo2.pdf
● UGR. (2018). ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR. [Archivo PDF].
https://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111d-
archivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF
● Breaking Vlad. (30 de marzo de 2016). FLUORESCENCIA VS FOSFORESCENCIA | Química
Básica. [Vídeo de YouTube]. https://www.youtube.com/watch?v=nAw0PnareLk
● Cuaran, D. (10 de noviembre de 2020). Espectroscopía UV/VIS (Ultravioleta/Visible). [Video
de YouTube]. https://www.youtube.com/watch?v=4l6v4aJr3ZE
● Pietrasanta, L. & von Bilderling, C. (2011). Microscopía de Fluorescencia. TBM. [Archivo PDF].
http://users.df.uba.ar/catalina/TBM/TBM_labo3.pdf
● Sigaut, L. (2015). Microscopía óptica y de fluorescencia. [Archivo PDF].
http://materias.df.uba.ar/f2bygaa2015c1/files/2012/07/GUIA-7_MICROSCOPIA-y-
FLUORESCENCIA_1C2015.pdf
● Ramiro, Y. (15 de octubre de 2015). Principios y aplicaciones de la microscopía de excitación
de dos fotones. UNAM. [Archivo PDF].
https://www.cio.mx/talleres/tmcmf/archivos/YRC_Multifotonico.pdf
● Monteleone, M. (2017). Fluorescencia. UNAM. [Archivo PDF].
http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/BioCel/150463
4347.pdf
● Monteagudo, J. L. (2018). CONCEPTOS DE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
APLICADOS A LA MICROSCOPIA CONFOCAL. Leica Microsystems. [Archivo PDF].
https://codoli.com/wp-content/uploads/secciones/pericia/Conceptos_de_Fluorescencia-
_El_Espectro.pdf
● Cardoza, Y. F. (2005). Reseña de" LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y SU
APLICACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO DE BACTERIAS FITOPATÓGENAS".[Archivo PDF].
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● Residuales, B. A. (2020, 26 febrero). ¿Qué es un microscopio de
fluorescencia?BioindicaciónAguasResiduales.[Sitoweb]
https://www.bioindicacion.com/blog/que-es-microscopio-fluorescencia/
● Brajovic, F. (2021, 13 enero). Así funciona un microscopio de fluorescencia.Cromtek.[sitio web]
https://www.cromtek.cl/2021/01/12/asi-funciona-un-microscopio-de-
fluorescencia/#:%7E:text=El%20microscopio%20de%20fluorescencia%20funciona,una%20lu
z%20de%20energ%C3%ADa%20alta.&text=Cuando%20se%20relajan%20a%20un%20nivel
%20menor%2C%20%C3%A9stos%20emiten%20luz
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Glosario en términos

● Fluorescencia: Propiedad que tienen algunas sustancias de reflejar luz con mayor
longitud de onda que la recibida, cuando están expuestas a ciertos rayos del espectro.
● Fluoróforo: Una molécula o parte de una molécula que emite fluorescencia después
de ser excitada con luz.
● Microscopio: Instrumento óptico para ampliar la imagen de objetos o seres, o de
detalles de estos, tan pequeños que no se pueden ver a simple vista; consta de un
sistema de lentes de gran aumento.
● Espejo dicroico: Filtro diseñado para reflejar una porción determinada del espectro
visible, mientras que deja pasar el resto.
● Fuente de luz: Todo aquello con la capacidad de iluminar y emitir luz a su entorno.
● Energía: Capacidad que tiene la materia de producir trabajo en forma de movimiento,
luz, calor, etc.
● Longitud de onda: Distancia entre dos puntos correspondientes a una misma fase de
dos ondas consecutivas.
● Átomo: Unidad mínima de una sustancia que compone toda la materia común u
ordinaria.
● Fotoblanqueo: Cambio inducido mediante luz en el grupo químico responsable del
color en una molécula.
● Temple: Punto de dureza o elasticidad que se da a un metal, cristal, etc.
● Molécula: Agrupación de átomos que constituyen la porción más pequeña de una
sustancia pura.
● Emisión: Desprendimiento de partículas de una superficie que puede producirse de
forma espontánea o por estimulación con fuentes energéticas externas.
● Absorción: Retención de una sustancia por las moléculas que posee otra en estado
líquido o gaseoso.
● Electrones: Partícula que se encuentra alrededor del núcleo del átomo y que tiene
carga negativa.
● Espécimen: Muestra, modelo o ejemplar que tiene las características que se
consideran representativas de la especie a la que pertenece.
● Filtro: Objeto que sirve para separar las partes sólidas de un líquido.
● Luz: Forma de energía que ilumina las cosas, las hace visibles y se propaga mediante
partículas llamadas fotones.
● Fotones: Partícula mínima de energía luminosa o de otra energía electromagnética
que se produce.
● Radiación: Emisión de energía o partículas que producen algunos cuerpos y se
propaga a través del espacio.
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Anexos
Se realizaron llamadas telefónicas para la organización.

Se creó un archivo en drive para trabajar en vivo de manera online y simultánea.

El docente creó salas personalizadas en Zoom