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    El Manual Transformacion

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    Gabriel Reyes
    Este documento describe un experimento para transformar la bacteria E. coli con el plásmido pMAD. El plásmido contiene un gen de resistencia a un antibiótico. El procedimiento involucra mezclar E. coli con el plásmido, someterlos a un choque térmico, y luego cultivar las bacterias en medios con y sin antibiótico para determinar si ocurrió la transformación.

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    Gabriel Reyes
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    Este documento describe un experimento para transformar la bacteria E. coli con el plásmido pMAD. El plásmido contiene un gen de resistencia a un antibiótico. El procedimiento involucra mezclar E. coli con el plásmido, someterlos a un choque térmico, y luego cultivar las bacterias en medios con y sin antibiótico para determinar si ocurrió la transformación.

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    El manual Transformacion

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    Este documento describe un experimento para transformar la bacteria E. coli con el plásmido pMAD. El plásmido contiene un gen de resistencia a un antibiótico. El procedimiento involucra mezclar E. coli con el plásmido, someterlos a un choque térmico, y luego cultivar las bacterias en medios con y sin antibiótico para determinar si ocurrió la transformación.

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    Gabriel Reyes
    Este documento describe un experimento para transformar la bacteria E. coli con el plásmido pMAD. El plásmido contiene un gen de resistencia a un antibiótico. El procedimiento involucra mezclar E. coli con el plásmido, someterlos a un choque térmico, y luego cultivar las bacterias en medios con y sin antibiótico para determinar si ocurrió la transformación.

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    de 7

    TRANSFORMACIÓN

    DE E. COLI CON EL
    PLÁSMIDO pMAD

    OBJETIVO Entender que el DNA contiene información genética y que el cambio de genotipo
    tiene como resultado un cambio en el fenotipo. Además se ejemplifican procesos
    biotecnológicos mediante los cuales se manipula el genoma (material genético) de
    un organismo.
    ACTIVIDAD Se transformará E. coli con el plásmido pMAD que contiene un gen de resistencia a un
    Antibiótico-

    INTRODUCCIÓN En esta práctica vas a hacer un procedimiento llamado transformación genética;


    lo que esto quiere decir literalmente es “cambio causado por genes”. La idea es
    introducir en la bacteria un gen, que se comporte como un gen más de ésta y que la
    proteína codificada por el gen se “exprese” ahora en la bacteria. Este procedimiento
    se utiliza en muchas áreas de la ciencia y la biotecnología.
    El plasmido lo vamos a introducir en E. coli (es más fácil decirle así que Escherichia coli).

    ¿Podrías hacer que un ratón emita luz


    fl uorescente si le introduces un gen?
    Considera lo siguiente: si quieres transformar
    genéticamente todas las células de un organismo,
    ¿qué es más sencillo, transformar un organismo
    unicelular como una bacteria,
    o un organismo multicelular?
    El plásmido pGLO Para que entiendas para qué pGLO tiene el gen araC, debes entender cómo ocurre la
    regulación de los genes que tienen que ver con la utilización del azúcar
    arabinosa en E. coli. El azúcar arabinosa es una fuente de energía y de carbono.
    E. coli produce tres enzimas para digerir la arabinosa. Los genes que codifican a
    estas tres enzimas no se expresan si no hay arabinosa, pero sí se expresan si sí
    está presente en el medio. Por cierto que estos tres genes están juntos y tienen
    un solo promotor, es decir, que forman un operón. Hay otro gen sólo para
    regular la función de la polimerasa y que impide la síntesis de RNA cuando no
    hay arabinosa; esta es la proteína codificada por araC. Si hay arabinosa, ésta se
    “pega” a la proteína AraC y se la quita de encima a la polimerasa.

    8
    Esta figura es
    AraC, que sólo permite la transcripción de GFP cuando se une al azúcar
    arabinosa.

    El proceso de transformación se hace en tres pasos: Transformación

    ➜ En el primero el pMAD se mezcla con una suspensión fría de


    E. coli en cloruro de calcio;
    ➜ En el segundo se pone esta mezcla por dos minutos a 42°C (esto se
    conoce como choque térmico);
    ➜ En el tercero se alimenta a las bacterias y se les da un poco de tiempo para
    que se recuperen y empiecen a expresar la información de “su nuevo DNA”.

    

    MATERIALES

    -Cajas de Petri con medio LB


    -Cajas de Petri con medio -LB/antibiótico carbenicilina
    -Medio nutritivo LB líquido
    -Tubos eppendorf estériles
    -Cepa de E.coli
    -Solución CaCl2
    -Plasmido
    -Perlitas de vidrio estériles
    - Dos jeringas estériles

    . CALENDARIO

    Día 1. Procedimiento de transformación

    Día 2. Conteo de colonias bacterianas y análisis de resultados


    PROTOCOLO Procedimiento de transformación

    Día 1 Toma dos tubos Eppendorf, con la solución de transformación (E.coli) , el


    +pMAD y en el otro –pMAD.
    Añade 50 μL de CaCl2 he incuba tus tubos por 10 min en el hielo (bien
    cerrados y bien sumergidos).
    Añade, UNICAMENTE AL TUBO QUE DICE + pMAD, 50 μL de la solución
    que contiene al plásmido. Incuba tus tubos por 10 min en el hielo (bien
    cerrados y bien sumergidos).
    Aprovecha estos diez minutos para marcar tus cajas de Petri (ojo, se marcan
    del lado del medio de cultivo, no de la tapa):

    Caja de Petri con: MARCAR:


    LB/antibiótico carbenicilina + pMAD
    LB/antibiótico carbenicilina - pMAD
    LB + pMAD
    LB - pMAD

    Choque térmico. Coloca los tubos Eppendorf en agua caliente aproximadamente a


    42°C por exactamente 60 s y transfiérelos inmediatamente a hielo.

    Añade a cada uno 100 μl de medio LB líquido. Da unos golpecitos al tubo


    para mezclar. Incuba los tubos en tu mano por 15 min a temperatura
    ambiente.
    Pon 100 μl de las mezclas de transformación dentro de las cajas de Petri con
    el medio apropiado. Asegúrate de usar jeringas diferentes para +pMAD y
    –pMAD.
    Reparte homogéneamente los 100 μL de mezcla de transformación sobre el medio
    utilizando de cuatro a cinco perlitas de vidrio..
    Apila tus cajas y usa cinta para “pegarlas” todas juntas.. Incúbalas por 48
    horas como se muestra en la figura, con la tapa para abajo.

    Predicciones sobre este experimento

    ¿En qué caja encontrarás mayor número de colonias bacterianas?

    ¿En qué caja(s) no encontrarás colonias bacterias transformadas?

    ¿En qué caja encontrarás más colonias bacterias transformadas, LB/Cb


    oLB?

    ¿Qué cajas debes comparar para saber si hubo transformación genética?


    Conteo de colonias bacterianas y análisis de resultados Día 2
    No.
    Tratamientos experimentales
    colonias

    LB/antibiótico carbenicilina + pMAD

    LB/antibiótico carbenicilina/ - pMAD

    LB + pMAD

    LB - pMAD

    Observación de fluorescenci
    ¿Qué evidencia de cómo el medio ambiente puede infl uir en la expresión
    de los genes puedes extraer de los resultados de este experimento?

    ¿Puedes siempre deducir o conocer el genotipo de un organismo a


    partir de su fenotipo?

    ¿Qué ventaja tendría para un organismo poder “prender” o “apagar”


    algunos de sus genes?

    PARA DESECHAR LOS MATERIALES AGREGA UN


    CHORRITO DE CLORO DILUIDO, ESPERA 5
    MINUTOS Y LOS PUDES TIRAR A LA BASURA. ES
    MUY IMPORTANTE QUE REALICES ESTE PASO
    TANTO PARA TUBOS COMO PARA SOLUCIONES.

    LIMPIA TU AREA DE TRABAJO ANTES Y DESPUES


    CON ALCHOHOL AL 70%.

    LAVA MUY BIEN TUS MANOS ANTES Y DESPUES


    DE USAR LOS KITS.

    NO INGIERAS NINGUNO DE LOS REACTIVOS O


    MEDIOS.

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