Practica Transformacion Bacteriana 2022

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFÍA
MOLECULAR BIOLOGY FOR ENGINEERS

2022-II
Práctica 3: TRANSFORMACION BACTERIANA
INTRODUCCION
La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora y expresa genes

contenidos en un fragmento de DNA. Por lo general, esta información adquirida confiere
al organismo una nueva característica fenotípica, la que puede identificarse después de
ocurrida la transformación.
Esta técnica se usa en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura, genes que
confieren características como resistencia a frío, a pestes, o a herbicidas han sido
introducidos en plantas. En medicina, enfermedades causadas por genes defectuosos
están comenzando a ser tratadas mediante terapia génica, aproximación que consiste
en introducir una copia de un gen “terapéutico” dentro de las células del paciente.
Las bacterias también pueden ser transformadas al introducirse en ellas fragmentos de

DNA con distintos propósitos. Una primera utilidad es la de crear “bibliotecas” en las que
se encuentren representados los distintos fragmentos que componen el genoma de un
organismo (biblioteca genómica), o los genes expresados en dicho organismo
(biblioteca de cDNA). Por otro lado, algunos genes del DNA humano, animal o vegetal
pueden introducirse en bacterias que sirven de bioreactores para la producción de
proteínas de utilidad para la industria y la salud. Por ejemplo, el gen humano que
codifica la insulina puede introducirse en una bacteria y, bajo condiciones apropiadas,
hacer que dicha bacteria produzca insulina humana. Esta proteína podría usarse para
el tratamiento de pacientes con diabetes. Sin embargo, cuando se expresa un gen
eucariote en una bacteria debe tenerse en cuenta las diferencias entre sus sistemas de
transcripción, traducción y procesamiento post-traduccional.
Plásmido pGLO
El plásmido pGLO de Bio-Rad contiene el gen que codifica la proteína verde

fluorescente (GFP), así como un gen cuya expresión confiere resistencia al antibiótico
ampicilina. A una concentración de 100 g/mL, este antibiótico resulta mortal para
muchas bacterias, entre ellas la Escherichia coli. pGLO también contiene un sistema
de regulación genética especial que puede usarse para controlar la expresión de la GFP
en bacterias que han incorporado el plásmido. El gen puede activarse en las células
transformadas al añadir al medio el azúcar arabinosa. La selección de transformantes
se obtiene al hacer crecer las bacterias en placas de agar que contienen medio nutritivo
más amplicilina. Bajo luz ultravioleta, las células transformadas se verán blancas en
placas que no contengan arabinosa, y verde fluorescente en placas con arabinosa en el
medio.
1
Transformación Bacteriana
Plasmido pGLO
2
OBJETIVOS
Llevar a cabo una transformación bacteriana por introducción de un plásmido que

contiene un gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) en E. coli.
MATERIALES Y REACTIVOS
Cepa de E. coli HB 101 K-12

Plásmido pGLO
Solución de transformación (50 mM CaCl2, pH 6.1)
Puntas, tubos de microcentrífuga
Placas LB agar
Placas con medio LB amp (100ug/ml)
Pacas con medio LB amp/arabinosa 0.2%
Baño maría 42 oC.
Incubador 37oC
Mechero
Asas de siembra
Micropipetas
PROCEDIMIENTO
1. Marque un tubo cerrado con “+ DNA” y otro con “- DNA” y el número de su grupo.
Coloque los tubos en el soporte de espuma.
2. Abra los tubos y transfiera 250 L de la solución de transformación (50 mM

CaCl2, pH 6.1) haciendo uso de una micropipeta y de las puntas estériles.
3. Coloque los tubos en hielo.
3
4. Con una punta estéril, recoja una colonia bacteriana de la placa petri madre.
Sumerja la punta hasta el fondo del tubo marcado “+ DNA” y muévala hasta que
la colonia se disperse completamente en la solución de transformación (es
importante que no se vean grumos flotando). Ponga el tubo en el hielo
nuevamente. Repita el procedimiento para el tubo marcado “- DNA” utilizando un
asa estéril nueva.
5. Mediante el uso de una micropipeta, tome 10 L de la solución del plásmido

(pGLO Concentración de DNA plasmídico = 0.010 g/L), introdúzcalos en el
tubo marcado “+ DNA” y mueva la punta para mezclar el plásmido con las
bacterias. Cierre el tubo y regréselo al hielo. No agregue pGLO al tubo marcado
“- DNA”. Ciérrelo y colóquelo en el hielo.
6. Mantenga los tubos en hielo por 30 minutos. Asegúrese que los tubos estén
completamente hundidos en el soporte de espuma de modo que sus bases estén
en contacto con el hielo.
4
7. Mientras transcurren los 30 minutos de incubación en hielo, marque 4 placas
petri por la parte inferior (no en la tapa) de la siguiente manera:
a) LB/Amp; + DNA
b) LB/Amp/Ara; + DNA
c) LB/Amp; - DNA
d) LB; - DNA
8. Siempre en el soporte de espuma, transfiera ambos tubos a un baño maría a

42oC por 50 segundos exactos. Asegúrese que los tubos estén totalmente
hundidos en el soporte de modo que sus bases estén en contacto con el agua
del baño. Una vez transcurridos los 50 segundos, coloque los tubos en hielo
nuevamente. Para obtener mejores resultados, el paso del hielo a los 42 oC y
viceversa deberá ser rápido. Mantenga los tubos en hielo por 2 minutos.
9. Saque el soporte con los tubos del hielo y colóquelo sobre la mesa. Utilizando
una micropipeta con puntas estériles, agregue 250 L de medio LB a cada tubo
y ciérrelos. Mantenga los tubos a temperatura ambiente por lo menos 10 minutos
(37oC 30-60 min, aumenta el número de transformantes).
10. Mezcle el contenido de los tubos y, utilizando una micropipeta con puntas
estériles, coloque 20L de LB con 80 L de la suspensión de transformación o
del control a las placas petri correspondientes.
5
11. Haciendo uso de una espátula de vidrio estéril para cada placa, extienda la
suspensión sobre la superficie del medio sólido de la manera más uniforme
posible.
12. Marque las placas con el número de su grupo, apílelas y colóquelas boca abajo
en una estufa a 37oC hasta el día siguiente.
6
CÁLCULO DE LA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
Para determinar la eficiencia obtenida en el proceso de transformación en cada placa,

utilice la fórmula siguiente:
Eficiencia = Número de colonias transformantes

g de DNA utilizado
En donde la cantidad (g) de DNA utilizado se calcula de la siguiente manera:
Cantidad de DNA utilizado por placa = Cantidad total de DNA para transformación (g) x Volumen colocado en placa
Volumen total en el tubo de transformación
CUESTIONARIO
1. Interprete los resultados obtenidos con las distintas placas utilizadas luego de
terminar la incubación a 37°C y calcule la eficiencia de transformación.
2. ¿Qué proteína es codificada por el gen araC y por qué es necesaria la presencia
de arabinosa en el medio para que se observe fluorescencia en las colonias
transformadas? Explique cómo funciona el operón arabinosa en E. coli.
3. ¿Cómo actúa la ampicilina en la bacteria y qué papel cumple el gen de
resistencia a este antibiótico en el sistema utilizado en la práctica?
4. Busque la secuencia de la proteína verde fluorescente (GFP) e indique de qué
organismo fue aislada, qué tamaño en pares de bases tiene el gen que la codifica
y cuántos aminoácidos tiene la proteína.
5. ¿Qué efecto tiene la luz ultravioleta en la proteína verde fluorescente (GFP)?
6. Si usted ha realizado una transformación en bacterias y obtiene 320 colonias
transformantes, calcule la eficiencia de la transformación si las condiciones
fueron las siguientes:
Solución de transformación (CaCl2) = 50 L
DNA plasmídico = 10 L
Concentración de DNA plasmídico = 0.10 g/L
Medio de cultivo LB = 1 mL
Volumen colocado en la placa = 80 L

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Llevar a cabo una transformación bacteriana por introducción de un plásmido que

Cepa de E. coli HB 101 K-12

2. Abra los tubos y transfiera 250 L de la solución de transformación (50 mM

3. Coloque los tubos en hielo.

5. Mediante el uso de una micropipeta, tome 10 L de la solución del plásmido

8. Siempre en el soporte de espuma, transfiera ambos tubos a un baño maría a

Para determinar la eficiencia obtenida en el proceso de transformación en cada placa,

Eficiencia = Número de colonias transformantes

En donde la cantidad (g) de DNA utilizado se calcula de la siguiente manera:

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