Semana 3 Práctica BQ Ii 2021 Terminado

SEMANA 3 P- Determinación de hemoglobina en sangre.
Determinación de bilirrubina directa e indirecta en suero

sanguíneo
DETERMINACION DE HEMOGLOBINA EN SANGRE.

Generalidades:
La hemoglobina, una proteína conjugada cumple funciones de suma importancia entre
las que tenemos:
1. Transporte de O2 desde los pulmones hasta los tejidos.
2. Transporte de CO2 desde los tejidos hacia los pulmones para su eliminación.
3. Actúa como un sistema buffer importante en el mantenimiento del equilibrado ácido básico
del organismo.
Normalmente sus cifras oscilan entre 11 a 16 %. Las cifras más bajas corresponden a las
mujeres, mientras que las altas corresponden a los hombres. Las variaciones patológicas
pueden ser en sentido de la disminución, constituyendo los diversos tipos de anemia y en el
sentido del aumento lo cual constituye las denominadas policitemias de diferentes orígenes.
Existen diferentes métodos para su determinación:
1. Aquellos que se basan en la transformación de la hemoglobina en hematina alcalina por
acción del carbonato de sodio (método Sherd Sanford).
2. El método de la transformación de la hemoglobina en cianometahemoglobina, por acción
del cianuro y ferricianuro de potasio en medio alcalino.
3. Métodos que se basan en la transformación de la hemoglobina en hematina ácida. Por
acción del HCl N/10 (método se Shali).
En nuestra práctica se va a utilizar el método modificado de Sherd Sanford y Szizeli, que
se basa en la transformación de la hemoglobina en oxihemoglobina, por acción de una solución
de hidróxido de amonio al 0.4 % y el método de Drabkin (CianometaHb).
La presente práctica tiene como finalidad determinar la Hb en sangre con diferentes
métodos e interpretar los resultados obtenidos.
II. Reactivos y Equipos
• Tensioactivo/CNX: Ampollas autorrompibles de sol. tensioactivo/CNX. Este reactivo
contiene cianuro (veneno), entonces tener cuidado con el manipuleo.
• Buffer/Ferricianuro: comprimidos de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos.
• HemoWiener Standard es una solución de hemoglobina que se procesa en las mismas
condiciones que la muestra. Se emplea para estandarizar los métodos colorimétricos
basados en la formación de Cianuro de Hemiglobina Hemiglobinazida (antes
Azidametahemoglobina). En refrigerador ( 2-10C ) es estable durante 2 años.
• HemogloWiener Reactivos: En un matraz de 1 litro verter el contenido de una ampolla de
Tensioactivo/CNX evitando desperdicios o derrames. Agregar 700-800 ml. de agua
destilada y un comprimido de Buffer/ Ferricianuro. Mezclar por rotación hasta disolución
completa y llevar a volumen con agua destilada. Trasvasar a un frasco color caramelo, rotular
y fechar.
• Espectrofotómetro RA-50, spectronic 20, Refrigeradora.
III.Procedimiento:
Determinación de Hb como Cianuro de Hemiglobina en sangre.
Fundamento Del Método La hemoglobina ( Hb ) presente en la muestra, en presencia de
ferricianuro, se oxida a Hemiglobina (Hi, también llamada metahemoglobina ) que, a su vez,
se combina con iones cianuro a pH 7,2 convirtiéndose en Cianuro de Hemiglobina ( HiCN o
cianmetahemoglobina ). Todos los hemocromógenos, a excepción de las sulfohemoglobina,
reaccionan completamente en 3 minutos y la lectura a 540 nm.
En tres tubos marcados S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
COMPONENTES/TUBOS B S P
Hemoglowiener Rvo 5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml
Sangre (medir con micropipeta) --- --- 0,02 ml
Estándar de Hemoglobina --- 0,02 ml
• Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta, enjuagando tres veces en el
propio reactivo antes de agregar cada nuestra.
• Mezclar y luego de 3 minutos leer en Espectrofotómetro con filtro verde (520-550), llevando
el aparato a cero con Reactivo.
• El color de reacción es estable al menos 24 hs.
CALCULO: Hemoglobina g/l = D x factor
Factor = Concentración del Standard / Lectura del Estándar g/l
VALORES DE REFERENCIA Existen diferencias entre:
Varones: 13,0 - 16,0 g/dl Mujeres : 11,0 - 15,0 g/dl
https://www.youtube.com/watch?v=bfDSdn93HhM Determinación hemoglobina
espectrofotómetro 1
IV. RESULTADOS
Lectura absorvancia: Blanco = 0

Desconocido= 0.402
Factor = 38
Hemoglobina g/L = 0.402 x 38 = 15.276g/L
St Mstra. Blanco
REFERENCIA BILBIOGRÁFICA
chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/viewer.html?pdfurl=http%3ª%2F%2
Fwww.untumbes.edu.pe%2Fvcs%2Fbiblioteca%2Fdocument%2Fvarioslibros%2F0831.%2520H
arper.%2520Bioqu%25C3%25ADmica%2520ilustrada.PDF&clen=39391559&chunk=true
chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/viewer.html?pdfurl=https%3A%2F%2F
www.3ciencias.com%2Fwp-content%2Fuploads%2F2018%2F10%2FLIBRO-BIOQUÍMICA.pdf&c
len=7156863&chunk=true
Cuestionario
Responder:
1. Indicar y explicar si el método empleado es cualitativo y/o cuantitativo.

2. Cuantificar valores de hemoglobina según guía de práctica
3. Compara los valores obtenidos de la guía con los que se encuentran en el enlace y
explique.
4. Ejemplos de metaloprofirinas (3) explicar que funciones llevan a cabo
5. Explicar y esquematizar Uroporfirina y coproporfirina simétrica y asimétrica
6. Explica y esquematizar los componentes de la hemoglobina
7. Compuestos que participan en síntesis del HEM: Enzimas y cofactores
8. Síntesis de Hemoglobina y elaborar esquema
9. Mecanismo de regulación
10. Condiciones fisiológica y patológicas que varían los niveles de Hemoglobina
PRACTICA # 4.2
DETERMINACION DE PIGMENTOS BILIARES.
I. Generalidades:
La hemoglobina de eritrocitos envejecidos o dañados se convierte, por una serie compleja de
reacciones en el pigmento biliar bilirrubina. La vida del eritrocito es de 120 días y diariamente
se libera un total de 6 gramos aproximadamente.
La hemoglobina procedente de la desintegración de células envejecidas. Las células del
sistema retículo endotelial, en especial el bazo, hígado y médula ósea, primero fagocitan a los
eritrocitos y luego se convierten en bilirrubina la hemoglobina liberada. La bilirrubina es
transportada luego desde las funciones extrahepáticas como complejo de bilirrubina atraviesa
las microvellosidades sinusoides y pasa a la célula hepática. La proteína se separa del complejo
y la bilirrubina se convierte a una forma más soluble mediante reacciones de conjugación,
proceso que tiene lugar en el retículo endoplasmático liso, catalizado por la UDP-
glucuroniltransferasa.
Normalmente en la bilis de mamíferos se encuentra como diglucoronido y monoglucoronida de
bilirrubina, predominando el primero.
La conjugación con el ácido glucorónido es un pre-requisito para la eliminación de bilirrubina
en la bilis, en el intestino sufre la acción reductora de enzimas bacterianas, los productos de
reducción, colectivamente se designan como urobilinógenos, en el íleon terminal y en el colon
una parte de urobilinógeno, es reabsorbida y excretada por el hígado constituyendo un ciclo
enterohepático. Normalmente la mayor parte de este pigmento formado es oxidado a urobilina,
compuesto de color pardo anaranjado, las urobilinas son excretadas por las heces.
Normalmente no se excreta bilirrubina por la orina y las cantidades de urobilinógeno que se
elimina por orina es de alrededor de 0.4 mg. por 24 horas.
La presente práctica tiene como objetivos:
- Determinar los pigmentos biliares en sangre y en orina.
- Evaluar e interpretar los resultados.
II. Reactivos y Equipos:
- Alcohol metílico - Reactivo blanco Erlich - Reactivo de Erlich.
- Solución de benzoato de cafeína. - Nitrito de sodio.
- Reactivo sulfanílico. - Bilirrubina Standard.
- Bilirrubina standard : viales conteniendo cada uno 500 ug de bilirrubina
- Espectrofotómetro RA-50, spectronic 20, Refrigeradora.
III. Procedimiento:
Determinación de Bilirrubina Directa y Total según Trinder
Fundamento del método La Bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico
diazotado produciendo un pigmento de color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide
fotocolorimétricamente a 530 nm.
Si bien la Bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la
Bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que
posibilite su reacción. De forma tal, para que reaccione la Bilirrubina Total (conjugada y no
conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción.
En tres tubos marcados B (Blanco), D (Directa) y T (Total), colocar:
COMPONENTES/TUBOS B D T
Muestra (Suero) 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml
Agua 2.5ml 2.5ml ----
Desarrollador - - 2.5ml
Reactivo Sulfanílico 0.2 ml - -
Diazo reactivo --- 0.2 ml 0.2 ml
▪ Mezclar de inmediato en cada tubo por inversión.

▪ Luego de 5’, leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520
- 550 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada.
▪ Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la Bilirrubina directa
que debe leerse a los 5 minutos exactos, porque en este tiempo los valores se
corresponden con los de las determinaciones efectuadas por el método de partición entre
solventes. Si se lee antes, habrá subvaloarización de los resultados por reacción
incompleta. Si se lee después, habrá sobrevalorización de los mismos puesto que
comienza a reaccionar la bilirrubina libre.
3) Determinación de Bilirrubina Estándar
• Sacar el frasco de su estuche protector, quitar el precinto metállico y abrir, retirando
lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material.
• Agregar 5,00 ml de agua destilada exactamente medida.
• Tapar, colocar en el estuche y mezclar por inversión (varias veces ddurante un plazo
mínimo de 30 minutos) hasta disolución completa de la bilirrubina.
• Durante este proceso y luego del mismo es conveniente mantener el Standard
refrigerado.
• En seis tubos de fotocolorímetro marcados ( 1, B-1, 2, B-2, 3, B-3 ) colocar :
Diazo Rvo.Sul Concen

Tubo Estándar ul Desarrollador Agua reactivo fanilíco Tración
(mg/l)
1 50 2,6 ml -- 0,2 ml --- 25
B-1 50 -- 2,6 ml -- 0,2 ml ---
2 100 2,6 ml --- 0,2 ml --- 50
B-2 100 -- 2,6 ml -- 0,2 ml ---
3 200 2,5 ml --- 0,2 ml --- 100
B-3 200 -- 2,5 ml -- 0,2 ml ---
▪ Al agregar el Diarreactivo, mezclar inmediatamente cada tubo por inversión.
▪ A los cinco minutos, leer en espectrofotómetro a 530 nm o en el fotocolorímetro con filtro
verde (520-550 nm), llevando a cero el aparato con agua destilada.
Cálculo de los Resultados:
▪ Restar a las lecturas de los tubos 1, 2 y 3 los blancos correspondientes ( B-1 , B-2 y B-
3 respectivamente ) obteniendo así las "lecturas corregidas ".
▪ Con estos valores, construir un gráfico de la manera usual, colocando en el eje vertical
los valores de las lecturas corregidas y en el eje horizontal las concentraciones de
bilirrubina en mg / l.
▪ La reacción sigue la ley de Beer, lo que permite calcular un factor colorimétrico para cada
tubo.
Factor = Bilirrubina ( mg / l )
Lectura corregida
▪ Calcular el factor promedio
▪ Mezclar de inmediato en cada tubo por inversión.
▪ Luego de 5’, leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde
(520 - 550 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada. Las lecturas pueden
efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirru
Valores normales: Bilirrubina en suero o plasma.

Adultos: Directa (hasta 2 mg/dl.) y Total (hasta 10 mg/dl).
Recién nacidos : Nacidos a término Prematuros
Sangre de cordón 25 mg/dl.
Hasta la 24 hrs. 60 mg/dl. 80 mg/dl.
Hasta la 48 hrs. 75 mg/dl. 120 mg/dl.
Del 3º al 5º día. 120 mg/dl. 240 mg/dl.
3) Investigación de Pigmentos Biliares en Orina.
A. Investigación de Bilirrubina: B.Investigación de Urobilinógeno

Orina problema 4,0 ml Orina problema 4,0 ml
Sol. De lugol, en zona 0,5 ml Sol. de lugol, en zona 0,5 ml
La reacción positiva se manifiesta por la Mezclar la aparición de un color rojo cereza
aparición de una banda de color verde en indica la presencia de urobilinógeno.
la interfase.
https://www.youtube.com/watch?v=HduEpsU9tL8 Determinación de bilirrubina en

suero sanguíneo
IV. RESULTADOS
Lectura absorbancia: Blanco = 0

Factor= 198
Directa = 0.002
Total = 0.042
Directa mg/L = 0.002 x 198 = 0.396 mg/L
Total mg/ L = 0.042 x 198 = 8.316 mg/ L
Cuestionario
Responder a lo siguiente:
1. Indicar y explicar si el método empleado es cualitativo y/o cuantitativo.
2. Cuantificar valores de Bilirrubina según guía de práctica
3. Compara los valores obtenidos de la guía con los que se encuentran en el enlace y
explique.
4. Diferencia entre Bilirrubina directa e indirecta
5. Participación de la albúmina en metabolismo de bilirrubina
6. Síntesis de Hemina, biliverdina, estercobilina y urobilina
7. Factores que alteran metabolismo de bilirrubina
8. Explicar y esquematizar circulación entero hepática
9. Explicar con esquema síndome de Kernicterus

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SEMANA 3 P- Determinación de hemoglobina en sangre.

Determinación de bilirrubina directa e indirecta en suero

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA EN SANGRE.

Lectura absorvancia: Blanco = 0

1. Indicar y explicar si el método empleado es cualitativo y/o cuantitativo.

▪ Mezclar de inmediato en cada tubo por inversión.

Diazo Rvo.Sul Concen

Valores normales: Bilirrubina en suero o plasma.

3) Investigación de Pigmentos Biliares en Orina.

A. Investigación de Bilirrubina: B.Investigación de Urobilinógeno

https://www.youtube.com/watch?v=HduEpsU9tL8 Determinación de bilirrubina en

Lectura absorbancia: Blanco = 0

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