Métodos de aislamiento de la hemoglobina

El análisis de hemoglobina mide los niveles de hemoglobina en la sangre. Los

niveles anormales de hemoglobina podrían ser un signo de un trastorno de la
sangre. El análisis de hemoglobina se usa comúnmente para detectar anemia,
un nivel anormalmente bajo de glóbulos rojos en el cuerpo. Cuando una
persona tiene anemia, las células no reciben la cantidad de oxígeno que
necesitan. Un médico podría pedir este análisis si el paciente:
•Tiene síntomas de anemia como debilidad, mareos, palidez o manos y pies
fríos.
•Tiene antecedentes familiares de talasemia, anemia falciforme u otros
trastornos hereditarios de la sangre.
•Tiene una dieta baja en hierro y minerales.
•Tiene una infección a largo plazo.
•Ha perdido una cantidad excesiva de sangre por una herida o un
procedimiento quirúrgico.

¿Qué significan los resultados?

Los niveles de hemoglobina pueden estar fuera de los límites normales por
muchas razones.
Si los niveles de hemoglobina están bajos, esto podría ser signo de:
• Diferentes tipos de anemia
• Talasemia
• Deficiencia de hierro
• Enfermedad del hígado
• Cáncer y otras enfermedades

Si los niveles de hemoglobina están altos, esto podría ser signo de:

• Enfermedad pulmonar
• Enfermedad del corazón
• Policitemia vera, un trastorno en que el cuerpo produce demasiados
glóbulos rojos. Puede causar dolores de cabeza, cansancio y dificultad para
respirar.

Si cualquiera de los niveles es anormal, no significa necesariamente que tenga

un problema médico que requiera de un tratamiento. La dieta, el nivel de
actividad, los medicamentos, el ciclo menstrual de una mujer entre otros
pueden afectar los resultados.
 Métodos de medición de la hemoglobina
La hemoglobina puede ser medida por diferentes métodos:
‐ Fotométricos o colorimétricos.
‐ Gasométricos.
‐ Químicos.
‐ Densitométricos.
En este ensayo nos centraremos en el estudio de los métodos fotométricos
como medida de la hemoglobina. Los métodos fotométricos consisten en
convertir la hemoglobina en oxihemoglobina o en alguno de sus
compuestos. La medición se realiza comparando la muestra problema con
un patrón estándar. El método de comparación puede ser visual o
fotoeléctrico, el fotoeléctrico es el más exacto.
INDENTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA
Las distintas hemoglobinas tienen espectros de absorción características que
se determina en un espectofotómetro. La identificación de las diferentes formas
de la hemoglobina con la determinación de sus espectros de absorción puede
hacerse de una manera muy sencilla: se coloca en un tubo de ensayo
aproximadamente la mitad de una gota de sangre y se diluye 20ml de agua
bidestilada. Se examina la muestra en un espectrómetro empleando agua
como blanco y se lee la absorción a intervalos de 5 nm.

Método de cianuro de hemoglobina (HiCN)

El método de la HiCN fue propuesto en 1961 por Van Kampen y Ziljstra
como procedimiento para la estandarización de la hemoglobina.
Posteriormente ,en 1965, Cannan propuso el uso de una solución de
referencia para HiCN como un método exacto y preciso. Finalmente es en
1967 cuando el Comité Intenacional de Estandarización de Hematología
recomienda el método de la HiCN y se procede a la elaboración de un
patrón de HiCN de referencia.
El principio de este método consiste en convertir la hemoglobina en
HiCN mediante la adición de cianuro potásico y ferrocianuro. De esta forma se
consigue un compuesto estable que presenta un pico máximo de absorbancia a
540nm y el cual sigue la Ley de Lambert‐Beer. La absorbancia de la muestra
se compara con una solución de HiCN estandarizada, de concentración y
absorbancia conocida.
El ferrocianuro potásico oxida las hemoglobinas a hemiglobinas , y el cianuro
potásico proporciona los iones cianuro para formar hemiglobincianuro, que
tiene una absorción máxima amplia a una longitud de onda de 540 nanómetros.
La capacidad de absorción de la solución se mide en un fotómetro o
espectrofotómetro a 540 nm y se compara con la de una solución de HiCN
estándar.

Presenta una variedad de ventajas:

 Presenta la ventaja de ser cómodo y de ser una solución estándar
estable, fácilmente disponible.
 Ofrece una buena exactitud, ya que utiliza una solución estándar
internacional que está validada por el ICSH.
 A excepción de la sulfohemoglobina, el resto de las fracciones de
la hemoglobina pueden ser determinadas.

Desventajas:

 Por otro lado, las proteínas plasmáticas, el recuento de leucocitos,

los lípidos y la bilirrubina puede producir turbidez en la muestra y
alterar la medición por este método. Además, el reactivo Cianuro es
tóxico, y se ha considerado como un riesgo potencial. Por eso, se han
propuesto reactivos alternativos como la ácida zódica y el lauril sulfato
sódico que convierten la hemoglobina en azidahemoglobina y en sulfato
de hemoglobina. Estos presentan la principal ventaja de ser menos
tóxicos.
¿Cómo se lleva a cabo esta técnica?
Método: Se añaden 20 microlitos de sangre a 5 ml de disolvente, bien
mezclados y se mantienen a temperatura ambiente durante al menos 3
minutos. Se determina la capacidad de absorción, frente al blanco reactivo, en
el colorímetro fotoeléctrico a 540nm o con un filtro apropiado. Se abre entonces
un vial de HiCN estándar y se mide la capacidad de absorción, a temperatura
ambiente, en el mismo aparato de una manera similar. La muestra se debe
analizar a las pocas horas la dilución. El estándar se mantendrá en oscuridad
cuando no se utilice y se desechará al término del día. Suele ser conveniente
calibrar el fotómetro al utilizarse para hemoglobinometría preparando una curva
estándar o una tabla que relaciona la capacidad de absorción a la
concentración de Hb en g/dl. La capacidad de absorción del estándar HiCN
fresco se mide frente a un blanco reactivo. Se hacen las lecturas de la
capacidad de absorción del estándar HiCN fresco y de sus diluciones en el
reactivo (1 en 2, 1 en 3, 1 en 4) frente al blanco reactivo. Los valores de Hb en
g/dl se calculan para cada solución. Cuando las lecturas de capacidad de
absorción se llevan a un papel gráfico lineal como ordenadas frente a la
concentración de Hb en las abscisas, los puntos deben describir una línea recta
que pasa por el origen. A partir de esta curva estándar se puede preparar una
tabla que da las concentraciones de Hb para las lecturas de capacidad de
absorción.

Método de la Co-oximetría
La Co‐oximetría se basa en una técnica espectrofotométrica en la cual la
hemoglobina y sus fracciones presentan picos de absorbancia a longitudes de
onda específicos, y siguen la Ley de Lambert‐Beer. Cuando una muestra
sanguínea se envía a analizar a un Co‐oxímetro, la hemoglobina es
liberada del interior de los hematíes por agentes físicos o químicos integrados
en el aparato. La absorbancia de esa hemoglobina a distintas longitudes de
onda, y a partir de calcular los resultados obtenidos por medio de un software,
se obtiene el valor de la concentración de cada una de las fracciones
de la hemoglobina.

La hemoglobina total es calculada a través de la suma de los derivados.

Ventajas de esta técnica:
 Rapidez
 Fácil manejo
 Precisar un pequeño volumen de muestra
 Permitir el estudio de los gases en sangre, y no se verse afectada por la
presencia de leucocitosis o hiperbilirrubinemia.
 Desventajas:

 La turbidez producida por la hiperlipidemia parece tener una

repercusión significativa en el estudio de la Co‐oximetría.

Técnica:
El paciente debe realizar una inspiración profunda y mantener una
apnea de 9 segundos, después procederá a una espiración lenta,
prolongada y completa. Se esperar unos segundos hasta que el
indicador del cooxímetro se estabilice y marque el número exacto de
ppm de CO que el paciente tiene en el aire que espira, luego se pasa a
la obtención del porciento de carboxihemoglobina (% COHb).

Método de la oxihemoglobina (HbO2)

Ya no se utiliza ampliamente, pero todavía constituye un método satisfactorio
de la determinación de la hemoglobina como oxihemoglobina.
Desventajas:
 La principal desventaja reside en que no se dispone de un estándar
estable para la HbO2. Debido a la sencillez del método, muchas veces
se utiliza para comparar niveles de hemoglobina en los casos en los que
no se precisa la cantidad absoluta.
 El método de HbO2 no mide la carboxihemoglobina (HbCO), la
metahemoglobina (Hi) o la sulfohemoglobina (SHb), todas las cuales son
inactivas para el transporte de oxígeno.

Errores al método: el método de la oxihemoglobina mide la Hb y la HbO2,

pero no la Hi, HbCO o SHb. Por tanto, es el método que mejor determina la
hemoglobina fisiológicamente activa, lo que puede tener importancia en
algunos enfermos.
¿Cómo se lleva a cabo esta técnica?

Se hace una dilución 1:251 de sangre en NH4OH 0'007N. El agua

empleada para preparar la solución amónica debe destilarse en
columna, porque cantidades mínimas de cobre en el agua destilada o en
otros diluyentes utilizados en las determinaciones de HbO2 pueden
transformarla en metahemoglobina y reducir los valores.

Se agita bien para asegurar la mezcla y la oxigenación de la

hemoglobina. La solución se lee en un fotómetro en que se emplea un
filtro verde (540nm) y una solución 0'007N de hidróxido amónico como
blanco.
La prueba puede leerse transcurridos algunos segundos o, si está en
una cubeta tapada, en cualquier momento antes de pasar 3 días.
 La curva estándar puede trazarse por uno de los procedimientos que se
expondrán más adelante.

Métodos químicos (contenido en hierro): la hemoglobina puede medirse

por determinación de su contenido en hierro. En la sangre, el hierro no
hemoglobínico es insignificante en comparación con el hemoglobínico.
El hierro debe separarse primero de la hemoglobina, generalmente por
medio de un ácido o por incineración, y entonces es titulado con TiCl3 o
forma un complejo con un reactivo que desarrolle un color susceptible de
medirse fotométricamente. la determinación de la concentración de la
hemoglobina por medición del contenido en hierro es demasiado
complicada para el trabajo diario, pero se puede utilizar para verificar
otros métodos, y a partir de ella se pueden diseñar curvas de calibración
para los métodos de HbO2 y HiCN.

CUADRO COMPARATIVO

Método de cianuro Método de la Co- Método de la oxihemoglobina

de hemoglobina oximetría (HbO2)
-El método del HiCN -Se utiliza -Ya no se utiliza ampliamente,
se utiliza actualmente, se usa pero todavía constituye un
actualmente, un un Co‐oxímetro. método satisfactorio de la
recomendado por el determinación de la hemoglobina
International Comité -Ventajas: como oxihemoglobina.
for Standardizationin •Rápido
Hematology en 1978. •Fácil manejo -Ventajas:
•Precisa un pequeño  Todavía constituye
-Ventajas: volumen de muestra. un método
• Cómodo. •Permite el estudio satisfactorio la
•Ofrece una buena de los gases en determinación de la
exactitud. sangre. hemoglobina como
•A excepción de la oxihemoglobina.
sulfohemoglobina, el -Desventajas:
resto de las -Desventajas:
fracciones de la  La turbidez  La principal
hemoglobina pueden producida por desventaja reside
ser determinadas. la en que no se
hiperlipidemia, dispone de un
-Desventajas: sí que parece estándar estable
 Las proteínas tener una para la HbO2.
plasmáticas, repercusión Debido a la
el recuento significativa en sencillez del
de leucocitos, el estudio de la método, muchas
los lípidos y Co‐oximetría. veces se utiliza
la bilirrubina para comparar
puede niveles de
producir hemoglobina en los
 turbidez en la casos en los que no
muestra y se precisa la
alterar la cantidad absoluta.
medición por  El método de HbO2
este método. no mide la
Además, el carboxihemoglobina
reactivo (HbCO), la
Cianuro es metahemoglobina
tóxico (Hi) o la
sulfohemoglobina
(SHb).

Fuentes:
Laura J. Martin. (2018). Hemoglobina. de Medline Plus Enciclopedia.
Sitio web: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003645.htm
Virginia Cegarra San Martín. (2012). TESINA COMPARACIÓN DE TRES
MÉTODOS DE MEDICIÓN DE HEMOGLOBINA EN CIRUGÍA CARDIACA. de
Universidad Autónoma de Barcelona.
Sitio web: https://ddd.uab.cat/pub/trerecpro/2012/hdl_2072_203376/TR-
CegarraSanmartin.pdf
ROSARIO ALORS CORREDERAS. (2008). “DETERMINACION DE LA
HEMOGLOBINA EN EL LABORATORIO”. De Revista Digital Innovación y
Experiencias Educativas.
Sito web:
https://archivos.csif.es/archivos/andalucia/ensenanza/revistas/csicsif/revista/pdf
/Numero_3/Valoracion%20de%20la
%20hemoglobina_rosarioalorscorrederas.pdf