UNIVERSIDAD POPULAR AUTÓNOMA

DEL ESTADO DE PUEBLA

LABORATORIO DE APLICACIONES DE INGENIERÍA

GENÉTICA

Proyecto final

Profesor:
ANGEL DAVID RODRIGUEZ REYES - [email protected]

Alumnas:

Eriazmin Bustamante S. 74600896

Jessica Ivonne Sanchéz Árevalo 27370090
María del Rosario Zarate Alvarado 74600847
 I. Introducción

Proteína verde fluorescente

Su descubrimiento se remonta en 1962 en donde fue observada por primera vez en la medusa
Aequorea victoria. En 1992 se usó por primera vez en una investigación científica y en 2008
recibió un nobel de química al japonés quien la descubrió: Osamu Shimomura.
Gracias a este descubrimiento fue que los científicos ya tenían la capacidad de realizar un
“etiquetado” a otras proteínas, esto fue posible gracias al investigador Martin Chalfie quien
quería integrar ADN de sus gusanos C. elegans a la proteína GFP para poder observar sus
procesos biológicos, en donde fue todo un éxito y pudo hacer de este experimento un
descubrimiento tan revolucionario.
Está proteínas se pueden usar para ver y rastrear proteínas en células vivas, ya que cuando la
proteína se produce en una célula se le adhiere un marcador fluorescente. En donde con
ayuda de equipo de microscopía de fluorescencia se puede observar, fotografiar y hasta filmar
estas células o procesos celulares sin necesidad de interferir con ellos.
La proteína fluorescente azul BFP (del inglés, Blue Fluorescent Protein) fue la primera
variante creada y resultó de una mutación del aminoácido 66 Tyr por His (Y66H). Presenta
un pico de excitación a los 384 nm y de emisión a los 448 nm.

Fig 1. Tabla de código genético

 Fig 2. Diseño de Primer modificado con el cambio de Tyr a His (Y66H)

Transformación

La transformación es un método común en biología molecular con muchas aplicaciones,

incluida la clonación, la secuenciación de ADN y la construcción de bibliotecas de ADN.
Para realizar la transformación, debes utilizar células competentes.

La transformación implica la introducción de material genético externo, generalmente ADN,

en una célula, típicamente bacteriana. Este proceso no solo es crucial en el ámbito de la
microbiología, sino también como una técnica para almacenar y replicar secuencias de ADN
o plásmidos. En su mayoría, los plásmidos, incluso aquellos diseñados para células de
mamíferos, poseen un origen de replicación bacteriana y un gen de resistencia a antibióticos,
que actúa como marcador de selección. Se han realizado diversas modificaciones genéticas
para facilitar la transformación, creando cepas capaces de mantener el plásmido sin
alteraciones en su secuencia. Además, se han identificado tratamientos específicos que
mejoran la eficiencia de la transformación, volviendo a las bacterias más susceptibles a la
introducción de material genético mediante métodos químicos o eléctricos, generando lo que
comúnmente se conoce como "células competentes".

Mutagénesis

La mutagénesis es aquella modificación de material genético que resulta estable y

transmisible a las células hijas que surgen de la mitosis. Las lesiones generadas por estos
agentes mutagénicos pueden resultar en modificaciones de las características hereditarias o la
inactivación del ADN. Cuando el ADN afectado corresponde a células de la línea germinal
se relacionan con la aparición de enfermedades hereditarias, mientras que las mutaciones que
se dan en las células somáticas están relacionadas con enfermedades degenerativas y procesos
carcinogénicos.
La mutagénesis tiene como objetivo analizar las mutaciones inducidas por agentes físicos,
químicos y biológicos, analizar sus interacciones y mecanismos de acción.
Los mutágenos según lo establecido en 1983 por la comisión internación para la protección
contra mutágenos y carcinógenos son aquellos agentes que tienen afinidad para interactuar
con el ADN, es decir agentes que ocasionan daño al material genético y componentes
asociados en dosis sub tóxicas.
Existen dos tipos de mutagénesis principalmente, la mutagénesis aleatoria son mutaciones
puntuales introducidas en posiciones aleatorias en un gen de interés, típicamente a través de
PCR utilizando una polimerasa de ADN propensa a errores o con agentes mutagénicos y la
mutagénesis de sitio dirigido es un método de elección para la alteración de un gen o
secuencia de vectores en un lugar determinado, las mutaciones puntuales, inserciones o
deleciones se introducen con la incorporación primera que contienen la modificación deseada
con una ADN polimerasa en una reacción de amplificación.

II. Justificación

Transformación

Mutagénesis
Esta técnica es muy importante para biología molecular e ingeniería genética. En ella se
realizan mutaciones de ADN que se modifican deliberadamente para que de esta manera se
produzcan bibliotecas de genes mutantes, cepas bacterianas, proteínas u organismos
modificados genéticamente. Además de que se pueden mutar las diferentes partes que
constituyen un gen, como lo es sus reguladores por ejemplo, esto con el objetivo de poder
examinar de forma detallada un proceso o producto genético de interés.

III. Metodología

Transformación
Protocolo de transformación estándar

1. Transferir el número necesario de tubos del congelador a -70°C a hielo húmedo.

Incluya un tubo adicional para control de ADN, si lo desea
2. Deje que las células se descongelen durante 5 minutos. Toque los pasajes
repetidamente para obtener una suspensión uniforme.
● Para controlar: En un tubo, agregue 1 µL (10 ng) de ADN de
control de pUC19. Mezclar golpeando suavemente y colocando en
hielo.
● Se deben agregar de 1 ng a 50 ng de ADN de plásmido purificado
directamente a las células en los contenedores restantes. Mezclar
golpeando suavemente y colocando en hielo.
3. Refrigere las células durante 30 minutos.
4. 45 segundos después de transferir las células a una inmersión en agua a 37 °C
5. Transferir las células durante 2 minutos a frío.
6. Incorporar medio SOC en cada tubo. Transfiera las células a tubos de polipropileno
estériles y afloje las tapas para promover la aireación del cultivo.
7. Las células se incuban en una incubadora vibratoria (225-250 rpm) a 37°C durante
una hora.
 8. Extienda 10-100 μL de cada suspensión de células transformadas con un esparcidor
estéril en placas de agar LB que contengan un antibiótico de selección.
9. Incubar las placas durante la noche a 37°C
10. Elija la(s) colonia(s) y cultivo deseados.
11. Debe aislarse el ADN plasmídico de cada cultivo.
12. Cultivar los clones deseados
13. Utilizando enzimas de restricción, separe el ADN del plásmido mediante
electroforesis en gel.

Protocolo para la transformación utilizando células electrocompetentes

1. Transferir el número necesario de tubos del congelador a -70°C a hielo húmedo.

Si lo desea, incluya un vial adicional para el ADN de control.
2. Deje que las células se descongelen durante 5 minutos. Golpee suavemente los
tubos varias veces para lograr una suspensión uniforme.
3. Transfiera el medio SOC a tubos de cultivo individuales para cada reacción de
transformación y guárdelo a temperatura ambiente. (El volumen del medio SOC
depende del número de células añadidas en la fase posterior. El volumen final con
células competentes y medio SOC debe ser de mil microlitros. (L).
 4. Una cubeta y un tubo de microcentrífuga deben colocarse en frío para cada reacción
de transformación.
5. Transfiera las células competentes a recipientes de microcentrífuga que se hayan
enfriado. Utilice 40 μl de células de un vial de 80 μl y 50 μl de células de un vial de
100 l.
a. Para el control: un vial debe contener µ1 L de 1 a 5 diluciones de ADN de
control de pUC19.
b. Prepare una dilución de 1 a 5 veces de ADN o mezcla de ligadura en tampón
TE. Combinar en recipientes de microcentrífuga.
6. La mezcla de ADN y células se pipetea en una cubeta fría de 1 mm.
7. Trate las celdas ajustando el electroporador a una intensidad de campo de 25 kV/cm
durante 6 milisegundos.
8. SOC.
9. A 37°C, incubar las células en una incubadora vibratoria (225-250 rpm) durante una
hora.
10. Extienda 10-100 μL de cada suspensión de células transformadas con un esparcidor
estéril en placas de agar LB que contengan un antibiótico de selección.
11. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
12. Seleccione la colonia y el cultivo adecuados.
13. Aísle el ADN de los plásmidos en cada cultivo.
14. Separe el ADN plasmídico mediante electroforesis en gel después de la restricción.
enzima digestión.
15. Cultiva los clones deseados.

Mutagénesis
El método de mutagénesis dirigida “QuikChangeTM
se basa en la utilización de un plásmido molde, que en este caso fue el vector de expresión
pRT6, donde se introducen las mutaciones utilizando reacciones de amplificación por PCR y
oligonucleótidos mutagénicos
La reacción de mutagénesis se llevó a cabo en 50 μl de un tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,8,
que contenía KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, MgSO4 2 mM, Triton X-100
al 0,1%, seroalbúmina bovina libre de nucleasa (BSA) 0,1 mg/ml, 125 ng de cada uno de los
correspondientes oligonucleótidos mutagénicos, 5-50 ng de plásmido (pRT6), dNTPs a una
concentración de 500 μM cada uno y 2,5 U de la DNA polimerasa Pfu Turbo (Stratagene). La
amplificación se inició con una incubación de 30 s a 95ºC seguida de 16 ciclos de 30 s a
95ºC, 1 min a 55ºC y 10 min a 68ºC. El producto se trató a 37ºC durante 1 hora con 10 U de
la enzima de restricción DpnI (Stratagene). DpnI es una endonucleasa que actúa sobre DNA
metilado o hemimetilado, lo que produce la degradación del molde DNA que se encuentra
metilado al utilizarse plásmidos amplificados en una cepa dam+ de E. coli. De esta forma se
obtienen únicamente las hebras sintetizadas de novo durante la reacción de amplificación y
que contienen la mutación deseada
Se transformó 1 μl del producto de la reacción anterior en células competentes
E. coli XL1-Blue MRF’ {Δ(mcrA) 183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173, endA1, supE44, thi-,
recA, gyrA96, relA1, lac, λ-, [F’, proAB, lacIqZΔM15, Tn10, (tetr)]}, y se seleccionaron
las colonias resistentes a ampicilina. A continuación, se identificaron las mutaciones
mediante secuenciación del DNA plasmídico extraído con el kit “Wizard Plus SV Minipreps”
(Promega). Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo por el Servicio de
Secuenciación de la U.A.M.
utilizando el kit de secuenciación ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction (Applied Biosystems) y los secuenciadores automáticos ABI 377 DNA Sequencer o
ABI 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Para el análisis de secuencias se utilizó el
paquete Seqman 4.0

Mutación Oligonucleótidos SS_Y215T 5’ GGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAA

3’ 3’ TCCACCCCTAAATGGTGTGGTCTGTTT 5’ SS_Y215S 5’
GGAGGTGGGGATTTTCCACACCAGACAAA 3’ 3’
TCCACCCCTAAAAGGTGTGGTCTGTTT 5’ SS_Y215N 5’
GGAGGTGGGGATTTAACACACCAGACAAA 3’ 3’
TCCACCCCTAAATTGTGTGGTCTGTTT 5’ SS_D67N 5’
GTCATAAAGAAAAAAAATAGTTCTAGTTCTAGATGGAG 3’ 3’
GTATTTCTTTTTTTTATCAAGATCAAGATC 5’ BH10_SSSY 5’
GAGGTGGGGACTTTACACACCAGACAAAAAACATC 3’ 3’
CTCCACCCCTGAAATGTGTGGTCTGTTTTTTGTAG 5’ BH10_V75A 5’
CAGTACTAAATGGAGAAAATTAGCAGATTTCAGAGA 3’ 3’
GTCATGATTTACCTCTTTTAATCGTCTAAAGTCTCT 5’ BH10_V75F 5’
CAGTACTAAATGGAGAAAATTATTCGATTTCAGAGAAC 3’ 3’
GTCATGATTTACCTCTTTTAATAAGCTAAAGTCTCTTG 5’ BH10_V75I 5’
CAGTACTAAATGGAGAAAATTAATAGATTTCAGAGA 3’ 3’
GTCATGATTTACCTCTTTTAATTATCTAAAGTCTCT 5’ BH10_V75L 5’
CAGTACTAAATGGAGAAAATTACTAGATTTCAGAGA 3’ 3’
GTCATGATTTACCTCTTTTAATGATCTAAAGTCTCT 5’ BH10_V75M 5’
CAGTACTAAATGGAGAAAATTAATGGATTTCAGAGAAC 3’ 3’
GTCATGATTTACCTCTTTTAATTACCTAAAGTCTCTTG 5’ 5’
CAGTACTAAATGGAGAAAATTATCAGATTTCAGAGAAC 3’ 3’
GTCATGATTTACCTCTTTTAATTAGTTAAAGTCTCTTG 5’ BH10_V75T 5’
CAGTACTAAATGGAGAAAATTAACAGATTTCAGAGAAC 3’ 3’
GTCATGATTTACCTCTTTTAATTGTCTAAAGTCTCTTG 5’ BH10_V75S

Posteriormente, el plásmido pRT6 se cortó con MscI y KpnI (New England Biolabs),
liberando un inserto de 1207 pares de bases (pb) que, tras purificarse en un gel de agarosa al
0,8% en TAE, se extrajo mediante adsorción a una matriz de silicato con el kit Geneclean II
(Bio 101 Inc.). Este inserto se clonó en los correspondientes sitios de restricción situados
dentro de la región codificante de la p51, clonada en el vector pT51H (Figura 13A). Con el
producto de ligación se transformaron células competentes E. coli DH5α.

Además, los cambios individuales V75A, V75F y V75I se introdujeron en el plásmido

pRT66B (Figura 13B), que contenía la región codificante de la subunidad p66 de la RT
BH10, construido como se explica en el apartado 3.1. El procedimiento de mutagénesis fue el
mismo que el explicado anteriormente, a excepción del molde inicial en la amplificación, que
fue pRT66B. Una vez introducidas las mutaciones se extrajo el DNA plasmídico mediante el
kit “Wizard Plus SV Minipreps” (Promega). Después de comprobar por secuenciación que las
mutaciones introducidas eran correctas, el DNA se transformó en células competentes E. coli
XL1-Blue PR. Las células E. coli XL1-Blue PR son células competentes E. coli XL1-Blue
transformadas con el plásmido pATPR (Figura 13C), que contiene la región codificante de la
proteasa del VIH-1. Esta enzima es necesaria para que se produzca el procesamiento de la
subunidad p66 de la RT (Boretto et al., 2001).

IV. Resultados

Transformación
La transformación bacteriana es una técnica crucial para modificar los genomas bacterianos e
investigar la expresión, función y herencia de los genes.
La eficiencia de transformación normalmente se calcula determinando el número de
transformantes exitosos (células que han absorbido e incorporado el ADN extraño) por
unidad de ADN de entrada o por unidad de células competentes utilizadas en el proceso de
transformación
1) Determinar el número de transformantes viables: Después del proceso de
transformación, las células transformadas generalmente se colocan en placas de agar
selectivo que contienen antibióticos u otros marcadores de selección para
diferenciarlas de las células no transformadas. Después de un período de incubación
apropiado, aparecerán en las placas colonias visibles que representan transformantes
viables.
2) Cuente el número de colonias transformantes: Cuente el número de colonias
transformantes individuales en las placas de agar selectivo. Para garantizar la
precisión, a menudo es necesario diluir la suspensión de células transformadas y las
diluciones apropiadas en placas para obtener placas con un número contable de
colonias (normalmente entre 30 y 300 colonias).
3) Calcular la eficiencia de transformación: La eficiencia de transformación se expresa
típicamente como el número de transformantes por microgramo (μg) de ADN de
entrada o por nanogramo (ng) de ADN de entrada. La fórmula para calcular la
eficiencia de transformación es: Eficiencia de transformación = (Número de
transformantes / Cantidad de ADN de entrada) × Factor de dilución.
Alternativamente, si la eficiencia de transformación se calcula por unidad de células
competentes, la fórmula se convierte en: Eficiencia de transformación = (Número de
transformantes / Volumen de células competentes) × Factor de dilución. El factor de
dilución representa la dilución utilizada para sembrar en placas un número apropiado
de colonias transformantes.
Es importante tener en cuenta que la eficiencia de la transformación puede variar según las
condiciones experimentales específicas, como la cepa de bacterias, el tipo y la calidad del
ADN, el método de transformación utilizado y otros factores discutidos anteriormente.
Calcular y comparar las eficiencias de transformación puede ayudar a optimizar los
protocolos de transformación y evaluar la efectividad de diferentes variables experimentales.

Mutagénesis
Se denomina mutagénesis a la producción de mutaciones sobre ADN, clonado o no. De
realizarse in vitro, dicha alteración puede realizarse al azar (mutagénesis al azar), sobre
cualquier secuencia, o bien de forma dirigida (mutagénesis dirigida) sobre una secuencia
conocida y en la posición de interés. En el caso de realizarse in vivo, sobre organismos y no
sobre ADN clonado por tanto, se realiza a gran escala y sin conocimiento de secuencia,
empleando para ello sustancias denominadas mutágenos.
1. Número de células tratadas y número de células subcultivadas para cada cultivo;
mediciones de citotoxicidad y otras observaciones, si las hubiera; signos de
precipitación y momento de la determinación; número de células sembradas en medio
selectivo y no selectivo
2. Número de colonias en medio no selectivo y número de colonias resistentes en medio
selectivo, y frecuencias mutantes relacionadas;
3. Relación concentración-respuesta, cuando sea posible;
4. Datos de control positivos (concentraciones y disolventes) y negativos (disolventes)
simultáneos;
5. Datos históricos de control negativo (solvente) y positivo, con rangos, medias y
desviaciones estándar e intervalo de confianza (por ejemplo, 95%), así como el
número de datos; análisis estadísticos (para cultivos individuales y réplicas agrupadas,
si corresponde) y valores de p, si los hubiera.

V. Conclusiones

La transformación es el proceso por el cual las células bacterianas toman el ADN libre
que se encuentra en su entorno. La transformación ocurre en la naturaleza, pero también
se explota en laboratorios de investigación para manipular bacterias genéticamente. Hay
transferencia genética vertical y transferencia genética horizontal .

Las bacterias que pueden realizar la transformación se denominan células competentes .

La mayoría de las bacterias no son competentes de forma natural, pero mediante
tratamientos químicos y de temperatura, los científicos pueden hacer que las células sean
competentes y transformar los plásmidos de ADN en ellas. Incluso entonces, la mayoría
de las bacterias no se transformarán. Por esta razón, generalmente se incluye un gen de
 resistencia a los antibióticos, de modo que cuando los científicos tratan las células con un
antibiótico, éste matará las células no transformadas mientras permite que las células
transformadas sobrevivan.

VI. Referencias bibliográficas

Redalyc.Aplicaciones de la proteína verde fluorescente (GFP) en la biología

celular y en la visualización del sistema nervioso
Franco, A. Y. (2009). Aplicaciones de la proteína verde fluorescente (GFP) en

la biología celular y en la visualización del sistema nervioso. Redalyc.org.

https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=179214945007

Mutagénesis dirigida - MATERIALES y MÉTODOS. (s. f.).

https://1library.co/article/mutag%C3%A9nesis-dirigida-materiales-y-m%C3%A

9todos.ye3v797q

Bio, S. (2023, 28 mayo). Bacterial Transformation Protocol. Microbiology Note

– Online Biology Notes.

https://microbiologynote.com/es/protocolo-de-transformacion-bacteriana/#Prot

ocol_For_Transformation_Using_Chemically_Competent_Cells

Cruzito. (2021, 17 agosto). Transformación bacteriana: definición, pasos y

análisis | Estudyando. Estudyando.

https://estudyando.com/transformacion-bacteriana-definicion-pasos-y-analisis/