UNIVERSIDAD DE SONORA.

UNIDAD REGIONAL SUR.

División de ciencias e ingeniería.
Departamento de ciencias químico biológicas y agropecuarias.

MATERIA.
Laboratorio Biología Molecular.

PRACTICA 3.
“Aislamiento de DNA plasmídico”.

EQUIPO #4

MAESTRO.
Dr. Jesus Alfredo Rosas Rodríguez.

ALUMNA.
Teresita de Jesus Anduro Ayón.
Exp.219203020
Ana Magaly Moroyoqui Vega.
Exp.218218140
 Práctica #3
Aislamiento de DNA plasmídico
INTRODUCCIÓN

Un plásmido es una molécula pequeña de DNA circular dentro de una célula, este está separado
físicamente del DNA cromosomal y se puede replicar independientemente (Figura 5). Para introducir de
manera artificial un plásmido dentro de una célula se recurre a la “transformación”, este es un método
que imita un mecanismo natural en muchas bacterias. Para transformar de manera artificial, la bacteria
tiene que encontrarse en “estado de competencia”, en el cual presenta alteraciones en su pared y
membrana celular permitiendo la entrada de ácidos nucleicos en la célula (Leboffe MJ y Pierce BE, 2006).
La modificación del contenido celular bacteriano ofrece avances biotecnológicos para la genética,
ingeniería bioquímica y biomédica (e.g. síntesis en grandes cantidades de proteínas, clonación de un
mismo fragmento de DNA y fermentación industrial) (Fernandez MM y Hosey RG, 2009; Smit E y col.,
1998; Ye X y col., 2000).

La importancia de realizar la práctica es que nos va a permitir conocer como el ADN plasmídico puede
aislarse de una forma práctica, como podemos observar los plásmidos en el tubo de ensaye, de qué color
se observan, y como mediante las diferentes técnicas de aislamiento observaremos y utilizaremos
diferentes equipos que aún no hemos utilizado de forma presencial como el autoclave, esta práctica es
de suma importancia para nosotros como químicos ya que forma parte esencial del programa y que en
un futuro posiblemente la utilizaremos en nuestro próximo trabajo, reconociendo la forma correcta de
realizarlo.

Los impactos académicos serian que nosotros como estudiantes comprendamos las técnicas para aislar
ADN plasmidico, la forma en que se hace, fundamentarnos en la teoría para realizar la práctica, aplicar
este conocimiento en diferentes materias como genética y biología, acostumbrarnos a manejar estos
materiales nuevos para nosotros, y finalmente es que nosotros mismos tomemos la iniciativa de hacer las
cosas como futuros profesionistas.
 BIBLIOGRAFÍAS

• GONZALEZ, F. E. R. N. A. N. D. A. D. E. Y. A. N. I. R. A. (2017, 28 agosto). Extracción de DNA

plasmídico. Método de Lisis Alcalina. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE ZACATECAS. Recuperado 31
de enero de 2022, de https://www.studocu.com/es-mx/document/universidad-autonoma-de-
zacatecas/biologia- molecular/practica-5-extraccion-de-dna-plasmidico-metodo-de-lisis-
alcalina/3100307
• FLORES, D. A. N. I. E. L. A. L. E. T. I. C. I. A. (2017, 28 mayo). Método: Extracción de ADN plasmídico
(Lisis alcalina modificado) Alberto Checa Rojas. (2017). Método: Extracción de ADN plasmídico
(Lisis alcalina modificado). 2022, Enero 31, Conogasi.org Sitio web:
https://conogasi.org/articulos/metodo- extraccion-de-adn-plasmidico-lisis-alcalina-modificado/.
CONOGASI APRENDER NUEVAS COSAS. Recuperado 31 de enero de 2022, de
https://conogasi.org/articulos/metodo-extraccion-de-adn-plasmidico- lisis-alcalina-modificado/
• FIERROS, F. E. R. N. A. N. D. O. E. S. A. U. L. (2019, 29 octubre). Purificación de ADN plasmídico y
electroforesis del mismo en gel de agarosa. DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA
MOLECULAR. Recuperado 31 de enero de 2022, de https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/38%20PURIFICACION%20DNA%20PLASMIDO.pdf
• PALACIOS, J. U. A. N. M. A. N. U. E. L. (2012, 1 enero). Inmunología y los Premios Nobel. ARTICULOS
CIENTIFICOS: ELSEVIER. Recuperado 17 de enero de 2022, de https://www.elsevier.es/es-revista-
inmunologia-322-articulo-inmunologia-premios-nobel-2011-S0213962612000169

OBJETIVO:

Aislar DNA plasmidico apartir de cultivo liquido de escherichia coli transformada con un plasmido
especifico.
 Reactivos:

Solución I: glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM

Solución II: Mezcla de Lisis, SDS 1%, NaOH 0.2 N (preparada

recientemente, máximo una semana antes).

Solución III: Acetato de sodio 3 M, pH 5.2.

Etanol absoluto frío

Etanol al 70% frío

Isopropanol frío

Agua miliQ esteril.

Cloro al 10%

Equipo:

Incubadora con agitación.

microcentrífuga refrigerada.
 Procedimiento:

Inocular 5 ml de caldo LB conteniendo el antibiótico apropiado con una colonia proveniente de la placa
de cultivo, incubar a 37°C con agitación (250 rpm) por lo menos 18 horas.

Transferir 1.5 ml del cultivo a un microtubo y centrifugar por 5 min a máxima velocidad en la
microcentrífuga (~12,000 g o 11,000 rpm) por 5 min a temperatura ambiente.

Remover el sobrenadante y resuspender el pellet en 250 μL de solución I.

Agregar 250 μL de solución 2 y esperar de 4 a 10 minutos hasta que la solución se vea transparente. Si
después del tiempo indicado la solución no se torna transparente siga con el paso 5.

Agregar 250 μL de solución III fría (colocada en hielo) e incubar sobre hielo 10 a 15 min. Centrifugar a
temperatura ambiente por 10 min en la microcentrífuga a máxima velocidad (~12 000 g, 11 000 rpm).

Transferir el sobrenadante a un tubo limpio (~700 μL) y agregar 700 μL de isopropanol frio.

Centrifugar por 30 min a temperatura ambiente a máxima velocidad (~12,000 g o 11,000 rpm).

Remover el sobrenadante y lavar el pellet con 300 μL de etanol al 70%.

Centrifugar 2 min y remover el etanol por decantación, tenga cuidado de

no perder el pellet.

Repetir el lavado con etanol al 70% como lo hizo anteriormente.

Secar el pellet con vacío o al aire.

Resuspender el pellet en 100 μL de agua miliQ esteril.

 DIAGRAMA DE FLUJO:

1. Inocular 5 ml de caldo LB conteniendo el antibiótico apropiado con una colonia proveniente de

la placa de cultivo, incubar a 37 °c con agitación (250 rpm) por lo menos 18 h.
2. Transferir 1.5 ml del cultivo a un microtubo y centrifugar por 5 min a máxima velocidad en la
microcentrífuga (12,000 g o 11,000 rpm) por 5 min a temperatura ambiente.
3. Remover el sobrenadante y resuspender el pellet en 250 uL de solucion I.
4. Agregar 250 uL de solucion 2 y esperar de 4 a 10 min hasta que la solucion se vea trasparente. Si
después del tiempo indicado la solucion no se torna transparente siga con el paso 5.
5. Agregar 250 uL de solucion III (colocada en el hielo) e incubar sobre hielo 10 a 15 min.
Centrifugar a temperatura ambiente por 10 min en la microcentrífuga a máxima velocidad
(12,000 g, 11,000rpm).
6. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio (700 uL) y agregar 700 uL de isopropanol frio.
7. Centrifugar por 30 minutos a temperatura ambiente a máxima velocidad (12,000 o 11,000 rpm).
8. Remover el sobrenadante y lavar el pellet con 300 uL de etanol al 70%.
9. Centrifugar 2 min y remover el etanol por decantación, tenga cuidado de no perder el pellet.
10. Repetir el lavado con etanol al 70% como lo hizo anteriormente.
11. Secar el pellet con vacío o al aire.
12. Resuspender el pellet en 100 uL de agua miliQ estéril.
 OBSERVACIONES:

Aislamiento de DNA en esta práctica se observó cómo se coloca la muestra y tuvo contra peso y se tapa
para que se centrifugar por 5minutos ya que se centrifugue se agrega a un vaso que contiene cloro se
puede trabajar con los cinco mililitros que se sembraron se puede adicionar por otra vez los 5 mililitros y
volver centrifugar. Ya que se termina de centrifugar se mira diferentes fases y membranas celular es
distinto a lo que se cuando estaban las bacterias. Se observó el DNA un pequeño pelen, un pequeño botón
blanco como se ve en la parte de abajo si se contrató de ver, se lava el pelen con 300 mililitros de etanol
se suspende en agua y se observó

mejor el pelen blanco y por último se desaparece en agua. Se agrega el nombre y la fecha en que se extrajo
y se almacena.

Las columnas no deben ser sobrecargadas con DNA plasmídico, para ello deben de usarse los volúmenes
de cultivo que se indican en el protocolo. Almacenar las columnas y las soluciones a las temperaturas
recomendadas.

RESULTADOS:

Después de realizar la última centrifugación, en el tubo donde se realizó el aislamiento del DNA
plasmático, se alcanzó a observar cómo se formó un botón pequeño de color blanco en la parte inferior
del mismo tubo. Ya en último punto cuando se tiene el último sedimentado de DNA plasmático se le
agrego agua estéril para diluirlo. En este punto se etiqueta el tubo con los datos requeridos, y se guarda
a -20°, ya que el proceso de cuantificación se realizará en una práctica más adelante junto con la
cuantificación de DNA genómico.

al finalizar la práctica se pudo lograr obtener el DNA plasmídico, se tuvo que centrifugar y extraer con una
micropipeta el exceso de etanol sin tocar el DNA, que al final fue disuelto en agua destilada para su
conservación y poder cuantificar el DNA posterior a esto.

CONCLUSIÓN:

Concluimos que para nosotros fue importante conocer como es la forma de los plásmidos, como aislarnos
para obtener su ADN, aprendimos a conocer estos tipos de técnicas que en realidad son nuevas para
nosotros, aprendimos a manejar los equipos y materiales, con esta práctica aprendimos algo nuevo que
podemos aplicar en otras materias cual tipo de plásmido aislar, cuáles son sus características, etc. Y
finalmente cumplimos con la finalidad principal de la práctica el aislar un cultivo liquido de Escherichia
coli mediante el aislamiento del ADN plasmídico, que es referente aun plásmido específico.

Dentro de lo más importante de esta práctica es que nosotros como futuros químicos debemos tener las
bases fundamentales teóricas y prácticas y no cometer un error y afectar el aislamiento del DNA plásmido,
por lo que tendríamos que volver a realizar la práctica y perderíamos bastante tiempo valioso para el
profesor y aprendizaje de nosotros mismos ya que solo son 2 horas semanales.
 BIBLIOGRAFÍAS:

COQUE, M. A. R. I. A. T. E. R. E. S. A. (2018, 13 marzo). METODO MOLECULAR DE TIPIFICACIÓN

EPIDEMIOLOGICA EN BACTERIOLOGIA. PROCEDIMIENTOS EN MICROBIOLOGIA CLINICA. Recuperado 31
de enero de 2022, de
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiolo gia/seimc-
procedimientomicrobiologia18.pdf

QUINTERO, D. R. G. A. B. R. I. E. L. S. A. U. L. (2019, 18 abril). AISLAMIENTO DE ADN. UNIVERSIDAD

NACIONAL DE QUILMES. Recuperado 31 de enero de 2022, de
http://cronos.unq.edu.ar/ibcm/guiastp/2008/manana/tp4_tm.pdf

PALAFOX, M. O. N. I. C. A. Y. A. R. E. L. Y. (2015, 24 julio). GENETICA MOLECULAR HUMANA. UNIVERSIDAD

COMPLUTENSE DE MADRID. Recuperado 31 de enero de 2022, de
https://www.ucm.es/data/cont/docs/261-2014- 10-13-
Cuaderno%20Gen%C3%A9tica%20Molecular%20Humana.pdf

ALEJOS VAZQUEZ, L. A. U. R. A. P. A. T. R. I. C. I. A. (2017, 19 septiembre). Extracción y purificación de ADN.

UNIVERSIDAD VERACRUZANA. Recuperado 31 de enero de 2022, de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
 REDACCIÓN FINAL:

Los plásmidos han sido usados como herramientas en diferentes áreas de la biología como: la
biotecnología y la biología molecular usándolos para la clonación del ADN. Esto es gracias a su pequeño
tamaño en comparación con los cromosomas que facilita su extracción y su manipulación. Además, sus
propiedades de replicación y conjugación son de gran ayuda para el análisis genético. Existen diferentes
técnicas para aislar el ADN plasmídico y uno de los métodos más usado es el método de extracción por
lisis alcalina. Este método aprovecha las diferencias en el tamaño y la superhelicidad que es el grado de
torsión que sufre el ADN plasmídico en contraste con el cromosomal. La mayoría de los cromosomas
bacterianos, son moléculas circulares extremadamente grandes que no se encuentran superenrollados,
mientras que los plásmidos son moléculas pequeñas y superenrolladas. Durante el proceso de extracción,
se busca desnaturalizar el ADN plasmídico y el cromosomal y posteriormente desnaturalizarlo, con el fin
de que el ADN cromosomal, no se aparee rápidamente y pueda ser atrapado por complejos proteicos, los
cuales precipitaran; a diferencia del ADN plasmídico que rápidamente se re naturalizan y adquirirá su
conformación natural.

Los plásmidos generalmente se encuentran distribuidos en bacterias, aunque también suelen encontrarse
en algunos hongos y levaduras. En general no son esenciales, sin embargo, en algunos casos proveen a las
células ventajas selectivas. Usando el método de extracción por lisis alcalina se puede obtener entre 100-
500 μg de ADN partiendo de 1.5 mL de cultivo de bacterias en fase exponencial con un moderado número
de copias (10 a 20 por bacteria).

Pero la pureza y cantidad del ADN dependerá de los siguientes factores:

Mayor tamaño del plásmido, menor cantidad y pureza de ADN.

Mayor número de copias del plásmido, mayor cantidad de ADN.

Cepas que producen grandes cantidades de carbohidratos deterioran la

pureza del ADN e interfieren con la actividad de las enzimas de restricción.

Los plásmidos se pueden clasificar siguiendo distintos criterios. Uno de estos criterios es el tipo de genes
que portan. Así se define el grupo de plásmidos con genes de degradación de sustancias, el grupo de
plásmidos con genes de fertilidad, el que porta genes de virulencia o el grupo que porta genes de
resistencia. Aunque los plásmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y se transfieren con
dificultad de una célula a otra se ha hipotetizado que podrían ser los precursores de los primeros virus.

El tipo de genes que portan los plásmidos es variado, tratándose generalmente de genes que aportan
ventajas adaptativas a la bacteria que los porta: genes de resistencia a antibióticos, genes de producción
de sustancias tóxicas para otras bacterias o genes que codifican enzimas útiles para degradar sustancias
químicas.