Replicación de ADN

Replicación de ADN. La doble hélice es desenrollada y cada hebra hace de plantilla para la
síntesis de la nueva cadena. La ADN polimerasa añade los nucleótidos complementarios a
los de la cadena original.

El proceso de replicación de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es

decir, sintetizar una copia idéntica). De esta manera de una molécula de ADN única, se
obtienen dos o más "clones" de la primera. Esta duplicación del material genético se
produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos
cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la
síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva
doble hélice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la complementacion
entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la
importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite que la información
genética se transmita de una célula madre a las células hijas y es la base de la herencia del
material genético.

La molécula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrógeno
entre las bases complementarias liberándose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la
mitad complementaria añadiendo nucleótidos que se encuentran dispersos en el núcleo. De
esta forma, cada nueva molécula es idéntica a la molécula de ADN inicial.
La replicación empieza en puntos determinados: los orígenes de replicación. Las proteínas
iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la
fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN
formándose una horquilla de replicación. Un gran número de enzimas y proteínas
intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de
replicación o replisoma. Estas proteínas y enzimas son homólogas en eucariotas y arqueas,
pero difieren en bacterias.

Características generales
Semiconservadora

Tres posibles modelos de replicación. a) Conservadora, b) Dispersora, c) Semiconservadora

(mecanismo real)

En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales, y por eso se
dice que la replicación del ADN es semiconservadora. Hasta que finalmente se pudo
demostrar que la replicación es semiconservadora, se consideraron tres posibles modelos
para el mecanismo de la replicación:

 Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las moléculas hijas se

conserva una de las cadenas originales.
 Conservadora. Se sintetiza una molécula totalmente nueva, copia de la original.
 Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena
antigua y fragmentos de la nueva.
Experimento de Meselson y Stahl.

El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permitió demostrar que el mecanismo real se

ajusta a la hipótesis de replicación semiconservadora. Para ello se hicieron crecer células de
Escherichia coli en presencia de nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo
habitual. En consecuencia, el isótopo se incorporó a las cadenas de ADN que se iban
sintetizando, haciéndolas más pesadas.

Una vez conseguido el primer objetivo, las células fueron transferidas a un medio que
contenía nitrógeno-14, es decir, un medio más ligero, donde continuaron su crecimiento
(división celular, que requiere la replicación del ADN). Se purificó el ADN y se analizó
mediante una centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay más densidad
en el fondo del tubo que en la parte media del mismo.

En la primera generación (figura 2.b) se obtuvo una única banda de ADN con densidad
intermedia. En la segunda generación (figura 2.c) se obtuvieron dos bandas, una con
densidad ligera y otra con densidad intermedia o híbrida. En la tercera generación se
obtuvieron dos bandas, una ligera (con una abundancia del 75%) y otra intermedia (con el
25% restante).
La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena
pesada (original) y otra ligera (recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una
molécula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no existían aun cuando
las células se pusieron en presencia de nitrógeno-15.

El hecho de que cada vez haya más moléculas ligeras y se mantenga el número de
moléculas intermedias demuestra que la replicación del ADN es semiconservadora. Si fuera
conservadora, aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) .
Si fuera dispersante sólo aparecerían bandas híbridas de densidad intermedia en todas las
generaciones.1

Secuencial y bidireccional desde puntos fijos.

Los orígenes de replicación son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la
replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla.
Por otro lado, la replicación se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de cada
origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.

El origen de replicación

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se

denomina replicón o unidad funcional de replicación. El genoma bacteriano es un replicón
único circular. En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples
orígenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.2

En las células eucariotas hay varios replicones

Experimento de Cairns

Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron
determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicación a partir del cual el genoma
empezaba a replicarse. Los experimentos consistían en mantener un cultivo de E. coli
creciendo en un medio que contenía timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma
que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografía. A
continuación se observaba al microscopio. Los resultados indicaban que la replicación en E.
coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).3

Secuencialidad

Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos de complementación de

mutaciones que permitieron determinar que desde los orígenes la replicación avanza de
forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos
sincronizados de forma que todas las células del cultivo estuvieran en la misma fase del
ciclo celular. El método consistía en la conjugación bacteriana de cepas silvestres con cepas
mutantes incapaces de sintetizar determinados aminoácidos. Conociendo la localización de
los genes que codifican las proteínas implicadas en la síntesis de los diferentes aminoácidos
en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias receptoras en un "medio
mínimo" (donde sólo pudiesen crecer las que hubieran recibido alguno de estos genes), al
extraer ADN a diferentes tiempos se observó que, tras la última extracción aparecía con
mayor frecuencia el gen implicado en la síntesis de uno de los aminoácidos (el
correspondiente a la "posición 1"), que el gen adyacente implicado en la síntesis de otro
aminoácido ("posición 2"). De la misma forma, el gen que ocupaba la "posición 3" aparecía
con menor frecuencia que el que ocupaba la "posición 2", y así sucesivamente.

Como los primeros genes en replicarse en la bacteria donadora serían los primeros en
transferirse, el experimento permitió demostrar, a partir de las frecuencias relativas de los
diferentes genes en las bacterias receptoras, que la replicación sigue un orden (es
secuencial).

La replicación avanza en forma de horquilla

Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo
tiempo, éstas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de
una nueva cadena. Por eso, la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla
formándose una burbuja u ojo de replicación (también llamada estructura θ cuando el ADN
es circular debido a la similaridad entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma
bacteriano en estados intermedios de replicación, no obstante pudiendo aparecer estructuras
alternativas),3 que avanza en dirección a la región de ADN no duplicado dejando atrás los
dos moldes de ADN de cadena simple donde se está produciendo la replicación.2

Bidireccionalidad
El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir
de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayoría de
los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los
mecanismos de replicación que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material
hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o monocatenario).3 Así, en casos
particulares como el ADN mitocondrial, algunos plásmidos y algunos genomas
monocatenarios de fagos pequeños, la replicación se da unidireccionalmente pudiendo
haber uno o dos orígenes de replicación.

Distinción entre la replicación unidireccional y la bidireccional mediante el recuento de

copias de genes marcadores. O es el origen de replicación y A, B, C, D, E son genes
marcadores.

En la mayoría de los casos la replicación es bidireccional

No obstante, la replicación se puede considerar, de forma general, bidireccional.

La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada

por una técnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con
tritio. Primero se añade timidina marcada y luego sin marcar, y siguiendo el rastro de tritio
se observa hacia dónde se ha replicado la molécula de ADN.3 También se puede, mediante
el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicación es unidireccional o
bidireccional. Otras técnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicación
hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de
restricción).

Semidiscontinua

La replicación es semidiscontínua

La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el
punto a partir del cual se produce la elongación del ADN. Esto plantea un problema, y es
que las cadenas tienen que crecer simultáneamente a pesar de que son antiparalelas, es
decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena.
Por ello, una de las cadenas debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.

Este problema lo resolvieron los científicos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki en
la década de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en
forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud
suele variar entre 1000 y 2000 nucleótidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucleótidos en
eucariontes.

La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de replicación se

denomina hebra adelantada (en inglés, leading strand, que a veces se traduce por líder o
conductora) y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientras que la que se
sintetiza en sentido contrario al avance se denomina hebra rezagada o retrasada (en inglés,
lagging strand), cuya síntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la
horquilla de replicación avance para disponer de una cierta longitud de ADN molde.2

ADN Polimerasas
Estructura en 3D de un ADN polimerasa

La ADN polimerasa es la enzima que cataliza la síntesis de la nueva cadena de ADN a

partir de desoxirribonucleótidos y de la molécula de ADN plantilla o molde que es la que
será replicada. La enzima copia la cadena de nucleótidos de forma complementaria (A por
T, C por G) para dar a cada célula hija una copia del ADN durante la replicación.

Modo de operación
En cada horquilla de replicación, la ADN polimerasa y otras enzimas sintetizan dos nuevas
cadenas de ADN que son complementarias respecto a las 2 cadenas originales. Durante este
proceso, la ADN polimerasa reconoce una base nucleotídica no apareada de la cadena
original y la combina con un nucleótido libre que tiene la base complementaria correcta.
Luego, la ADN polimerasa cataliza la formación de nuevos enlaces covalentes que ligan el
fosfato del nucleótido libre entrante con el azúcar del nucleótido previamente agregado en
la cadena hija en crecimiento. De esta forma, la ADN polimerasa sintetiza el esqueleto de
azúcar-fosfato de la cadena hija.

Función correctora exonucleasa 3' → 5' de las ADN polimerasas.

Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el proceso de replicación.
Además de participar en la elongación, desempeñan una función correctora y reparadora
gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar el ADN
partiendo de un extremo de éste. Es importante que existan estos mecanismos de corrección
ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a
mutaciones.

Proceso general

 La helicasa rompe los puentes de hidrógeno de la doble hélice permitiendo el

avance de la horquilla de replicación.

 La topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento

producido por la separación de la doble hélice.

 Las proteínas SSB se unen a la hebra discontínua de ADN, impidiendo que ésta se
una consigo misma.

 La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la

hebra adelantada y de forma discontínua en la hebra rezagada.

 La ARN primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la síntesis de la cadena

complementaria a la cadena rezagada.

 La ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki.

El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciación, elongación y terminación.

 El cebador: son pequeñas unidades de RNA que se unen a los fragmentos para que
la ADN polimerasa reconozca donde debe unirse.

Los cebadores los quita la pol. I y coloca bases a la cadena en crecimiento por la ligasa.
Iniciación
Mediante consumo de ATP en dirección a la horquilla de replicación, es decir, en dirección
5' → 3' en la hebra rezagada y 3' → 5' en la hebra adelantada, rompiendo los puentes de
hidrógeno que mantienen unida la doble hélice.3 El siguiente conjunto de proteínas
reclutadas son las denominadas proteínas SSB (single-stranded DNA binding proteins,
proteínas ligantes de ADN monocatenario) encargadas de la estabilización del ADN
monocatenario generado por la acción de las helicasas, impidiendo así que el ADN se
renaturalice o forme de nuevo la doble hélice, de manera que pueda servir de molde. Estas
proteínas se unen de forma cooperativa, por lo que su unión al DNA conforme avanza la
helicasa es rápida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando
superenrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si éstos no
fueran eliminados, llegado a un punto el replisoma ya no podría seguir avanzando. Las
topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos cortando
una o las dos cadenas de ADN y pasándolas a través de la rotura realizada, sellando a
continuación la brecha.2

Elongación
Enzimas que participan en la replicación de E. coli: helicasa, proteínas SSB, topoisomerasa,
ARN primasa, Holoenzima ADN Pol III

En el siguiente paso, la holoenzima ADN Pol III cataliza la síntesis de las nuevas cadenas
añadiendo nucleótidos sobre el molde. Esta síntesis se da bidireccionalmente desde cada
origen, con dos horquillas de replicación que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance
de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan,
se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado.

Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que
una ARN primasa catalice la formación de un fragmento corto específico de ARN llamado
cebador, que determinará el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir
nucleótidos. Así, durante la síntesis, en cada horquilla de replicación se van formando dos
copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se
separaron en la fase de iniciación, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad
polimerasa de la ADN Pol III, que sólo es capaz de sintetizar en sentido 5´ → 3', la
replicación sólo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es
discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki.

La mitad del dímero de la holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra
mitad la hebra rezagada.3 La elongacion de la hebra rezagada ocurre por medio del modelo
del trombón.
Hebra rezagada: síntesis de cebadores, unión de fragmentos de Okazaki y eliminación de
los cebadores

Enzimas que participan en la eliminación de cebadores y unión de los fragmentos de

Okazaki. El cebador de ARN está pintado en azul y el ADN que lo reemplaza en naranja

En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro
fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de éste es eliminado y los dos
fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. Una vez se han juntado
todos se completa la doble hélice de ADN. La eliminación de cebadores también se da en la
hebra conductora, de síntesis continua, pero debido a que en ésta hay un solo cebador es un
proceso que sólo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces
como fragmentos de Okazaki haya.
En la eliminación del fragmento de Okazaki (también denominado iniciador, cebador o
primer) intervienen dos de enzimas: por un lado la ADN Pol I, que va eliminando el ARN
con su actividad exonucleasa 5' → 3' y simultáneamente rellenando con ADN mediante su
actividad polimerasa 5' → 3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura (o
"mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por último, la
ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reacción de condensación entre el grupo fosfato
y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo, completando el enlace fosfodiéster;
para ello, es preciso hidrolizar una molécula de ATP.2

Nota: diversos autores difieren en los enzimas implicados en esta etapa. Para algunos no es
la propia ADN Pol I la que rellena el hueco tras eliminar el primer, sino que lo hace la
ADN Pol III (la misma que polimeriza el resto de la cadena). Del mismo modo, algunos
autores siguen empleando el término ribonucleasa o (RNasa) para referirse a la ADN Pol I
en esta etapa, ya que hasta hace poco se desconocía que la propia ADN Pol I tenía la
capacidad exonucleasa 5' → 3, y se pensaba que esto lo realizaba otro enzima, que recibía
este nombre genérico.

Terminación

Terminación de los genomas lineales

El final de la replicación se produce cuando la ADN polimerasa III se encuentra con una
secuencia de terminación. Se produce entonces el desacople de todo el replisoma y la
finalización de la replicación.

Referencias
1. ↑ Watson, J. D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R (2006). «2. Los
ácidos nucleicos transmiten información genética». Biología Molecular del Gen (5ª Ed.).
Madrid: Médica Panamericana. 84-7903-505-6.
2. ↑ a b c d e {{Watson, J. D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R
(2006). «8. La duplicación del DNA». Biología Molecular del Gen (5ª Ed.). Madrid:
Médica Panamericana. 84-7903-505-6.
3. ↑ a b c d e f César Benito Jiménez, Profesor Titular de Genética, Departamento de Genética,
U.C.M.. «La Replicación». Consultado el marzo de 2008.

Bibliografía
 Bramhill, D., and Kornberg, A. 1988. A model for initiation at origins of DNA
replication. Cell 54:915-18.