Inmunofluorescencia

Propiedad de algunas sustancias

Luminiscencia o fotoluminiscencia: Almacenar energa luminosa y liberarla posteriormente como energa luminosa Fosforescencia: Perodos de almacenamiento largo con emisin mucho despus de cesada la excitacin Fluorescencia: Perodos de almacenamiento cortos 10-7 10-9 seg y emisin

Fluorescencia
Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas molculas (fluorforos)

Diagrama Jablonski

1: Excitacin: se entrega un fotn de energa por una fuente externa a un fluorforo que absorbe, pasando a un estado electrnico excitado S1
2: Duracin del estado excitado: existe por un perodo de tiempo finito (tpicamente 1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su ambiente molecular. Consecuencias: La energa de S1 es parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia; no todas las molculas inicialmente excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por fluorescencia, existen otros procesos.

3: Emisin de fluorescencia: un fotn se emite, lo que permite el retorno al fluorforo al nivel S0. A causa de la disipacin de energa durante el estado excitado, la energa de este fotn es menor. La diferencia de energa es llamada Stokes shift (hEX hEM) que es fundamental para la sensibilidad de las tcnicas de fluorescencia, ya que la emisin del fluorforo permite distinguirse del background.

Espectro de Fluorescencia

El mismo fluorforo puede ser repetidamente excitado y detectado. Para molculas poliatmicas en solucin las transiciones electrnicas son reemplazadas por un espectro de energa llamado espectro de excitacin de fluorescencia y de emisin. El ancho de banda del espectro es un parmetro importante para cuando dos fluorforos son detectados simultneamente. El espectro de emisin de fluorescencia es independiente de la longitud de onda a la cual se excita. La intensidad de emisin es proporcional a la amplitud del espectro de excitacin a la longitud de onda de excitacin. Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los mximos de absorcin del fluorforo. Los espectros de absorcin y de fluorescencia de un fluorforo en general estn prximos ( ms cortas y ms largas respectivamente). Esto es importante en la eleccin de los filtros. La intensidad de la seal depende de los mismos parmetros que la absorbancia, aunque tambin de la fuente de excitacin (comnmente un lser de ion argn, longitud de 488 nm) y de la eficiencia de recoleccin del detector.

Las muestras biolgicas marcadas con fluorescencia contienen tpicamente ms de una especie fluorescente, haciendo que el aislamiento de la seal sea compleja. Otras seales pticas (como S2) quizs correspondan al background o a una segunda sonda fluorescente. La deteccin de autofluorescencia puede ser minimizada por la seleccin de filtros adecuados que reduzcan la transmisin de E2 respecto de E1.

Quenching de fluorescencia En muestras biolgicas el fluorforo est en solucin y puede interaccionar con otras molculas. Como consecuencia de esta interaccin se puede producir una perdida de emisin fluorescente. Es un proceso de desexcitatcin no radiativa provocado por una molcula ajena al fluorforo (compuestos no fluorescentes), que recibe el nombre de quencher. Al proceso se lo denomina "quenching" de la fluorescencia

Fluorforos
Generalmente son compuestos heterocclicos o hidrocarbonos poliarmaticos: molculas rgidas (varios niveles a los cuales pueden ser excitados; en el retorno, al no rotar no emite calor y s luz)

Rodamina 6G

Rodamina B

Isotiocianato fluorescena

Fluorescena Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y excitacin caractersticos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero distinto espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).

Microscopa de fluorescencia

La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un filtro excitador que slo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiacin de excitacin.

Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorcin del fluorocromo. Que no llegue al ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromtica o no. Filtros:Excitador: Transparente a cortas bloqueando ms largas. Barrera: Transparente a largas bloqueando cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.

Inmunofluorescencia
Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo despus este
conjugado a los anticuerpos o antgenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de clulas, o cultivo de tejidos en capa nica. Cuando la reaccin es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producir fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluorforo o una enzima que cataliza una reaccin por la cual se emite fluorescencia

Clnica (Diagnsticos) Utilidades Investigacin (inmunohistoqumica, inmunofluorescencia)

Conjugacin: Tendremos Ac marcado con fluorforo y fluorforo libre. Cmo separamos? Mediante tamiz molecular o dilisis

Principios generales de marcacin de anticuerpos por sustancias fluorescentes

Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados Un buen conjugado debe tener: Fluorescencia intensa Reaccin especfica con los antgenos Depende de: Calidad y concentracin de los Acs en el suero

Propiedades de la sustancia fluorescente

Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople Tambin influyen: Intensidad de marcacin Homogeneidad de marcacin Presencia en el conjugado de otras molculas marcadas Anticuerpos

Para mayor especificidad utilizar antgenos puros para inmunizar

Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales Purificar la fraccin de Ig a marcar Verificar ttulo de anticuerpos Existe un estrecho paralelismo entre ttulo precipitante y fluorescente

Titulacin de reactivos: Ac 1 y Conjugado deben titularse.

Fluorocromos

El fluorocromo no unido se dializa o se separa por filtracin en geles. Disponibilidad filtros Intensidad de marcacin
Fluorocromo puede ser conjugado en un nmero variable a cada molcula de protena, resultando diferentes grados de marcacin. Mayor intensidad de marcacin, mayor intensidad

Marcacin excesiva: Disminucin del PI de las protenas Alteraciones en las propiedades inmunolgicas de los anticuerpos (6 7 molculas de fluorescena/ molcula de Ac es el lmite mximo) Quenching de fluorescencia (disminucin del rendimiento de emisin)

Homogeneidad de marcacin
Altamente marcadas: Fluorescencia inespecfica Medianamente marcadas: Resultados ms satisfactorios Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa

Eleccin de marcado para inmunoensayos

Marcado Mtodo de deteccin Ventajas Desventajas

Enzimtico

sustratos cromognicos detectados por abs Avidina/ Estreptavidina acoplada a marcadores Excitacin en UV y emisin en el visible deteccin en micro fluorescencia

Vida media alta. Alta sensibilidad

Mltiples pasos. Enzimas endgenas

Biotina

Vida media alta. Alta sensibilidad Deteccin universal Vida media alta Alta resolucin

Mltiples pasos. Biotinas endgenas.

Fluorescencia

Autofluorescencia quenching

Mtodo enzimtico

Sensibilidad Resolucin

Mtodo fluorescencia

Biotina/Avidina (o estreptavidina)
Avidina PI 10 (muy reactiva); estreptavidina, menos inespecificidad

Ac se purifica

Conjugacin a biotina

Avidina/estreptavidina se marcan con fluorforo o enzima

Ac 2 conjugado a biotina

estreptavidina
AP AP AP

Enzima biotinilada

Para tejidos que expresan biotina: Agregar estreptavidina al tejido + Enzima biotinilada (debera dar negativo) Bloqueo con avidina + 3 biotinas en tejidos que expresan y luego inicio con Ac 1

Enzima Peroxidasa de rabanito

Ventaja Buenos conjugados Sensible Varios sustratos disponibles

Desventajas Actividad endgena en clulas de sangre y mdula. Sustratos solubles sensibles a luz Actividad endgena en algunos tejidos

Recomendado Inmunohistoqca e inmunoblots (sustratos insolubles: DAB) Inmunoensayos (solubles: OPD) Inmunoensayos (PNPP) Inmunoblots (BCIP)

Fosfatasa Alcalina

Sensible Se conjuga fcil

-Galactosidasa

Muy baja actividad endgena. Sustratos solubles e insolubles Sensible

Se inactiva fcil Menos sustratos disponibles

Cuando actividad endgena es un problema persistente

Bloquear actividad endgena: pre tratamiento con perxido de hidrgeno; levamisole (I! de fosfatasas)

Inmunofluorescencia directa
Utiliza un solo anticuerpo

Inmunofluorescencia indirecta
Utiliza un 2 anticuerpo conjugado

Anticuerpo 2 Anticuerpo 1 Antgenos Anticuerpo 1

Antgenos

Ventajas

Se necesitan pocos pasos Menos problemas de background Posibilidad de doble marcacin

El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para distintas reacciones Son comerciales Se evita la disminucin de afinidad del Ac 1

Desventajas

Menor sensibilidad (nec. mucho Ac 1)

Seal poco amplificada

Es necesario purificar el Ac El Ac puede perder afinidad

Se necesitan muchos pasos de tincin Con ag mltiples se necesita que los Ac 1 sean de distintas especies

Ac Policlonal Fuerza de seal Excelente

Ac Monoclonal Regular a Buena

Pool de Ac monoclonales Excelente

Especificidad

Buena, pero a veces el background es alto

Excelente pero con posible reaccin cruzada Especfico

Excelente

Ventajas

Seal fuerte

Seal fuerte Especfico Disponibilidad

Desventajas

No renovable Background Se necesita titular

Baja seal

Algunos ejemplos
Mtodo Puente: PAP
(perpxidasa anti peroxidasa)
3 Capa: complejo PAP de la especie A

Mtodo Puente de Igs

2 Capa: Ac contra Ig de A

3 Capa: Inmunoglobulina antimarcador obtenida en A

2 Capa: Ac contra Ig de A 1 Capa: Ac contra x en especie A

1 Capa: Ac contra x en especie A

Es una reaccin Ag/Ac, evita modificacin de Ac por acople

Inmunofluorescencia de superficie

Inmunofluorescencia citoplasmtica

- Lavado de clulas -Bloqueo con suero normal de la especie del Ac 2

- Lavado de clulas -Resuspender el pellet y hacer frotis - Secar y fijar con metanol fro 30 -Hidratar los portas en PBS 30 -Bloqueo con suero normal de la especie del Ac 2 - Agregado de Ac 1 e incubacinen cmara hmeda

- Agregado de Ac 1 e incubacin
- Lavados - Agregar el Ac 2 conjugado a fluorocromo e incubar - Lavados

- Resuspender el pellet
- Hacer el frotis en porta - Secar y fijar con metanol fro 30

- Lavados en Koplin
- Agregar el Ac 2 conjugado a fluorocromo e incubar en cmara hmeda - Lavados -Montar con PBS

Importante: Permeabilizar Tb se fija con formamida y se permeabiliza con Tritn X100

Controles????
- Excluir Ac 1: Especificidad del Ac 2
- Control negativo :Utilizar clulas o tejidos que no expresen el antgeno - Revelado con suero normal 1 - Medicin de fluorescencia endgena - Medicin de fluorescencia de un tejido o clulas que expresen el antgeno

- Control positivo: desplazar el Ac 1 por agregado de antgeno libre

- Control isotipo: Ac (IgG) no especfica Bloqueos con protenas no relacionadas o con suero normal

Doble marcacin

Que no estn superpuestos: combinar la marca o el sistema de deteccin Detecta dos antgenos diferentes Cuidado con reaccin cruzada Que estn superpuestos: combinar dos fluorocromos Marcando los Ac 1 (utilizar Ac Mo) (Fluorescena + rodamina) Reactivos de distinta especie, clase o subclase. 2 anti especie Reacciones secuenciales (hay reasociaciones y no disociaciones)