TRABAJO PRÁCTICO Nº 3

Cátedra: Biotecnología

Profesores:

Dra. Ing. Elisa Benitez

Esp. Bqca. Laura Stella

Mg. Ing. Rocío García

Alumnos:

Bidermann, Federico

Gualini, Fernando G.

Silva, Agustín

Zamar, Joaquín

Año 2020
Biotecnología Producción de PHA

Introducción

La producción de bioplásticos (PHA) está tomando importancia a nivel global por la creciente
necesidad de suplantar a los plásticos convencionales. Los bioplásticos poseen una gran
capacidad de degradación, ya que pueden ser completamente degradados por las bacterias que
los producen y otros microorganismos como hongos y otras bacterias.

Estos poseen características similares a los plásticos derivados del petróleo, sin embargo,
presenta una gran desventaja como lo es el alto costo de producción debido a que las bacterias
que se utilizan para producirlos, tienen un requerimiento nutricional importante. En los últimos
años se han desarrollado muchas investigaciones para poder disminuirlo y hacer posible la
producción a gran escala, inclusive se está estudiando la posibilidad de producción de PHA con
microorganismos foto autotróficos que tengan menor requerimiento nutricional que las
bacterias.

En el presente trabajo, nos centramos en la producción de PHA a partir de bacterias. El primer

PHA conocido fue el poli(3-D-hidroxibutirato) producido por el Bacillus megaterium. Sin
embargo, existe una amplia variedad de bacterias que tienen la capacidad de producirlos:

 Ralstonia eutropha produce PHB (polihidroxibutirato)

 Escherichia coli produce PHA
 Azotobacter produce PHB
En este trabajo nos centramos específicamente en la producción de bioplásticos a partir de la
Ralstonia eutropha.

Los objetivos del presente trabajo son:

 Seleccionar el microorganismo adecuado para la obtención del biopolímero.

 Caracterizar al microorganismo y dar a conocer su metabolismo de manera detallada.
 Seleccionar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo
 Diseñar un biorreactor para su producción eficiente a nivel industrial

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Microorganismo seleccionado

Como se mencionó anteriormente, seleccionamos la bacteria Ralstonia eutropha para producir

polihidroxialcanoatos. Esta es una bacteria Gram (-), no patógena, es capaz de degradar una
gran variedad de compuestos cloro aromáticos y contaminantes químicamente relacionados.
Tiene una temperatura óptima de crecimiento de 30 °C. Puede desarrollarse en ambientes tanto
aeróbicos como anaeróbicos. Su taxonomía es la siguiente:

Taxonomía:
•Dominio: Bacteria

•Filo: Proteobacteria

•Clase: Beta-proteobacteria

•Orden: Burkholderiales

•Familia: Burkholderiaceae

•Género: Ralstonia

Condiciones nutricionales y producción de energía

Como todo organismo vivo, la Ralstonia eutropha necesita de nutrientes para vivir y mantener
sus funciones vitales. Esta bacteria tiene la particularidad de ser muy versátil en cuanto a
requerimientos nutricionales, ya que tiene la capacidad de adaptarse a muchos ambientes. Esta
pertenece al Phylum Proteobacteria, que son bacterias gram negativas que presentan una gran
diversidad metabólica en las que están incluidas la mayoría de las bacterias con importancia
clínica, industrial y agrícola. Dentro de este phylum, pertenece a la subdivisión β (beta) y está
incluida dentro de las bacterias oxidantes del hidrógeno, junto con el género Alcaligenes.

Esta bacteria tiene un metabolismo quimiolitoautotrófico facultativo, ya que pueden utilizar

compuestos inorgánicos como fuente de energía. Además, las cepas de la R. eutropha pueden
utilizar hidrógeno, dióxido de carbono y compuestos orgánicos como otra fuente de energía
cuando actúan como quimioorganotróficos, pudiendo alternar de un metabolismo a otro según
las condiciones nutricionales del ambiente

Es un organismo modelo para la oxidación del hidrógeno ya que puede nutrirse del mismo como
única fuente de energía, debido a que la misma posee tres diferentes hidrogenasas (hidrogenasa
unida a la membrana; hidrogenasa regulatoria; hidrogenasa soluble), que son diferentes a otras
hidrogenasas porque son tolerantes al oxígeno y no se inhiben por el monóxido de carbono.
Puede ser considerada como una hidrogenomona.

Cuando el oxígeno no está presente, puede usar diferentes rutas metabólicas para crecer. Puede
obtener energía por desnitrificación anaerobia y también puede metabolizar metales pesados.

Para este trabajo nos interesa la ruta metabólica que sigue cuando hay una fuente orgánica de
carbono presente y actúa de manera quimio heterótrofa.

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La ruta metabólica inicia con la glucólisis dentro del citoplasma de la bacteria, en el cual una
molécula orgánica actuará como aceptora de electrones. En primera instancia la glucosa se
fosforila con dos grupos fosfatos provenientes del ATP formando glucosa-6-fosfato. En esta
reacción se disipa energía. Posteriormente, la G6F se isomeriza y fosforila dando lugar a la
molécula fructosa-1,6-difosfato a la cual, la enzima adolasa, divide en dos moléculas:
dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehido-3-fosfato. Sobre la primera de ellas actúa la enzima
triosa fosfato isomerasa que transforma la dihidroxiacetona en G3P. Ambas moléculas de G3P
continúan oxidándose formando 1,3-difosfoglicérido. En esta reacción la enzima NAD+ acepta
dos electrones dando lugar a NADH2+. Este enlace se rompe liberando energía permitiendo la
formación de ATP a partir de ADP y fosfato. Luego las enzimas mutasa y enolasa producen
fosfoenol pirúvico, con un enlace de alto contenido energético que se rompe y sintetiza un mol
de ATP y un mol de ácido pirúvico.

En este punto, el ácido pirúvico se dirige hacia el mesosoma donde es decarboxilado

produciendo NADH2+ y una molécula de acetil CoA, que entrará al ciclo de ácido
tricarboxílicos.

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Ciclo de Krebs

Importancia de la Ralstonia eutropha en la biotecnología

 Esta bacteria es ampliamente estudiada por su capacidad de degradar una gran lista de
compuestos cloro aromáticos y otros contaminantes similares.
 También tienen la capacidad de metabolizar metales pesados
 Son importantes para la producción de PHAs y el estudio del metabolismo
quimiolitoautotrófico.
 También tienen la capacidad para desarrollarse sólo con hidrógeno y esto es estudiado
para la producción de diversos compuestos valiosos como metabolitos y polímeros.

Medio de cultivo para la obtención de PHA

Los medios de cultivos que se pueden utilizar para obtener este microorganismo pueden
contener fructosa, sulfato de amonio, fosfato diádico de potasio, fosfato monobásico de sodio,
sulfato de magnesio heptahidratado y solución de microelementos. [CITATION Mar18 \l 11274 ]
Cabe destacar que el poli-β-hidroxibutirato y los PHAs en general, son polímeros de reserva de
carbono y energía que se acumulan cuando la fuente de carbono se encuentra en exceso y hay
limitación de otro nutriente. Las células producen este tipo de polisacáridos para que en
momentos donde no haya una fuente de energía disponible, estas moléculas sean oxidadas para
liberar energía y dejarla disponible para reacciones de crecimiento y mantenimiento de la célula.

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Un ejemplo de un medio de cultivo de laboratorio para la obtención de PHA es el siguiente:

 Fructosa comercial 10g/l;

 Sulfato de amonio 2,75 g/l
 Fosfato diácido de potasio 2 g/l
 Fosfato monobásico de sodio 2 g/l
 Sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g/l
 Y solución de microelementos 2 ml/l:
o FeSO4 2 g/l, MnCl2 4H2O 0.03 g/l, CaCl2 2H2O 2 g/l, CuCl2 2H2O 0.01 g/l,
ZnSO4 7H2O 0.1 g/l, H3BO3 0.3 g/l, CoCl2 6H2O 0.2 g/l, NiCl2 6H2O 0.02 g/l y
Na2MoO4 2H2O 0.03 g /l en solución 0.1 N de HCl

El pH durante la fermentación se debe mantener alrededor de 7.

Para la producción industrial se deben utilizar otros tipos de sustratos. Estos incluyen otras
fuentes de carbono más económicas ya que son residuos de otras industrias. Por ejemplo, el
bagazo de caña hidrolizado.

Sustrato Tiempo (h) Biomasa obtenida PHA (% p/p)

(g/l)
Aceite de soya 48 32 86
Glucosa 50 164 76
Glucosa/ac. 46 158 74
Propiónico
Fécula de mandioca 59 106 58
hidrolizada
Bagazo de caña 74 11 56,5
hidrolizado
Gluconato/ octanoato 48 5,1 40,9
Tabla obtenida de SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS: PLÁSTICOS DE
ORIGEN MICROBIANO, de la UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA.

Utilizar estos efluentes proporciona un valor agregado al producto ya que se parte de una
materia prima que representa un residuo y además abarata los costos de producción. Sin
embargo, caracterizar esta materia prima es más difícil dado que las condiciones de los residuos
varían constantemente y a veces no es posible llevar un control sobre las mismas.

Ruta metabólica para la producción de PHAs

La ruta metabólica que la bacteria Ralstonia eutropha ejerce para la obtención de

polihidroxialcanoatos (PHA) puede seguir cuatro diferentes caminos, dependiendo de la fuente
de carbono.

 Ruta I: A partir de la glucólisis, por la ruta de EmbdenMeyerhof Pamas (EMP)

 Ruta II: la ruta metabólica de la pentosa-fosfato
 Ruta III: acetoacetil-CoA procedente de la β-oxidación de ácidos grasos
 Ruta IV: síntesis de sustratos específicos.

Como generalmente se utiliza glucosa como fuente de carbono principal, a continuación,

describimos esta ruta:

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La glucólisis consiste en 10 reacciones enzimáticas consecutivas que convierten a la glucosa en

dos moléculas de piruvato, el cual es capaz de seguir otras vías metabólicas y así continuar
entregando energía al organismo. Luego el proceso sigue a través del ciclo de Krebs donde se
oxidan las moléculas de piruvato, produciendo el acetil-CoA. El resultado del ciclo es:
2CoASH, 2CO2, 2NAD+ y 2NADH.

Toda la cadena de producción de los polihidroxialcanoatos empieza a partir de acetil-CoA, en

una secuencia de reacciones catalizadas por las enzimas β-cetotiolasa, acetoacetil-CoA
reductasa y la poli(3-hidroxibutirato) sintetasa.

La enzima β-cetotiolasa a partir del Acetil-CoA produce acetoacetil-CoA y mediante la enzima

acetoacetil-CoA reductasa se produce el 3-hidroxibutiril-CoA, posteriormente la PHB sintetasa
produce una molécula de Poli-3-hidroxibutirato (PHB).

En síntesis, este microorganismo tiene la capacidad de producir Poli-3-hidroxibutirato a partir

de una materia prima compuesta por glucosa, o algún compuesto similar.

Comparación de estrategias para la producción industrial

Para llevar a cabo el proceso industrial se necesita elegir el tipo de fermentador o biorreactor.
Los biorreactores son sistemas o equipos que son construidos con el objetivo de proporcionar un
ambiente biológicamente activo, es decir, que dentro del mismo se pueda desarrollar el

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crecimiento y desarrollo del microorganismo seleccionado. El rol más importante que llevan a
cabo es otorgar la capacidad de tener un medio controlado a gran escala para producciones a
nivel industrial, donde se pueda llevar un correcto monitoreo de pH, temperatura, concentración
de oxígeno disuelto, y otros factores que puedan tener un impacto en el crecimiento de los
microorganismos y la formación del producto buscado en el proceso.

Es importante tener en cuenta que, en los bioprocesos, hay numerosas variables que modifican
el rendimiento en el biorreactor afectando a la formación del producto deseado, por lo tanto, hay
que tener definido de manera precisa las condiciones que tiene que cumplir el reactor en materia
de:

 Concentración de la biomasa inicial.

 Esterilidad para evitar contaminación con microorganismos ajenos al seleccionado
 Remoción correcta de calor
 Concentración de sustrato
 Velocidad de dilución
 Inhibición de productos
 Aireación
 Cinéticas relacionadas

La fermentación Batch es una estrategia para la producción muy popular ya que tiene costos de
operación muy bajos, no obstante, también posee bajos rendimientos de producción de PHA, ya
que las bacterias pueden llegar a degradar el PHA acumulado resultando en un bajo contenido al
final del proceso.

El proceso Fed-Batch en sí mismo tiene mayores rendimientos en la producción de PHA aunque

aún son considerados muy bajos cuando se trata con nitrógeno como nutriente limitante. La
solución más utilizada para solucionar el problema de bajo rendimiento es dividir el proceso en
dos etapas, un proceso denominado “Cultivo por lote alimentado”. En la primera etapa se
obtiene una concentración de biomasa lo más elevada posible sin limitación de nutrientes
esenciales, de forma que la célula se desarrolle en condiciones normales y en grandes
cantidades. (Batch)

Una vez obtenida una cantidad de biomasa deseada, se procede a la segunda etapa donde se
promueve la síntesis de PHA manteniendo la concentración del nutriente limitante baja (o nula
cuando es totalmente consumida), y la fuente de carbono debe estar disponible, de manera que
la producción del biopolímero por parte de la bacteria se incremente (fase Fed-Batch). En este
caso, el nutriente limitante es el nitrógeno, la fuente de carbono es la glucosa y la concentración
de PHA en base seca debería alcanzar un 80% en condiciones óptimas de cultivo.[ CITATION
Ran13 \l 11274 ]

El problema que conlleva este sistema Batch/Fed-Batch es una elevación en los costos de los
equipos ya que se necesitarían dos reactores. Otra solución que se propone es el cultivo
continuo en qumióstato para la producción de PHAs. En este método el caldo de cultivo es
continuamente reemplazado por medio estéril y la fuente de carbono es continuamente
alimentada en exceso y manteniendo uno o más nutrientes en concentraciones limitadas, de
manera que el cultivo esté constantemente en fase exponencial o log. A favor tiene que se puede
controlar fácilmente la velocidad de crecimiento específica y puede ser mantenida ajustando la
velocidad de dilución. [ CITATION Ran13 \l 11274 ]

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Tipo de reactor que se utilizara en la elaboración de PHA:

Hay varias formas de diseñar un reactor para la producción de bioclásticos con origen en la
ralstenia eutropha debido a su gran versatilidad para adaptarse a distintos ambientes que poseen
condiciones, como por ejemplo en reactores Fed-Batch en serie y continuos.

En los procesos en los que se utilizan reactores discontinuos secuenciales, reactores que se
logran destacar de los continuos por su fácil manejo y alta flexibilidad, ya que permiten cambiar
las condiciones de operación de manera sencilla, se pueden obtener como resultados altas
concentraciones de PHA en célula y muy buenas productividades, es decir alcanzar como
resultado un producto robusto en cuanto a pérdidas, la alimentación que ingresa al reactor lo
hace de forma intermitente para poder favorecer el almacenamiento de los polihidroxialcanoatos
en los lodos.

Por otro lado, compararemos los reactores secuenciales discontinuos viendo las características
que lo diferencian de un continuo. En los reactores continuos, las disposiciones de los reactores
pueden estar ubicados en serie cuando son más de uno, como se puede ver en la imagen.

Esquema del reactor a utilizar.

1.Puntos de muestreo; 2. Control de temperatura; 3. Control de pH; 4. Medidor de oxígeno

disuelto.

En nuestro trabajo realizaremos la elección de un reactor del tipo continuo debido a las
características que posee el mismo y nos favorecen en la producción de PHA:

•Control de Ph: Nuestra bacteria necesita un Ph de 7 para poder lograra un crecimiento de

manera optima. Por ello es importante tenerlo medido y controlado. Al utilizar un reactor
continuo el producto que sale lo hace con las mismas características constantes en el tiempo por

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lo tanto el ph no variara de manera significativa. A diferencia del Fed-Batch que necesita de

soluciones Buffer para poder controlar el Ph.

•Control de Crecimiento: En los reactores de tipo continuo la tasa de crecimiento puede ser
mantenida mediante un ajuste en la tasa de dilución.

•Disponibilidad de la metaria prima: Al trabajar con bagazo de caña de azúcar, el cual lo

disponemos en gran cantidad por la región, seria una buena fuente para poder utilizarla en el
reactor ya que no se tendría problemas con el abastecimiento.

•Capacidad: Como trabajamos con un proceso en dos etapas, se podrá dar lugar al crecimiento
de mayores bacterias y lograr un rendimiento sobresaliente comparándolo con un biorreactor
Fed-Batch.

•Rendimiento: ¿?????

Nuestro reactor cuenta posee un sistema de agitación y de aireación, lo cual permite que las
fermentaciones en ambas etapas se lleven a cabo de manera correcta. Como la temperatura
optima para el medio de cultivo es de unos 30°C no será necesario adquirir equipos de
enfriamiento para ajustar la temperatura. Con respecto a la velocidad optima de agitación
rondarara entre los 600 a 1000 rpm

Se muestra el sistema de cultivo continuo de dos etapas que consta de dos fermentadores de
jarra INFOR de 2 l. en la Fig. 1. La cultura continua de la primera etapa fue llevado a cabo en
una jarra de 2 l fermentador equipado con dos turbinas de disco de seis palas. Diez por ciento de
semilla Se usó cultivo para inocular el fermentador, y El volumen de la primera etapa fue de 1,2
l. Aireación la tasa fue de 1.5 v v − 1 min − 1 . Oxígeno disuelto (DO) la concentración se
controló por encima del 20% del aire saturación ajustando la velocidad de agitación de G. Du y
col. / Journal of Biotechnology 88 (2001) 59–65 61 600 a 1000 rev min − 1 para evitar la
limitación de OD. El pH se mantuvo a 7.0 agregando 28% (v v − 1 ) de agua amoniacal o 3 mol
l − 1 de solución de HCl. La temperatura de cultivo se ajustó a 30 ° C. La glucosa fue el
componente limitante del crecimiento en el cultura continua de primera etapa. Dilución
diferente las tasas se controlaron alimentando F1 continuamente mediante bomba peristáltica. El
caldo del reactor de primera etapa fue bombeado en el reactor de segunda etapa continuamente.
El ion amonio en la primera etapa fue traído a la segunda etapa, y más iones de amonio fue
llevado a la segunda etapa a alta velocidad de dilución Para mantener una alta relación C / N, un
También se alimentó medio fresco (F2) para mantener la concentración de glucosa del cultivo
de la segunda etapa en alrededor de 15 g l − 1 . El volumen de la segunda etapa. fue de 1,4 l. La
tasa de aireación fue de 1.5 v v − 1 min − 1 . La velocidad de agitación se controló de 800 a
1000. rev min − 1 para mantener el OD a más del 20% del aire saturación. La temperatura de
cultivo fue 30 ° C. El pH fue controlado a 7.0 por la alimentación de 3 mol l − 1 NaOH en lugar
de agua amoniacal en Esta etapa de la cultura.

. During operation, culture samples are taken at selected time

points to measure cell density. This data is then used to
construct a growth curve. Optimal growth is achieved when the

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culture reaches steady state, meaning that the cell density

remains constant.

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