Universidad Industrial de Santander

Facultad de Salud
Escuela de Microbiología
Micología-I semestre 2024

Guía Práctica #3
Preparación de medios de cultivo

En el laboratorio de rutina, muchas veces los hongos son cultivados en medios con componentes naturales tales
como, agar papa dextrosa (PDA, usualmente contiene el 2% de glucosa), agar extracto de malta (usualmente
contiene el 2% de malta), agar harina de maíz o de avena (Cornmeal o Oatmeal, usados para promover el
desarrollo de estructuras sexuales). Los medios para hongos usualmente tienen pH ácido (5-6) y son ricos en
carbohidratos (Deacon, 2013). Las células están constituidas fundamentalmente por macromoléculas y agua;
las primeras se forman a partir de la unión de monómeros específicos unidos por diferente tipo de enlaces
(Madigan et al., 2015). En el caso específico de los hongos donde los polisacáridos son constituyentes
estructurales y metabólicos, sus medios de cultivo requieren altas concentraciones de carbohidratos.

En el ambiente natural, los hongos realizan su nutrición por procesos de absorción de unidades solubles del
polímero, pocos hongos tienen la capacidad de producir enzimas específicas de degradación, la mayoría
obtiene las unidades de solubles disponibles por la acción de enzimas de otros hongos o microorganismos.

Para determinar los requisitos mínimos de nutrientes de un hongo, se debe cultivar en un medio líquido
químicamente definido, se evita el uso de agar porque contiene impurezas que pueden interferir en los ensayos.
En la Tabla 1 se presenta un medio típico que contiene solo sales minerales y glucosa. La mayoría de hongos
crecería en este medio, no obstante, algunos requerirán la adición de nutrientes específicos, de ahí que se usen
medios naturales, dado que estos aportan estos constituyentes, pero se desconoce su concentración.

Tabla 1. Medio químicamente definido para cultivo de hongos

Químico Cantidad
NaNO3 o NH4NO3 o L-asparagina o un sustituto que aporte 2,0 g.L-1
nitrógeno
KH2PO4 (solo o en buffer mezclado con K2HPO4) 1,0 g.L-1
MgSO4 0,5 g.L-1
KCl 0,5 g.L-1
CaCl2 0,5 g.L-1
FeSO4, ZnSO4, y CuSO4 0,005 g.L-1
Sacarosa o glucosa 20,0 g.L-1
Adaptado de Deacon, 2013 pág. 111

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Para el crecimiento de hongos en condiciones de laboratorio se deben favorecer los sustratos o la solución de
nutrientes (medio de cultivo) que le permita recibir los ingredientes químicos necesarios para realizar los
procesos de síntesis o de producción de energía. No obstante, también se han elaborado medios que no están
relacionados con proceso de crecimiento.

Los nutrientes se han clasificado en: macronutrientes, si se requieren en grandes cantidades; y

micronutrientes, si se necesitan en menor cantidad o en trazas. Los hongos son heterótrofos porque usan una
fuente de carbono orgánica; y quimiorganótrofos porque oxidan compuestos orgánicos como fuente de energía,
por tanto, en comparación con los medios de cultivo para bacterias, los medios para hongos requieren una
concentración mayor de monosacáridos, el más usado es la glucosa. La fuente de nitrógeno puede ser
sustentada por la adición de nitrógeno inorgánico u orgánico, por lo general se usa nitrato o amonio, sin
embargo, algunos hongos no pueden usarlos como fuente nitrógeno por ello se debe añadir una fuente de
nitrógeno orgánico como el aminoácido asparagina, es el caso de varios miembros del grupo basidomicota
(Deacon, 2013).

Carbono. Como se ha mencionado los hongos son heterótrofos y quimiorganótrofos, se ha comprobado que
pueden usar una amplia gama de nutrientes como fuentes de carbono, desde los más simples como es el caso
del metano hasta los muy complejos como la lignina, por ello algunos hongos se usan en procesos
biotecnológicos de degradación. La gran mayoría usa monosacáridos como la glucosa. Es necesario aclarar que,
si bien pueden usar fuentes complejas de carbono, la limitante es romperlas para acceder a azucares solubles
que se difundan a través de la pared o entren a las células vía proteínas específicas de transporte (Cepero et al.,
2012).

Nitrógeno. Es requerido en grandes cantidades y puede ser un factor limitante para el crecimiento de los
hongos en ambientes naturales. Los hongos no fijan nitrógeno atmosférico, pero usan formas combinadas de
nitrógeno. Todos los hongos pueden usar aminoácidos como fuente de nitrógeno, a menudo necesitan un solo
aminoácido, como el ácido glutámico o la glutamina, y a partir de este puede producir todos los otros
aminoácidos esenciales mediante reacciones de transaminación. Muchos hongos pueden usar amonio (NH4) o
amoniaco, después de la absorción, el amoníaco/amonio se combina con ácidos orgánicos, generalmente para
producir ácido glutámico (a partir del ácido α-cetoglutarico) o ácido aspártico; entonces los otros aminoácidos
pueden formarse mediante reacciones de transaminación. Sin embargo, aunque muchos hongos pueden usarlo
es una limitante porque los hongos pueden usar el NH4+ a cambio de H+ y esto puede hacer que baje
rápidamente el pH del medio de cultivo a 4.0 o menos, inhibiendo el crecimiento de muchos hongos. Otra
fuente alternativa de nitrógeno es el nitrato, al que convierte en amonio mediante las enzimas nitrato reductasa
y nitrito reductasa. Existen hongos que no pueden usar nitrato como fuente nitrógeno, dentro de ellos están
Saccharomyces cerevisiae y muchos miembros de la división Basidiomycota (Deacon, 2013).

Fósforo. Los hongos son expertos en la obtención de fósforo en el ambiente natural y lo hacen de diversas
maneras. Al igual que los otros microorganismos requieren cantidades significativas de fósforo en forma de
fosfatos para la producción de fosfatos de azúcar, ácidos nucleicos, ATP, fosfolípidos de membrana, entre otros
(Madigan et al., 2015).

Hierro. El hierro se necesita en cantidades relativamente pequeñas, pero es esencial como donador y aceptor
de electrones en los procesos celulares, incluido el sistema de citocromo en la respiración aeróbica. También se
requiere como constituyente de metaloproteínas, que para cumplir su función requieren la presencia de un ion
metálico, en este caso del hierro (Sánchez, 2019).

En la Tabla 2 se describen los macronutrientes, su función celular y la forma en la que se pueden encontrar en
el ambiente.

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Tabla 2. Macronutrientes y función celular en los hongos
Elemento Función celular Fuente
Carbono (C) Hace parte de la estructura celular, polisacáridos de compuestos orgánicos
pared, y se requiere para los procesos catabólicos y la (azúcares)
generación de ATP.
Hidrógeno (H) El 90% de los compuestos tienen hidrógeno y hace Protones desde medio
parte de los enlaces químicos como los puentes de ambiente acídico
hidrógeno.
Oxígeno (O) Permite la generación de energía en los organismos O2, Aire
aerobios porque es el aceptor final de electrones.
Nitrógeno (N) Importante en las proteínas los ácidos nucleicos y en NH3, NO3 -,

otros constituyentes celulares aminoácidos, urea

Fósforo (P) Síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos, PO43-
transducción de energía y estructura de membrana
Azufre (S) Componente estructural de la cisteína y metionina; se H2S, SO42-, compuestos
presenta en las vitaminas biotina, tiamina, ácido orgánicos con azufre
lipoico, y en la coenzima A. Participa en el transporte (metionina), sulfuros
de electrones en los clusters Fe-S metálicos (FeS, CuS,
ZnS, NiS, etc)
Potasio (K) Componente de enzimas, varias implicadas en la K+ en solución, o como
síntesis de proteínas, balance iónico y actividad sales de K
enzimática.
Magnesio (Mg) Estabilizador de los ribosomas, las membranas Mg2`+ en solución, y
celulares y los ácidos nucleicos y también se requiere como sales de magnesio
para la actividad de muchas enzimas. Estructura de
células y organelos.
Sodio (Na) No es requerido por todos los organismos, y su Na+ en solución, o como
necesidad es reflejo del ambiente de crecimiento del NaCl y otras sales de
microorganismo sodio
Calcio (Ca) Está involucrado en el crecimiento del ápice en los Ca2+ en solución, como
hongos filamentosos, se ha observado con los ápices CaSO4 y otras sales de
se encuentran gran cantidad de canales de calcio. calcio
Igualmente cumple funciones de señalización.
Posible mensajero secundario en señales de
transducción.
Adaptado de Madigan et al., 2015 y Kavanagh, 2018.

Dentro de los elementos trazas se encuentran los metales de transición biogénicos (Fe 2+, Mn2+, Mo2+, Cu2+,
Ni2+, Co2+ y Zn2+). En la Tabla 3 se describen algunas de sus funciones.

Tabla 3. Funciones elementos de transición biogénicos

Elemento Función Fuente
Hierro Respiración celular, es un elemento clave para los citocromos y las Sales férricas: Fe3+
proteínas implicadas en el transporte de electrones que contienen hierro y quelado por
azufre. Función catalítica y de asistencia catalítica. Presente en proteínas sideróforos y liberado
hemo y citocromos. como Fe2+ dentro de la
célula
Manganeso Hace parte de metaloproteínas, superóxido dismutasas de las Sales de Mn2+
mitocondrias. Estabilización de enzimas degradadoras de lignina.
Molibdeno Función catalítica. Metabolismo del Nitrato y Vitamina B12 Na2MoO4
Cobre Hace parte de las proteínas mitocondriales y del citoplasma que actúan Sales de Cobre
como metalochaperonas o en procesos oxidativos. Función catalítica y de
asistencia catalítica. Pigmentos redox
Níquel Actividad ureasa Sales de Ni2+
Zinc Es un ion más estable que el cobre y el hierro en medios oxigenados, por Sales de Zn2+
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ello participa en múltiples procesos biológicos. Afecta la actividad de una
gran variedad de moléculas, incluyendo factores de transcripción, enzimas
de todas las clases, adaptadores, transportadores, factores de crecimiento y
sus receptores. Las metaloproteínas dependientes de zinc son las más
abundantes y estructuralmente diversas en la naturaleza. Estabilizador
electrostático.
Cobalto Cobalamina y coenzimas Sales de Cobalto
Adaptado de Kavanagh, 2018 y Sánchez, 2019.

La selección del medio de cultivo depende del propósito de uso, algunos de dichos propósitos se mencionan a
continuación:
1. Aislamiento: Contienen sustancias nutritivas que favorecen el crecimiento del hongo de interés o
inhibidores del desarrollo de biota acompañante.
2. Determinación o identificación: Se obtienen óptimas condiciones de esporulación, producción de color sea
por el color de propágulos y micelio o por la producción de pigmento, facilitan la formación de estructuras
específicas de reproducción sexual o asexual.
3. Conservación: Inducen estados de latencia en el hongo, permitiendo mantener su viabilidad por periodos
de tiempo relativamente largos.

En el artículo de Rezusta se menciona otra clasificación.

Objetivos
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:
• Identificar las diferentes clases de medios de cultivo utilizados para cultivo de hongos.
• Establecer la función de los macro y micronutrientes que comúnmente constituyen un medio de cultivo.

Materiales
✓ Erlenmeyers de 500 ml (16) ✓ NaNO3
✓ Probetas de 250, 500 y 1000 ml (8) ✓ K2HPO4
✓ Balanza ✓ MgSO4. 7H2O
✓ Plancha de calentamiento y agitación ✓ KCl
✓ Agitadores magnéticos ✓ FeSO4
✓ Saca moscas ✓ Sacarosa
✓ Licuadora industrial ✓ Glucosa
✓ Guantes de protección para altas ✓ ZnSO4. 7H2O al 1%
temperaturas* ✓ CuSO4. 5H2O al 1%
✓ Varillas de agitación ✓ Rosa de Bengala
✓ Papel para pesar ✓ Agua destilada
✓ Espátulas o bajalenguas ✓ Azúcar Manuelita*
✓ Papa pardo pastusa (100 g) ✓ Agar Agar
✓ Zanahorias (5 Unidades) ✓ Autoclave
✓ Tomates (6 Unidades) ✓ Cloranfenicol
✓ Remolacha pequeña (1 Unidad) ✓ Cajas de petri estériles
✓ Espinacas (2 tazas) ✓ Carbonato de Calcio
✓ Lechuga rizada (2 hojas) ✓ Cinta de enmascarar*
✓ Tallos de apio (5 Unidades) ✓ Fósforos*
✓ Perejil (1/4 taza) ✓ Implementos de protección personal (gafas,
✓ Cuchillas de bisturí o cuchillo* guantes, tapabocas, gorros, polainas)*
✓ Mango de bisturí *Material que deben traer los estudiantes
✓ Gasa

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Procedimiento

PDA Papa Dextrosa Agar*

Pelar las papas
Pesar 20 g de papa
Picar y poner a hervir en 100 mL de agua hasta que se deslíen.
Filtrar con una gasa y el filtrado llevarlo a 100 mL con agua destilada.
Agregar 2 g de azúcar y 1,2 g de agar
Hervir
Esterilizar en autoclave a 250°F por 15 a 20 minutos.
Dejar enfriar hasta que se soporte el recipiente en el dorso de la mano.
Servir las cajas de Petri estériles con 10 mL de medio aproximadamente en caja pequeña.
Dejar enfriar hasta solidificar.

Agar Zanahoria-Papa*
Pelar las papas
Pelar las zanahorias
Pesar 20 g de cada uno
Picar y poner a hervir en 100 mL de agua hasta que se deslía.
Filtrar con una gasa y el filtrado llevarlo a 100 mL con agua destilada.
Agregar 2 g de azúcar y 1,2 g de agar
Hervir
Esterilizar en autoclave 250°F por 15 a 20 minutos.
Dejar enfriar hasta que se soporte el recipiente en el dorso de la mano.
Servir las cajas de Petri estériles con 10 mL de medio aproximadamente en caja pequeña.
Dejar enfriar hasta solidificar.

Agar Tomate*
Pelar los tomates
Pesar 20 g
Picar y poner a hervir en 100 mL de agua hasta que se deslía.
Filtrar con una gasa y el filtrado llevarlo a 100 mL con agua destilada.
Agregar 2 g de azúcar y 1,2 g de agar
Hervir
Esterilizar en autoclave a 250°F por 15 a 20 minutos.
Dejar enfriar hasta que se soporte el recipiente en el dorso de la mano.
Servir las cajas de Petri estériles con 10 mL de medio aproximadamente en caja pequeña.
Dejar enfriar hasta solidificar.

Agar Alpiste*
Pesar 7 g de alpiste (Guizotia abyssinica)
Moler las semillas y añadir 35 mL de agua destilada
Filtrar con una gasa y el filtrado llevarlo a 100 mL con agua destilada.
Agregar 1 g de azúcar y 1-5 g de agar
Hervir
Esterilizar en autoclave a 250°F por 15 a 20 minutos.
Dejar enfriar hasta que se soporte el recipiente en el dorso de la mano.
Servir las cajas de Petri estériles con 10 mL de medio aproximadamente en caja pequeña.
Dejar enfriar hasta solidificar.

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Agar Czapek-Dox
NaNO3 2,0 g.L-1
K2HPO4 1,0 g.L-1
MgSO4. 7H2O 0,5 g.L-1
KCl 0,5 g.L-1
FeSO4 0,01 g.L-1
Sacarosa 30,0 g.L-1
Agar 20,0 g.L-1
ZnSO4. 7H2O 1 mL de 1 %
CuSO4. 5H2O 1 mL de 0,5 %

Hervir
Esterilizar en autoclave a 250°F por 15 a 20 minutos.
Dejar enfriar hasta que se soporte el recipiente en el dorso de la mano.
Servir las cajas de Petri estériles con 10 mL de medio aproximadamente en caja pequeña.
Dejar enfriar hasta solidificar.

Agar V8
Extracto de jugo V8. Para preparar un litro de extracto se requieren: 4 zanahorias, 5 tomates, 1 remolacha, 2
tazas de espinacas, 2 hojas de lechuga rizada, 5 tallos de apio y ¼ de taza de perejil. Los vegetales se lavan con
agua corriente para retirar partículas contaminantes, posteriormente se lavan con hipoclorito 5000 ppm y se
lavan con abundante agua corriente para retirar los restos de hipoclorito. Se pelan las zanahorias, los tomates y
la remolacha. Se cortan todos los ingredientes en pedazos pequeños, se licua a máxima velocidad, si es
necesario se añaden 100 mL de agua destilada, se sigue licuando, si es necesario, se pueden añadir hasta 400
mL de agua destilada. Posteriormente, se filtra a través de gasa, se coloca en una probeta y se añade agua
destilada hasta completar el litro de extracto. Se esteriliza en autoclave 121ºC, 15 libras de presión por 15 a 20
minutos.

Para 1 litro de agar V8 se añaden: Extracto de jugo V8, 200 mL.L-1; Carbonato de calcio, 3g.L-1; Rosa de
bengala, 0,03 g.L-1; y Agar-agar, 15 g.L-1. Se colocan en erlenmeyer en una placa de calentamiento y agitación
hasta que hierva y se esteriliza en autoclave 121ºC, 15 libras de presión por 15 a 20 minutos.

Agar Rosa de Bengala o Martin

Peptona 5,0 g.L-1
Dextrosa 10,0 g.L-1
K2HPO4 1,0 g.L-1
MgSO4. 7H2O 0,5 g.L-1
Cloranfenicol 0,1 g.L-1
Rosa de bengala 0,05 g.L-1
Agar 15,0 g.L-1

*Para los caldos se utiliza el mismo procedimiento, pero sin adicionar el agar, no necesita hervirse.

Discusión
Revisar cada uno de los componentes del medio que preparó y realizar un cuadro en donde se indique la
función de cada uno de los componentes. Buscar el fundamento de cada medio de cultivo preparado.

Post-laboratorio.

1. Realizar lectura comprensiva del apartado 3,4 sobre medio de cultivo del artículo de Rezusta et al., 2001
y elaborar un mapa conceptual.
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2. Complete el siguiente cuadro con la información sobre medios de cultivo para hongos.

Cuadro 1: Características de los medios de cultivo utilizados para aislamiento e identificación de hongos.
Medio de Componentes Fundamento utilidad del medio
cultivo
Mycosel
Sabouraud
BHI
Myco F/Lytic

Referencias bibliográficas

1. Cepero, M., Restrepo, S., Franco, A., Cardenas, M. y Vargas, N. 2012. Biología de los hongos. Universidad
de los Andes. 497 p. ISBN. 978-958-695-701-4.
2. Deacon, J. 2013. Fungal Biology. Wiley-Blackwell. 4 edición. ISBN. 978-140-51-3066-0.
3. Kavanagh, K. 2018. Fungi Biology and application. John Wiley & Sons, Inc. ISBN 9781119374329.
4. Madigan, M., Martinko, J., Bender, K., Buckley, D., Stahl, D. 2015. Brock Biología de los
Microorganismos. 14 ed. Editorial Pearson Educación, Madrid. 1136 p. ISBN. 978-84-9035-2.
5. Sánchez, C. 2019. Función de las metalochaperonas COG0523 en la adpatación del patógeno humano
Aspergillus fumigatus a la carencia de zinc y en vrulencia. Tesis de doctorado Microbiología y Genética
Molecular. Universidad de Salamanca. 162 p.
6. Rezusta, A., Sánchez, A., y Gil, A. 2001. Fundamentos básicos para el diagnóstico Micológico. Medios de
Cultivo. Revista Iberoamericana de Micología. P. 3-4 a 3-17.

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