DETERMINACIÓN DE HONGOS Y LEVADURAS

INTRODUCCION:
Levaduras.- Las levaduras son hongos que forman sobre los medios de cultivo
colonias pastosas, constituidas en su mayor parte por células aisladas que suelen ser
esféricas, ovoideas, elipsoideas o alargadas. Unas pocas presentan hifas. Las
dimensiones pueden oscilar de 1 a 9 µm de ancho y 2 a más de 20 µm de longitud
según la especie, nutrición, edad y otros factores[ CITATION Car01 \l 3082 ].

Las levaduras pertenecen a dos clases de hongos ascomicetos o basidiomicetos,

aunque muchas de ellas se presentan comúnmente en la forma imperfecta. Las
levaduras ascomicéticas forman ascas libres, con 1 a 8 ascosporas, y en las especies
hifales las ascas están desnudas. Las asoporas de las levaduras son algo más
resistentes al calor y la desecación que las células vegetativas, si bien tienen mucha
menor resistencia térmica que las esporas bacterianas, por lo que mantienen la
viabilidad de la especie durante los cambios adversos del medio ambiente.

Hongos.- También llamados Eunicita son una clase definida de microorganismos, la

mayor parte de los cuales son formas de vida libre, que actúan como putrefactores en el
ciclo energético. De las más de 90 000 especies conocidas, menos de 200 se han
reportado como causantes de enfermedades en humanos. Estos trastornos tienen
características clínicas y microbiológicas singulares y se están incrementando en
individuos con inmunodepresión.

La estructura química de la pared celular en los hongos es notablemente diferente de la

observada en células bacterianas porque no contiene peptidoglucano, glicerol, ácido
teicoico de ribitol o lipopolisacáridos. En su lugar, los polisacáridos manano, glucanos y
quitina se encuentran en estrecha asociación y con proteínas estructurales las
manoproteínas son polímeros de manosa (manano) que se encuentran en la superficie
de la matriz estructural de la pared celular, donde se encuentran unidas a proteínas.

FUNDAMENTO TEORICO:
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente,
pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en
equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la
elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la
descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja
competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el
crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles
de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de
almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la
irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos
fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus
derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias,
etc.

Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos
como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar
problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia
al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos
no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también
causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos.

La identificación y clasificación de los mohos se basa en observaciones macroscópicas

y microscópicas.

Hifas y micelio. El talo de los mohos está formado por una masa de filamentos
ramificados, llamados hifas, llamándose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas
pueden ser sumergidas o aéreas. También se pueden clasificar en hifas vegetativas o
en crecimiento, las cuales se encargan de la nutrición del moho, y en hifas fértiles o
hifas que producen los órganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos:
septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no
septados cenocíticos, cuyas hifas están formadas por cilindros sin tabiques
transversales. Este tipo de hifas posee núcleos diseminados a lo largo del cilindro y se
les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados
órganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo los rizoides o “anclajes” de los
géneros Rhizopus o Absidia, la célula basal del género Aspergillus y la ramificación
dicotómica, o en forma de Y, del género Geotrichum.

Órganos o estructuras reproductoras.- Los mohos se reproducen principalmente por

medio de esporas asexuales. Algunos mohos también producen esporas sexuales. A
tales hongos se les denomina “perfectos”, los cuales se dividen en Oomycetes y
Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son
septados, en contraposición a los mohos “imperfectos”, Fungi Imperfecti, los cuales sólo
poseen esporas asexuales.

Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son
pequeñas, ligeras y resistentes a la desecación. Se diseminan fácilmente por la
atmósfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos
principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3)
esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas fértiles
denominadas conidióforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro
de ningún receptáculo, en contraposición a las esporangiosporas, las cuales se
encuentran dentro de un esporangio o receptáculo, situado en el extremo de una hifa
fértil, el esporangióforo. Las artrosporas se forman por fragmentación de una hifa. El
extremo engrosado del esporangióforo se denomina columnela y adopta formas típicas
en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios
comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una célula
especializada, el esterigma o fiálide situada en el extremo del conidióforo.

Propiedades fisiológicas. En comparación con la mayoría de las levaduras y de las

bacterias, la mayoría de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible.
Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en
algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los
mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces de crecer bien a
temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría se encuentra alrededorde
los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son termófilos. Son aerobios,
esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos.
Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH
comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. Son capaces de
utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen
enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción industrial de
las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas. Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón,
M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de
Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. Versión para Administrador de
Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química, UNAM 3

Algunos géneros de mohos importantes en alimentos.

Mucor. Intervienen en la alteración de algunos alimentos y se utilizan en la fabricación

de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificación del almidón, para la maduración de
quesos y para la fabricación de algunos alimentos orientales.

Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy común e interviene en la

alteración de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc.

Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen
en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad
para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la producción industrial
de ácido cítrico y glucónico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricación
de ciertos alimentos orientales y en la obtención de enzimas. Se han reportado casi 50
especies de Aspergillus como productores de metabolitos tóxicos denominados en
general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las denominadas aflatoxinas
(producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la ocratoxina A producida por A.
ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina producida principalmente por A.
versicolor; el ácido ciclopiazónico producidas por A. flavus y A. tamarii. La citrinina,
patulina y ácido penicílico también son producidas por especies de Aspergillus, las
tóxinas tremorgénicas son producidas por A. terreus (territremas), A. fumigatus
(fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina). Las aflatoxinas son derivados de la
difurancumarina. Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se producen en la naturaleza por los
mohos ya mencionados. Las letras B y G se refieren a los colores de flurescencia por
sus nombres en inglés ( azul y verde, respectivamente) observados bajo longitudes de
onda en la región UV, y los subíndices 1 y 2 se refieren a sus patrones de separación
cromatográficos. Las aflatoxinas M1 y M2 se producen por la hidroxilación de las
respectivas aflatoxinas B. La aflatoxina B1 tal vez sea el carcinógeno de hígado más
potente para animales incluyendo al humano. La ocratoxina A y la citrinina afectan la
función renal. Las toxinas tremorgénicas afectan el sistema nervioso central.

Penicillium. Es otro género de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los

alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P
italicum producen la podredumbre de frutas cítricas. Las especies P. camemberti, P.
roqueforti se utilizan en la maduración de quesos. Se han reportado más de 80
especies de Penicillium como productores de micotoxinas. Estas micotoxinas pueden
dividirse en dos grupos: las que afectan la función del hepática o renal, y las
neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por Penicillium son, ocratoxina A,
citrinina, patulina, ácido ciclopiazónico, citreoviridina, penitremo A, toxina PR y
roquefortina y el ácido secalónico. De éstas la ocratoxina A es sin duda la más
importante, es un carcinógeno renal y es producida por P. citrinum, P. viridicatum, P.
verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o Camacho, A.,
M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis
Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. Versión para
Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química, UNAM 4 trigo,
o a través de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es posteriormente
consumida por humanos[ CITATION Fra94 \l 3082 ].

Algunos géneros de importancia en alimentos son:

Schizosaccharomyces. Levaduras de este género se han encontrado en frutas

tropicales, en la melaza y en la miel.

Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias

alimentarias, como en la fermentación del pan, fermentación de la cerveza,
fermentación de los vinos, en la producción de alcohol, glicerol e invertasa.

Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la

obtención de productos lácteos por su capacidad de fermentar la lactosa.
Zygosaccharomyces. Las levaduras de este género son importantes por su capacidad
para crecer en medios con elevadas concentraciones de azúcar (osmófilas), intervienen
en la alteración de la miel, jarabes y melazas, y también en la fermentación de la salsa
de soya y de algunos vinos.

Pichia. Crecen en la superficie de los líquidos formando una película. P.

membranafaciens produce una película en la superficie de las cervezas y vinos.

Debaromyces. Forman película en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en

la superficie de los quesos y de los embutidos.

Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limón y crecen en los zumos de

frutas.

Torulopsis. Originan problemas en las fábricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la

lactosa, alterando productos lácteos. Otras especies alteran la leche condensada
azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos ácidos.

Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtención de proteína unicelular para

incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La
especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lácteos. C.
lipolytica produce alteración de la mantequilla y margarina.

Brettanomyces. Producen grandes cantidades de ácido e intervienen en la

fermentación de la cerveza belga de tipo “lambic”, de las cervezas inglesas y de los
vinos franceses.

Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrándose en

las fábricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada.

Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas
en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color
rosado en el sauerkraut.

OBJETIVOS

Objetivo general.
• Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de
mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo
humano.
Objetivo específico.
• Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar
contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111-
SSA1-1994.

• Comprender el fundamento de todas las etapas del método de detección y

cuantificación de mohos y levaduras en alimentos.

MATERIALES A UTILIZAR
 Muestra de producto
 6 cajas de Petri esteriles
 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Mechero
 Matraz erlenmeyer

Equipos

 Incubadora a 20 -25°C
 Balanza analítica.
 Mechero.
 Contador de colonias

REACTIVOS:
 Violeta cristal.
 Lugol
 Fucsina básica.
 Alcohol.

PROCEDIMIENTO:
Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz
Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solución amortiguadora de fosfatos de
pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%.
Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un Matraz Erlenmeyer.
De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de
ensayo que contenga 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2,
agitar y repetir esta operación tantas veces como diluciones sean necesarias. Se
debe utilizar una pipeta estéril para cada dilución.
Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las
diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estéril.