PRÁCTICA 9

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO BACTERIANO
Introducción sitarán otros medios de cultivo y diferentes reacti-
vos, que se indican en cada caso concreto.
El aislamiento de los distintos microorganismos
contenidos en una muestra problema se lleva a
cabo sobre la superficie de un medio de cultivo Técnica
sólido contenido en una placa de Petri, siguiendo
Para el aislamiento de bacterias, se realiza la
la técnica de la siembra por estría múltiple en
siembra de una muestra del cultivo mixto, median-
superficie.
te la técnica de estria múltiple en la superficie del
Los medios de cultivo que se van a utilizar depen-
medio CLED. Incubar las placas en posición inver-
den del tipo de muestra y de los microorganismos
tida a 37º C durante 24-48 horas.
presentes en ella, pero deben ser medios sólidos
Tras la incubación, se observarán los distintos
en placa. Así, se usarán: Medios nutritivos gene-
tipos de colonias desarrolladas en la superficie del
rales, medios selectivos, medios diferenciales o
medio. Se deberán anotar las características más
bien medios enriquecidos, si los microorganismos
importantes que puedan ser útiles en una identifi-
que se van a aislar son nutricionalmente exigen-
cación preliminar.
tes.
Para estudiar la pureza de los cultivos se llevará a
Uno de los medios de cultivo que se podrían utili-
cabo una tinción de Gram de los distintos tipos de
zar con este fin es el agar CLED, un medio dife-
colonias aisladas. Posteriormente, se efectuará un
rencial que contiene lactosa y un indicador de pH
nuevo aislamiento en placas de agar nutritivo con
(azul de bromotimol) que permite apreciar la fer-
cada una de las diferentes colonias crecidas en
mentación ácida del azúcar por el viraje del indi-
las placas de CLED.
cador de pH, de color verde a amarillo. Su defi-
Después de incubar 24 horas a 37º C, se proce-
ciencia en electrolitos impide la invasión de la
derá a la identificación de cada uno de los distin-
placa por microorganismos móviles, como son las
tos cultivos puros que se hayan obtenido.
especies del género Proteus, facilitando así su
aislamiento y posterior identificación; la presencia
de cistina permite el crecimiento de los coliformes Identificación
dependientes de ella.
La identificación de los distintos microorganismos Con cada uno de los cultivos puros se realiza una
aislados se lleva a cabo realizando una serie de tinción de Gram.
pruebas bioquímicas, por las que se van a poner
de manifiesto la producción de ciertas enzimas.
En algunas ocasiones es necesario emplear otros
medios no bioquímicos, basados en técnicas IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM
serológicas. POSITIVOS

Objetivo Con los cultivos Gram positivos que presentan

morfología de cocos se realizan distintas pruebas
Aplicar la técnica de la siembra por estría múltiple como son:
en superficie, para la obtención de cultivos axéni-
cos o puros para, posteriormente, proceder a la
identificación de cada uno de los distintos micro- Prueba de la catalasa
organismos aislados.

La catalasa es una enzima que cataliza la des-

Material composición el peróxido de hidrógeno en agua y
Asa de siembra, cultivo mixto de bacterias, placas oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de
de agar CLED y agar nutritivo. Además, depen- los microorganismos aeróbicos y anaeróbicos
diendo del microorganismo a identificar, se nece- facultativos, excluyendo los estreptococos.

33
Material En el caso de cocos Gram positivos, catalasa
negativa, se trata del género Streptococcus u
Agua oxigenada de 30 volúmenes, cultivo bacte- otros relacionados y estudiaríamos la hemólisis en
riano y portaobjetos. agar sangre:
- α-hemólisis (hemólisis incompleta, color verdoso)
Técnica - ß-hemólisis (hemólisis completa, incoloro)

En un portaobjetos se depositan una o dos gotas En el caso de cocos Gram positivos catalasa posi-
de agua oxigenada de 30 volúmenes y se pone en tiva se comprueba la utilización de la glucosa.
contacto con ella una colonia de los microorganis-
mos a estudiar con ayuda del asa de siembra. Utilización de la glucosa (O/F)

Interpretación Es una prueba útil para distinguir aquellos micro-

organismos que son incapaces de utilizar la gluco-
La prueba se considera positiva cuando se produ- sa anaeróbicamente de aquellos que lo pueden
ce una efervescencia rápida con desprendimiento hacer.
de burbujas: la enzima catalasa convierte el peró-
xido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular.
Esta prueba se emplea para diferenciar los géne- Material
ros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa posi-
tivo) del género Streptococcus (catalasa negativo). Cultivo bacteriano, dos tubos con medio Hugh-
Leifson, pipeta Pasteur y un tubo con vaselina
estéril.

34
Técnica tificación de la especie. A continuación cabe reali-
zar una prueba de tipo respiratorio (siembra en
Se utilizan dos tubos de medio de cultivo, que se profundidad en medio semisólido vertical VL o en
hierven brevemente antes de utilizarlos para elimi- medio fluido de tioglicolato, como se describe en
nar el oxígeno disuelto. Una vez atemperados, se la Práctica 7). Esto permitiría distinguir entre los
inoculan con ayuda de una pipeta Pasteur, llegan- dos principales géneros: Clostridium (anaerobio) y
do al fondo y ascendiendo hacia la superficie. Bacillus (aerobio o anaerobio facultativo).
Dejar solidificar ambos tubos y recubrir uno de
ellos con vaselina estéril. Incubar a 37 ºC durante Algunos aspectos de la identificación de especies
48 horas. del género Clostridium se tratan en la Práctica 12
de esta guía.
Interpretación
Para distinguir las especies del género Bacillus,
Las bacterias fermentadoras producen ácido de la resulta útil la realización de otras pruebas:
glucosa independientemente de la presencia de
oxígeno. Por tanto, los dos tubos viran a amarillo Tipo de crecimiento en caldo. Esta prueba se
(+/+). En este caso, se trataría de un microorga- realiza inoculando el microorganismo en un tubo
nismo del género Staphylococcus. Las bacterias de caldo nutritivo e incubando a 30-37 ºC durante
oxidativas (metabolismo respiratorio) sólo utilizan 24-72 horas estáticamente. Es característica la
la glucosa en el tubo descubierto; dado que el aparición de crecimiento en la superficie del caldo
medio es capaz de detectar la acidificación produ- formando un velo en algunas especies del género
cida por el CO2 disuelto sólo virará a amarillo el Bacillus. Otras originan en este medio turbidez,
tubo sin cubrir de vaselina (+/-). En este caso, se sedimento y producción de pigmentos.
trataría de Micrococcus. Si no vira ninguno (-/-) la
bacteria no utiliza la glucosa como fuente de car- Además, para la identificación de las especies
bono. Para la posterior identificación de las espe- más frecuentes dentro del género Bacillus
cies del género Staphylococcus recurriríamos a (B. cereus y B. subtilis), cabe estudiar la utiliza-
otras pruebas bioquímicas, como son DNAsa y ción del manitol y la producción de lecitinasa en
coagulasa. medio de Mossel.

Fermentación de manitol y producción de

lecitinasa (medio de Mossel)
Se siembra una placa de medio de Mossel me-
IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM
diante aislamiento por estría en superficie a partir
POSITIVOS de una colonia de Bacillus. Este medio es selectivo
para Gram positivos, pues contiene polimixina B,
Con los cultivos Gram positivos con morfología de que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bac-
bacilos se realiza una tinción de esporas por el terias Gram negativas. Además, se trata de un
método de Wirtz, como se describe en el apartado medio diferencial que nos permitirá detectar las
correspondiente de la Práctica 4 de esta guía. especies fermentadoras de manitol por el viraje a
amarillo del indicador en presencia de ácidos.
- En el caso de que no sean formadores de Este medio también permite detectar las bacterias
esporas, se observará la morfología. Si se trata productoras de lecitinasa, que hidroliza la lecitina
de bacilos largos de forma regular, cabe sospe- de la yema de huevo contenida en el medio for-
char de géneros como Lactobacillus, entre otros. mando un precipitado blanco opaco alrededor de
Si, por el contrario, se observan formas irregula- la colonia. B. cereus da lugar a unas colonias
res, como de bastón, engrosadas en un polo, incoloras-rosadas (manitol negativas) con halo
podría tratarse de bacterias corineformes, como opaco debido a la producción de lecitinasa. Otras
las pertenecientes al género Corynebacterium. especies como, por ejemplo, B. subtilis dan lugar
Otro género característico es Arthrobacter, que a colonias amarillas debido a la fermentación del
aparece pleomórfico, mezclando formas cocoides manitol y carentes de halo opaco.
y bacilares.

- En el caso de bacilos Gram positivos con IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM

endosporas, la observación de la posición de la NEGATIVOS
espora (terminal, subterminal o central), su forma
(ovales o esféricas) y si deforman o no a la célula,
proporciona información útil para la posterior iden- Con los cultivos de cocos Gram negativos se rea-

35
lizan las pruebas de la catalasa (ya descrita) y oxi- mencionadas es una característica importante de
dasa; ambas son positivas en el caso de Neisseria Alcaligenes.
y Moraxella. La identificación se completaría La identificación de especies de Pseudomonas se
mediante pruebas bioquímicas, principalmente de hace por la producción de pigmentos en agar F y
fermentación de azúcares. agar P.

Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa) Producción de pigmentos

Los citocromos son enzimas que forman parte de Es una prueba útil para poner de manifiesto la for-
la cadena de transporte de electrones en la respi- mación de compuestos pigmentados por microor-
ración aeróbica, transfiriendo electrones al oxíge- ganismos no fermentadores.
no, con la formación final de agua.
Material
Material
Placas de agar F (medio King B) y agar P (medio
Tiras de papel con reactivo de oxidasa, pipeta King A) y cultivo bacteriano.
Pasteur y cultivo microbiano.
Técnica
Técnica
Inocular cada una de las placas de agar F y agar
Con una pipeta Pasteur, cerrada y cargada de P con los microorganismos, trazando con el asa
bacterias, se trazan rayas sobre una tira de papel estrías paralelas. Incubar a 37ºC durante 24
impregnada en solución acuosa al 1% de cloruro horas, en posición invertida.
de tetrametil para-fenilen-diamina.
Interpretación
Interpretación
La presencia de Pseudomonas aeruginosa sobre
En caso positivo el papel cambia de color pasan- la placa de agar F se manifiesta por la aparición
do a púrpura y negro en 10-20 segundos, como de un pigmento amarillo fluorescente (fluoresceí-
consecuencia de que el reactivo se oxida en pre- na o pioverdina) y un pigmento azul (piocianina)
sencia de citocromo c oxidasa formándose azul de sobre la placa de agar P. La composición de sales
Wuster. En caso negativo la tira de papel no cam- de cada uno de estos dos medios potencia la pro-
bia de color. ducción de uno de los pigmentos e inhibe la del
otro. Sim embargo, P. fluorescens sólo produce
fluoresceína.

IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM

NEGATIVOS Los microorganismos oxidasa negativa, se van
a identificar mediante una serie de pruebas bio-
químicas que comienzan con la siembra en medio
- La identificación de los bacilos Gram negativos Kligler. Según los resultados obtenidos, se conti-
puede iniciarse con la prueba de la oxidasa (ya nuará con otras pruebas de identificación:
descrita). Cualquier organismo que dé positivo en Producción de indol, movilidad, crecimiento en
esta prueba queda excluido de la familia citrato, producción de ureasa, rojo de metilo,
Enterobacteriaceae, cuyos miembros no poseen Voges-Proskauer y desaminación de la fenilalanina.
la enzima citocromo c oxidasa.

Los microorganismos oxidasa positiva pueden Siembra en medio Kligler

clasificarse en fermentadores de glucosa y no fer-
mentadores; por ello, estos dos grupos de micro-
organismos se identifican mediante la prueba de Esta prueba se suele usar en la identificación ini-
utilización de la glucosa (oxidativa o fermentativa) cial de bacilos Gram negativos y especialmente de
(ya descrita). enterobacterias.
Pseudomonas utiliza la glucosa por vía oxidativa y En este estudio se observa la fermentación de lac-
Vibrio lo hace, además, por vía fermentativa. La tosa y/o glucosa con producción de ácido y/o gas
incapacidad de utilizar glucosa por las dos vías y la producción de SH2.

36
Material dos, todo el tubo toma una coloración roja.
Incluso, una vez que la glucosa ha sido degrada-
Asa e hilo de siembra, tubos con medio Kligler y da la bacteria comienza a utilizar los aminoácidos,
cultivo bacteriano. liberándose aminas, que elevan el pH, por lo que
el color rojo puede ser más intenso.
Técnica
- Fermentación de lactosa
Los tubos de medio Kligler se inoculan con el hilo Se pone de manifiesto por el viraje a amarillo del
de siembra, tomando microorganismos de la colo- indicador, tanto en el fondo del tubo como en la
nia que se va a identificar y haciendo una picadu- superficie. La concentración de lactosa es diez
ra hasta el fondo del tubo, continuando la siembra veces mayor que la de glucosa, con lo que la pro-
con asa por estría en la superficie. Incubar a 37ºC ducción de ácido formado es tan elevada que
durante 24 horas y observar los resultados. hace virar el indicador en todo el tubo.
El hecho de que la fermentación de lactosa
enmascare la de la glucosa no tiene importancia,
Interpretación
ya que para que una bacteria fermente lactosa
Como ya se ha comentado, este tipo de siembra debe ser capaz de fermentar glucosa.
se realiza, en general, para la identificación de Si la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa,
enterobacterias. La interpretación de los resulta- una vez que la glucosa ha sido degradada, como
dos se hará de la forma siguiente: ya se ha comentado, la bacteria comienza a utili-
zar los aminoácidos, liberándose aminas, que
- Fermentación de glucosa neutralizan la pequeña cantidad de ácidos presen-
Se aprecia en el viraje a amarillo del indicador de tes en la porción inclinada del medio y elevan el
pH (rojo de fenol) únicamente en la parte inferior pH. Por lo tanto, la zona inclinada del tubo apare-
del tubo. Esto es cerá de color rojo intenso y el fondo de color ama-
debido a la rillo debido a la fermentación previa de la glucosa.
A B C D
pequeña propor-
ción de glucosa - Producción de gas
que existe en el La producción de gas en la fermentación se mani-
medio (0,1%), fiesta por la aparición de burbujas, rotura o eleva-
que al ser fer- ción del agar del fondo del tubo.
mentada en el Amarillo
fondo del tubo, Rojo - Producción de SH2
donde existen Para detectar la producción de SH2 a partir de tio-
condiciones de sulfato sódico debe incorporarse al medio de culti-
anaerobiosis, vo un indicador, dado que el SH2 es incoloro. Para
produce sufi-
tal fin se suele utilizar alguna sal de hierro que
ciente ácido
reacciona con el SH2, para producir un precipita-
para que vire el
indicador, pero do negro de sulfuro de hierro. La producción de
no a medida que SH2 tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que el
nos aproxime- precipitado negro se concentre en el fondo del
mos a la superfi- tubo, donde se generan ácidos a partir de la glu-
cie, donde las cosa. Así, un fondo negro indica que existe acidez
condiciones son en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se
más aeróbicas, haya enmascarado con el precipitado negro.
allí la bacteria
respira y la pro-
ducción de ácido Negro Reducción de nitratos
es menor, per-
maneciendo esa Figura 9.1. Distintos resul-
zona de color tados de la prueba Kligler: La reducción de nitratos a nitritos es una carac-
rojo. A: Glucosa +, Lactosa - terística propia de varios microorganismos que uti-
Si el microorga- B: Glucosa +, Lactosa -, SH2 + lizan nitrato como aceptor final de electrones en la
nismo sembrado C: Lactosa +, Gas + respiración anaeróbica. Esta prueba es útil en la
no fermenta la D: Lactosa +, SH2 + identificación de microorganismos pertenecientes
glucosa con pro- a las enterobacterias aunque también sirve para
ducción de áci- identificar otros microorganismos.

37
 cultivo, tras la adición de los reactivos, pone de
Material manifiesto la presencia de nitritos y por tanto la
prueba de reducción de nitratos se considera posi-
Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, tiva. Este color se debe a la formación de un com-
solución de ácido sulfanílico al 8 por mil y solución puesto coloreado, denominado p-sulfobenceno-
de α-naftilamina al 5 por mil (ambos en ácido acé- azo-α-naftilamina.
tico 5N) y polvo de zinc. Si no se desarrolla color, la prueba puede conside-
rarse negativa (no se han reducido los nitratos) o
bien se han reducido originando otros compuestos
Técnica (amoníaco, nitrógeno molecular, óxido nítrico u
óxido nitroso) por lo que la lectura se corresponde
Inocular el medio líquido e incubar a 37ºC durante
con un falso negativo. En este caso se puede aña-
24-48 horas. Pasado ese tiempo, añadir al cultivo
dir al medio de cultivo una pequeña cantidad de
unas gotas de solución de α-naftilamina y unas
polvo de zinc, que reduce los nitratos del medio a
gotas de solución de ácido sulfanílico.
nitritos. El desarrollo de un color rojo, indica la
existencia de nitratos en el medio y confirma que
Interpretación la reacción es negativa.
El desarrollo de una coloración roja en el medio de

38
Producción de indol ella, se puede determinar si el microorganismo es
inmóvil o móvil.
El indol es uno de los productos de degradación
del metabolismo del aminoácido triptófano. La pre-
sencia de la enzima triptofanasa en la bacteria
provoca la hidrólisis del triptófano y su desamina- Crecimiento en citrato
ción, produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco.
Algunos microorganismos utilizan el citrato pre-
Material sente en el medio de cultivo como única fuente de
carbono, esta característica es importante en la
Medio de cultivo con peptona, cultivo bacteriano y identificación de microorganismos pertenecientes
reactivo de Ehrlich. a las enterobacterias.

Técnica Material
Inocular el caldo con el microorganismo e incubar Un tubo con medio citratado de Simmons y cultivo
a 37ºC durante 24-48 horas. Transcurrido ese bacteriano.
tiempo, añadir al cultivo 1 ml de reactivo de Ehrlich
(para-dimetilamino benzaldehido en etanol), res-
balando por la pared del tubo sin agitar.
Técnica
Sembrar en la superficie inclinada del medio e
Interpretación incubar a 37ºC durante 24-48 horas.

La aparición, transcurridos unos segundos, de un

anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo
Interpretación
y el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, En caso positivo, el medio de cultivo vira de color
la prueba se considera positiva. El indol es capaz verde a azul. Si el microorganismo utiliza el citrato
de reaccionar con el grupo aldehído del reactivo como fuente de carbono, también utiliza las sales
originando un complejo de color rojo. de amonio como fuente de nitrógeno, con produc-
ción de amoníaco, lo que da lugar a una alcalini-
zación del medio. Esto se pone de manifiesto por
un viraje del indicador de pH azul de bromotimol,
Movilidad de verde a azul intenso, a la vez que se observa
crecimiento en la superficie.
Es otra característica útil en la identificación de los
microorganismos. Se puede llevar a cabo obser-
vando el crecimiento en un medio semisólido.
Producción de ureasa
Material
La ureasa es una enzima presente en numerosos
Hilo de siembra, medio semisólido (agar movili- microorganismos. Esta enzima cataliza la hidróli-
dad), y cultivo bacteriano. sis de la urea, con producción de dióxido de car-
bono y amoníaco, lo que causa una alcalinización
Técnica del medio.

Sembrar, por picadura, con hilo de siembra en Material

medio semisólido, incubando a 37ºC durante 48
horas. Un tubo con agar urea de Christensen y cultivo
bacteriano.
Interpretación
Técnica
La baja concentración de agar de este medio per-
mite que las bacterias se desplacen si son móvi- Inocular el medio de cultivo mediante estría en
les. Por ello, observando si el crecimiento está superficie e incubar a 37ºC durante 24 horas.
sólo en la picadura o se extiende a los lados de

39
 Interpretación global de las pruebas de identificación de bacilos Gram negativos fermentadores de glucosa
Una vez realizadas todas las pruebas determinar el género con ayuda de la siguiente tabla:

Interpretación 24-48 horas. Transcurrido ese tiempo añadir, a 2 ml

del cultivo, 5 gotas de la solución de rojo de meti-
Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen lo y agitar ligeramente.
que el medio de cultivo tome color fucsia, debido
a la alcalinización del mismo por producción de
amonio a partir de la urea, que se pone de mani- Interpretación
fiesto por un viraje del indicador de pH (rojo de En caso positivo aparece un color rojo estable, lo
fenol). que indica una producción de ácidos elevada que
disminuye el pH del medio. Un color anaranjado
no indica que la prueba sea positiva, ya que otros
microorganismos pueden producir pequeñas can-
Prueba del rojo de metilo tidades de ácidos.

Esta prueba consiste en comprobar si el microor-

ganismo en estudio fermenta la glucosa con pro-
ducción de ácidos (succínico, láctico, acético, etc.) Prueba de Voges-Proskauer
o vía ácido mixta.
Consiste en comprobar si el microorganismo estu-
Material diado fermenta la glucosa siguiendo la vía butilén
glicólica, detectando un producto intermedio en la
Un tubo de medio Voges-Proskauer, cultivo bacte- reacción que es el acetil-metil-carbinol o acetoína.
riano y reactivo rojo de metilo.
Material
Técnica
Un tubo de medio Voges-Proskauer, cultivo bacte-
Inocular el medio líquido e incubar a 37ºC durante riano, solución de α-naftol y solución de sosa.

40
Técnica
Incubar el medio líquido e incubar a 37ºC durante
24-48 horas. Después de la incubación, se añade
a 1 ml del cultivo 0,5 ml de α-naftol y 1 ml de solu-
ción de sosa, agitando vigorosamente en presen-
cia de oxígeno atmosférico y se deja reposar
durante 10 minutos.

Interpretación
El desarrollo de un color rosa en el tubo, transcu-
rridos 10 minutos desde la adición de los reacti-
vos, indica que la prueba es positiva, es decir, que
la acetoína se ha oxidado pasando a diacetilo.

Desaminación de la fenilalanina (APP)

La fenilalanina es un aminoácido cuya desamina-

ción por medio de una desaminasa, da lugar a la
formación de amoniaco y de ácido fenilpirúvico, el
cual puede detectarse por la adición de un reactivo.

Material
Un tubo de medio agar fenilalanina, cultivo bacte-
riano y solución de cloruro férrico al 10%.

Técnica
Sembrar el microorganismo en la superficie del
medio agar fenilalanina e incubar a 37ºC durante
24 horas. Transcurrido este tiempo añadir 4 ó 5
gotas de la solución de cloruro férrico sobre la
superficie del agar.

Interpretación
La prueba se considera positiva cuando aparece
una coloración verde intensa. Esto se debe a que
las bacterias que poseen fenilalanina desaminasa,
transforman el aminoácido en ácido fenilpirúvico,
que da reacción coloreada con el cloruro férrico.

41
PRÁCTICA 10

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA

INHIBITORIA DE UN ANTIBIÓTICO

La técnica de dilución en caldo permite determinar 2.- Preparación de las diluciones de antibiótico
la actividad de un agente antimicrobiano sobre un a) Rotular los tubos de caldo Müeller-Hinton: 8, 4,
microorganismo, en forma de concentración míni- 2, 1, 0.5, 0.25 y 0 mg/ml.
ma inhibitoria (CMI): La menor concentración de b) Pipetear 1 ml del tubo que contiene la solución
antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento. A de ampicilina (16 mg/ml) al marcado con 8.
partir de este dato puede determinarse si es posi- c) Mezclar bien pipeteando y transvasar 1 ml al
ble tratar una infección causada por ese microor- tubo siguiente (4 mg/ml).
ganismo con ese antimicrobiano. Si la CMI es d) Repetir el paso anterior hasta llegar al tubo
menor que la concentración de antimicrobiano que marcado con 0.25 mg/ml, del que se desecha 1 ml.
se alcanza en los tejidos de cuerpo humano, el tra- No añadir antibiótico al tubo marcado 0.
tamiento puede tener éxito y el microorganismo se
considera sensible; en caso contrario fracasará y 3.- Siembra: Tomar una muestra del cultivo de E.
el microorganismo se considera resistente. Un coli con una pipeta Pasteur e inocular una gota en
antibiograma es un estudio de la sensibilidad de cada tubo de la serie de diluciones (incluidas las
un microorganismo dado a distintos antimicrobia- de 16 y 0 mg/ml). Finalmente, incubar los tubos a
nos. Las distintas especies y estirpes microbianas 37ºC durante 20 h.
presentan distintos grados de sensibilidad a los
diversos agentes, de ahí que sea necesario hacer
Interpretación
una evaluación para poder seleccionar el com-
puesto más apropiado para el tratamiento de una Al día siguiente, observar si hay turbidez en los
infección bacteriana. tubos. De los que no presenten crecimiento, el que
contenga la concentración más baja de antibiótico
corresponderá a la CMI. El tubo que no contiene
Objetivo antibiótico debe estar turbio (control positivo).

Determinar la sensibilidad o resistencia a un anti-

biótico de una bacteria aislada, utilizando el méto-
do de dilución en caldo.

Material
Cultivo bacteriano en medio líquido de Escherichia
coli, 7 tubos con 1 ml de caldo Müeller-Hinton,
solución de ampicilina (16 mg/ml) en caldo
Müeller-Hinton (2 ml), pipetas de 1 ml y pipetas
Pasteur.

Técnica
1.- Preparación del inóculo
Esta técnica sólo es aplicable a especies bacte-
rianas en cultivo puro. Por ello, previamente se
procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento
en placa.
La preparación del inóculo se realiza sembrando
una colonia aislada del microorganismo en estudio
en un tubo de caldo Mueller-Hinton e incubando a µ
37ºC durante 18-20 h.
Figura 10.1. Determinación de la CMI.

43
PRÁCTICA 11

ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR

Objetivo con un patrón de turbidez n° 0.5 de McFarland

(0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M y 99,5 ml de
Se pretende evaluar la sensibilidad o resistencia a ácido sulfúrico 0,36 M). Esto equivale aproxima-
diversos antibióticos de una bacteria de creci-
damente a una densidad de 108 células/ml. Diluir
miento rápido aislada en prácticas anteriores. El
si es necesario la suspensión o añadir más inócu-
método utilizado es el de difusión en agar o de
lo.
Kirby-Bauer.
2. Siembra y colocación de los discos
1. Preparación del inóculo

La técnica de antibiograma sólo es aplicable a

especies bacterianas en cultivo puro. Por ello, pre- Material
viamente se procederá, si es preciso, a hacer un
aislamiento en placa. Placas con medio de cultivo Müeller-Hinton, hiso-
po, pinzas y discos de 6 mm de diámetro impreg-
nados con antibiótico.
Material
Tubo con 10 ml de solución salina y cultivo de la Técnica
bacteria problema.
Impregnar una torunda con la suspensión del inó-
culo; escurrirla contra la pared del tubo y sembrar
Técnica con ella toda la superficie de la placa, mediante
estrías cruzadas en varias direcciones. Antes de
Cultivar la bacteria aislada en un tubo de medio
15 minutos deben colocarse los discos de antibió-
líquido apropiado (caldo nutritivo, infusión cere-
ticos.
bro-corazón) o preparar una suspensión directa a
Con pinzas flameadas y frías (o con un aplicador
partir del cultivo en placa usando el siguiente
automático) se disponen los discos sobre las pla-
método:
cas, de forma que disten unos 15 mm del borde de
Tomar de una colonia aislada con el asa y resus-
la placa y unos 30 mm entre sí. En una placa de 9
pender en el tubo de solución salina frotando en la
cm caben 6 discos. Adherir cada disco al agar
pared del tubo (Figura 11.1).
presionando ligeramente con las pinzas.
Homogeneizar bien y ajustar la densidad óptica
A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 37ºC
.
3. Lectura

Se realiza a las 16-20 horas. Medir el diámetro de

los halos con calibrador o regla graduada, consi-
derando la zona que esta libre de crecimiento. En
caso de bacteriostáticos es aceptable un ligero
velo dentro del halo. La presencia de colonias en
el interior del halo indica contaminación, cultivo
mixto o aparición de resistencia.
Consultar el siguiente cuadro para interpretar el
antibiograma. Teniendo en cuenta la especie bac-
teriana y el antibiótico, decidir si la bacteria es
sensible (S), resistente (R) o su sensibilidad no
puede definirse con claridad (intermedio o indeter-
minado: I).
Figura 11.1.
Preparación de una suspensión

45
Tabla 11.1. Criterios de interpretación de antibiogramas

46
47
 Figura. 11.2.
Antibiograma por difusión en agar:

Respuesta de Staphylococcus aureus

frente a cuatro diferentes antibióticos.
Las líneas indican el diámetro del halo de
inhibición.

48
PRÁCTICA 12

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE UN AGUA PROBLEMA

Fundamento muestras se conservan a temperatura ambiente
(en la oscuridad, sin sobrepasar los 25ºC), su aná-
lisis debe comenzar antes de que hayan transcu-
Para conocer la calidad sanitaria de un agua des- rrido 6 h desde el momento de la toma de mues-
tinada al consumo humano, es necesario realizar tras. En circunstancias excepcionales, las mues-
análisis periódicos. Los microorganismos que se tras pueden conservarse a una temperatura de
encuentran en el agua pueden ser autóctonos 4ºC durante un periodo máximo de 24 h antes de
(propios del agua) y alóctonos (procedentes del su análisis.
suelo, aire, hombre o animales). Los microorga-
nismos propios del agua tienen una temperatura
de crecimiento de 22ºC, mientras que los proce-
2.- Recuento de microorganismos cul-
dentes del intestino del hombre y otros animales tivables (Norma UNE-EN ISO 6222:
crecen mejor a temperaturas de 37ºC a 44ºC. 1999)

Los métodos oficiales de análisis microbiológicos Se consideran como microorganismos cultivables

y los criterios sanitarios de la calidad de aguas todas las bacterias aerobias o anaerobias faculta-
potables de consumo humano aparecen especifi- tivas, levaduras o mohos capaces de formar colo-
cados en el BOE de 21 de febrero de 2003, Real nias en el medio y en las condiciones de ensayo
Decreto 140/2003. descritos posteriormente.

Este recuento de colonias es útil para evaluar el

1.- Toma de muestras estado de los recursos de agua en su origen y la
eficacia del proceso de tratamiento de las aguas
Las muestras que se tomarán para el análisis destinadas al consumo humano e indica la limpie-
deben ser representativas del agua a estudiar, za y el estado de los sistemas de distribución. De
para determinar a partir de ellas su calidad micro- igual modo, permite detectar cambios anómalos
biológica y, de acuerdo con ella, poder calificar en el número de microorganismos en la red de dis-
dicho agua como "apta o no apta para el consumo tribución. Así, todo aumento repentino del número
humano". Por consiguiente, las muestras deben obtenido puede advertir de la existencia de un
reflejar la composición microbiana del agua a foco de contaminación y requeriría su inmediata
analizar. investigación.
Hay normas para la toma de muestras de aguas
según sus distintas procedencias (grifos, pozos, Para hacer este recuento se emplean placas con
depósitos, lagos, ríos, manantiales, etc.). En cual- medio agar extracto de levadura en las que se
quier caso, siempre para su recogida debe utili- siembra un volumen conocido de agua. La incu-
zarse frascos estériles y debe recolectarse canti- bación se llevará a cabo a 22ºC durante 72 horas.
dades comprendidas entre 500 y 1000 ml. Cuando
se estime probable que el agua a analizar conten- Material
ga trazas de cloro, cloramina u ozono, será nece-
sario neutralizar su efecto bactericida en el - Muestra de agua.
momento del muestreo (Real Decreto 1138/1990 - 4 placas de Petri estériles.
del 14 de septiembre). Para ello se añadirá una - 1 pipeta de 1 ml estéril.
cantidad suficiente de tiosulfato sódico. Para un - 4 tubos con medio agar extracto de levadura.
volumen de 250 ml son suficientes 0,2 ml de una - Estufa regulada a 22ºC.
solución acuosa al 3% de Na2S2O3·5H2O.
Técnica
Para la preparación de la muestra, la filtración y la
siembra sobre los medios de aislamiento, debe - Marcar cada placa con el número de la muestra,
seguirse los métodos descritos en las Normas la dilución y la fecha, preparando, si es posible,
ISO. Es preferible iniciar el examen de las mues- placas duplicadas para cada volumen de muestra
tras inmediatamente después de su toma. Si las examinada.

49
- Homogeneizar la muestra, agitando el frasco viven en el suelo y en aguas dulces superficiales
varias veces. y, por tanto, no tienen siempre un origen intestinal.
- Depositar, con pipeta estéril, en dos placas 1 ml La presencia de bacterias coliformes en el agua
y en las otras dos 0,1 ml del agua problema. de abastecimiento, aunque no pruebe de forma
- Añadir el medio de cultivo (15-20 ml), fundido y concluyente una contaminación de origen fecal, sí
atemperado a 45ºC, sobre las placas. puede indicar fallos en el tratamiento de depura-
- Mezclar por rotación suave de las placas sobre ción o en la red de distribución del agua. La iden-
la mesa. tificación de las cepas aisladas puede permitir en
- Cuando el medio esté completamente solidifica- ocasiones obtener información acerca de su ori-
do, invertir las placas y llevar a incubar a la tem- gen.
peratura de 22ºC. Los coliformes reagrupan ciertas especies bacte-
rianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae,
de morfología bacilar, Gram negativas, aerobias o
Resultados
anaerobias facultativas, oxidasa negativa, no
Efectuar el recuento de colonias eligiendo las pla- esporuladas y que fermentan la lactosa con pro-
cas cuyo número esté comprendido entre 30 y ducción de ácido a 37ºC en 24-48 horas.
300. El recuento no se efectuará en placas que
contengan menos de 30 colonias, excepto en el
caso de aquellas siembras con agua sin diluir. Si
no hay colonias en las placas sembradas con
muestra sin diluir, los resultados se expresan A B
como "no detectado en un mililitro". Si todas las
placas tienen más de 300 colonias, el resultado
final se dará como "> 300" o como "valores apro-
ximados".
El resultado se expresará como número de unida-
des formadoras de colonias presentes en 1 ml de
la muestra (UFC/ml) en 72 h de crecimiento a 22ºC. C

D
3.- Detección y recuento de bacterias
indicadoras de contaminación fecal Figura 12.1. Equipo de filtración a vacío

A. Filtro de celulosa de 0’45 µm de diámetro de

La investigación en el agua de bacterias indicado- poro.
ras de contaminación fecal (Escherichia coli y B. Depósito para la muestra o medio.
otros coliformes, enterococos y Clostridium per- C. Depósito para la muestra o medio filtrados.
fringens) es de gran interés ya que su presencia D. Sistema de vacío.
indica que ese agua puede estar contaminada por
otras bacterias patógenas que viven en el intesti-
no del hombre y de los animales de sangre caliente. MÉTODO DE FILTRACIÓN

Se utiliza para la determinación del número de

3.1.- Detección y recuento de Escherichia
coliformes y E. coli, mediante filtración de volúme-
coli y de bacterias coliformes (Norma nes determinados del agua a analizar a través de
UNE-EN ISO 9308-1: 2000) filtros de membrana e incubación de los mismos
sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.
La presencia y el nivel de contaminación fecal
constituye un factor importante en la evaluación
de la calidad de un agua y del riesgo de infección Material
que representa para la salud humana. El análisis
de muestras de agua para detectar la presencia - Membranas filtrantes estériles de ésteres de
de E. coli, que normalmente habita en el tracto celulosa, de 0'45 µm de poro.
intestinal del hombre y otros animales de sangre - Pinzas de extremos planos.
caliente, proporciona una indicación de este tipo - Equipo de filtración por vacío.
de contaminación. Los resultados del análisis de - Placas de Petri con agar lactosa-trifeniltetrazolio-
bacterias coliformes pueden resultar difíciles de tergitol 7 (Agar de lactosa TTC con heptadecilsul-
interpretar dado que algunas bacterias coliformes fato de sodio o tergitol 7).
- Estufas a 37ºC y 44ºC.

50
Técnica del metabolismo del aminoácido triptófano. La pre-
sencia de la enzima triptofanasa en la bacteria
- Colocar un filtro de membrana estéril sobre el provoca la desaminación reductiva del triptófano
sistema de filtración, utilizando pinzas estériles. produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco.
Adaptar el embudo y filtrar 100 ml de la muestra
de agua previamente homogeneizada. Para realizar estos ensayos confirmativos, se
- Retirar el embudo y, con unas pinzas esteriliza- resiembran preferiblemente todas las colonias lac-
das, transferir la membrana sobre el medio de cul- tosa-positivas obtenidas en la placa incubada a
tivo agar de lactosa TTC de modo que la superfi- 37ºC, o un número representativo de ellas (diez
cie de filtración quede hacia arriba. Es importante como mínimo), sobre una placa de agar triptona
que la membrana quede homogéneamente apo- soja (TSA). Además, todas y cada una de estas
yada sobre el medio de cultivo. colonias se resiembran en otros tantos tubos con
- Invertir la placa e incubar durante 24-48 horas a caldo de cultivo con triptófano. A continuación:
37ºC. - Se incuba la placa de agar TSA a 37ºC durante
- El empleo de un filtro de membrana adicional 24 horas y se lleva a cabo la prueba de la oxida-
para la incubación a 44ºC puede evitar los proble- sa, tal y como se indica en la práctica 9.
mas causados por el crecimiento de otras bacte- - Se incuban los tubos con caldo de cultivo con
rias cuya procedencia no sea fecal. triptófano a 44 ºC durante 24 h; tras dicha incuba-
ción, se comprueba la producción de indol aña-
Resultados, confirmación y recuento diendo de 0,2 ml a 0,3 ml de reactivo de Kovacs.
La aparición de una coloración roja en la superfi-
Se examinan las membranas y se cuentan como cie del caldo confirma la producción de indol.
bacterias lactosa-positivas todas las colonias, sin
tomar en consideración el tamaño, que originen un Se realiza un recuento de todas las colonias lac-
viraje de color a amarillo del medio por debajo de tosa-positiva que dan una reacción oxidasa nega-
la membrana, consecuencia de la acidificación del tiva y se consideran como bacterias coliformes.
medio tras la fermentación de la lactosa.
Las características de los distintos coliformes en Se realiza un recuento de todas las colonias lac-
este medio son: tosa-positiva que presentan reacción oxidasa
- Klebsiella y Enterobacter: Colonias rojo ladri- negativa y dan reacción indol positiva y se consi-
llo o naranja. deran como Escherichia coli.
- Escherichia y Citrobacter: Colonias amarillas
con centro naranja.
Expresión de los resultados
Los microorganismos no fermentadores de lacto-
sa dan colonias azul-violetas sobre fondo azul- A partir del recuento del número de colonias
verdoso. características presentes en la membrana y
teniendo en cuenta los resultados de los ensayos
NOTA: Aunque no está incluido en la Normativa se de confirmación efectuados, se calcula el número
realizará una tinción de Gram de una de las colo- de UFC de coliformes y de E. coli presentes en 100
nias lactosa-positiva para observar al microscopio. ml de muestra.

Para realizar el recuento se cuentan las colonias

lactosa-positivas que hayan aparecido sobre la 3.2.- Detección y recuento de enterococos
superficie del filtro, después de la incubación a (Norma UNE-EN ISO 7899-2: 2001)
37ºC, y se expresan como número de UFC pre-
Los enterococos pueden considerarse como indi-
sentes en 100 ml de agua.
cadores de contaminación fecal. Sin embargo, es
conveniente recordar que algunos enterococos
A continuación, es necesario llevar a cabo los
que se encuentran en las aguas pueden proceder
ensayos confirmativos siguientes:
ocasionalmente de otros hábitats. Mediante los
métodos descritos a continuación pueden detec-
- Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa)
tarse y cuantificarse las especies: Enterococcus
Los citocromos son enzimas que forman parte de
faecalis, E. faecium, E. durans y E. hirae. Además,
la cadena de transporte de electrones en la respi-
pueden determinarse ocasionalmente otras espe-
ración aeróbica, transfiriendo electrones al oxíge-
cies de Enterococcus y algunas especies de
no, con la formación final de agua.
Streptococcus (en particular S. bovis y S. equi-
nus). Estas especies de Streptococcus no tiene
- Producción de indol una supervivencia larga en en agua y probable-
El indol es uno de los productos de degradación

51
mente no puedan determinarse cuantitativamente. resultado del ensayo de confirmación efectuado,
Como enterococos intestinales se consideran se calcula el número de UFC de enterococos
aquellos microorganismos capaces de reducir el intestinales presentes en 100 ml de muestra.
cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) y de hidro-
lizar la esculina en las condiciones y sobre los
3.3.- Detección y recuento de Clostridium
medios especificados más abajo.
perfringens (incluidas las esporas)
MÉTODO DE FILTRACIÓN Los bacterias incluidas en el género Clostridium
tienen morfología bacilar, son Gram positivas,
Se utiliza para la determinación del número de anaerobias estrictas y capaces de formar esporas.
enterococos intestinales mediante filtración de un La especie C. perfringens está normalmente pre-
volumen determinado del agua a analizar a través sente en heces. Sus esporas son resistentes al
de filtros de membrana e incubación de los mis- calor, a los procesos de desinfección y a los trata-
mos sobre medios de cultivo a temperaturas ade- mientos de depuración habituales de las aguas
cuadas. (cloración), por lo que su supervivencia en agua
es mayor que la de las formas vegetativas, inclui-
Material y técnica dos E. coli y los enterococos.
La diferenciación de C. perfringens de otras espe-
- Siguiendo el método de filtración descrito para el cies de Clostridium, se basa en su capacidad de
recuento de coliformes, se filtran 100 ml del agua fermentar la sacarosa con producción de ácido, en
a analizar previamente homogeneizada. su incapacidad de fermentar la celobiosa (debido
- Se coloca el filtro de membrana sobre el medio a la ausencia de β-D-glucosidasa) y en la produc-
de Slanetz y Bartley y se incuban las placas a ción de fosfatasa ácida.
37ºC durante 48 h.
MÉTODO DE FILTRACIÓN
Resultados, confirmación y recuento
Se utiliza para la determinación del número de
Tras la incubación, se consideran como colonias C. perfringens mediante filtración de un volumen
típicas de enterococos todas las que muestren un determinado del agua a analizar a través de filtros
color rojo, marrón o rosado, en el centro o en toda de membrana e incubación de los mismos sobre
la colonia, consecuencia de la reducción del TTC medios de cultivo a temperaturas adecuadas.
(incoloro) a trifenilformazán (rojo).
Material y técnica
NOTA: Aunque no está incluido en la Normativa se - Siguiendo el método de filtración descrito para el
realizará una tinción de Gram de una de las colo- recuento de coliformes, se filtran 100 ml del agua
nias positivas para observar al microscopio. a analizar, previamente homogeneizado.
- Se coloca el filtro de membrana sobre el medio
Si hay colonias típicas se realizará un ensayo de m-CP y se incuban las placas a 44ºC durante
confirmativo. Para ello, con ayuda de unas pin- 24 h en condiciones de anaerobiosis.
zas estériles, se transfiere el filtro de membrana
con las colonias, sin invertirla, sobre una placa
Resultados, confirmación y recuento
con agar bilis-esculina-azida, precalentada a
44ºC. Se incuba a 44ºC durante 2 h y se lee la Tras la incubación, se consideran como colonias
placa inmediatamente. En este medio, los entero- típicas de C. perfringens todas las que muestren
cocos hidrolizan la esculina dando origen a escu- un color amarillo opaco, consecuencia de la acidi-
letina (6,7-dihidrocumarina) que se combina con ficación del medio tras la fermentación de la saca-
los iones Fe3+ formando un compuesto de color rosa. En general, el resto de las especies de
marrón a negro. Por tanto, se considera que todas Clostridium aparecen de color azul-verdoso si,
las colonias típicas que muestren un color de además de fermentar la sacarosa, son β-D-gluco-
marrón a negro, en el medio circundante, dan sidasa positivas (hidrolizan el indoxil-β-D-glucósi-
reacción positiva y se cuentan como enterococos. do) o de color púrpura si no fermentan la sacaro-
sa.
Expresión de los resultados
NOTA: Aunque no está incluido en la Normativa se
A partir del recuento del número de colonias realizará una tinción de Gram de una de las colo-
características presentes en la membrana sobre el nias positivas para observar al microscopio.
medio de Slanetz y Bartley y teniendo en cuenta el

52
Si hay colonias típicas de C. perfringens se reali- Recuento de esporas de Clostridium sulfi-
zará un ensayo confirmativo exponiendo dichas to-reductores en tubos con agar de hierro
colonias a vapores de hidróxido amónico. y sulfito
Se considera que todas las colonias que cambien Comos se ha indicado, C. perfringens forma parte
a color rosa o rojo al cabo de 20 a 30 segundos del grupo de los sulfito-reductores. Una técnica
dan reacción positiva (la producción de fosfatasa clásica para el recuento de las formas de resisten-
ácida provoca la hidrólisis de la fenolftaleína difos- cia de clostridios sulfito-reductores implica su
fato) y se cuentan como C. perfringens. incubación en tubos de medio de cultivo sólido
glucosado, que contiene sulfito sódico y una sal de
hierro (agar de hierro y sulfito). Este recuento
Expresión de los resultados
exige necesariamente un calentamiento de la
A partir del recuento del número de colonias muestra de agua para destruir las formas vegeta-
características presentes en la membrana sobre el tivas de las bacterias.
medio m-CP y teniendo en cuenta los resultados
del ensayo de confirmación efectuado, se calcula Material:
el número de UFC de C. perfringens presentes en
100 ml de muestra. - Tubos con 10 ml del agua problema.
- Tubos con 10 ml de medio agar de hierro y sulfi-
to a doble concentración.
OTROS MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE - Tubos con agar agua.
Clostridium perfringens - 1 pipeta de 10 ml estéril.

Aunque la normativa vigente propone realizar el Técnica:

análisis ya descrito para la detección de C. per-
fringens, también señala la posibilidad de utilizar - Colocar 10 tubos del medio de cultivo en baño
otros métodos alternativos siempre que estén va- maría hasta fusión total del agar.
lidados o acreditados por los laboratorios de análi- - Calentar la muestra de agua en baño a 80ºC,
sis de aguas. durante cinco minutos, con objeto de destruir las
formas vegetativas. A continuación, atemperar
Filtración e incubación en medio agar TSC hasta 60ºC aproximadamente.
- Sembrar cada tubo de medio, atemperado a 45-
El agua problema se filtra como se ha descrito en 50 ºC, con 10 ml del agua a 60 ºC.
la técnica anterior y el filtro se incuba sobre medio - Mezclar y enfriar rápidamente, sumergiéndolos
agar TSC (Triptosa-Sulfito-Cicloserina). Este en agua fría. Recubrir con agar-agua en un espe-
medio, muy utilizado en el análisis microbiológico sor de 2-3 cm.
de productos cárnicos, proporciona un sustrato - Incubar a 37 ºC durante 48-72 horas para la
óptimo para el crecimiento de clostridios. Por su determinación de esporas de clostridios sulfito-
propiedad metabólica de utilizar sulfitos como reductores, o bien a 45 ºC durante 24-48 horas
aceptores de electrones produciendo sulfuros, para el recuento de esporas de C. perfringens.
C. perfringens forma parte del grupo bacteriano de
los sulfito-reductores. La reducción del bisulfito a Resultados:
sulfhídrico se detecta por precipitación de sulfuro
ferroso con las sales de hierro incluidas en la for- Las colonias de Clostridium sulfito-reductores
mulación del medio. Por tanto, esta especie pro- aparecerán de color negro, debido a la reducción
duce colonias negras características. La cicloseri- del sulfito a sulfhídrico y posterior formación de
na y otros antibióticos que suelen añadirse (polim- sulfuro ferroso por reacción de éste con la sal de
ixina B o kanamicina) actúan como agente selecti- hierro.
vo inhibiendo el desarrollo de otros microorganis- Transcurridas 48 horas, contar el número de colo-
mos. La incubación se realiza durante 18-24 h a nias negras desarrolladas en la totalidad del agar.
44°C en condiciones de estricta anaerobiosis. El resultado se expresará como número de espo-
Después de la incubación se realizará el recuento ras de clostridios sulfito-reductores en el volumen
de las colonias negras y expresar el resultado de agua sembrado (100 ml).
como UFC/100 ml de muestra.

53
OTRAS DETERMINACIONES

Rara vez se hacen otras determinaciones micro-

biológicas en las aguas de abastecimiento aparte
de las consignadas. Así, cuando la determinación
de C. perfringens sea positiva y exista una turbi-
dez mayor a 5 UNF (Unidad Nefelométrica de
Formacina) se determinarán, en la salida de ETAP
(Estación de Tratamiento de Agua Potable) o
depósito, si la autoridad sanitaria lo considera
oportuno, Cryptosporidium u otros microorganis-
mos o parásitos. De igual modo, sólo en el caso
de un brote epidémico se lleva a efecto la investi-
gación de microorganismos transmitidos a través
del agua como Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,
etc.

NORMAS LEGALES VIGENTES

Real Decreto 140/2003 de 7 de febrero de 2003. BOE 21 de febrero de 2003

Artículo 17. Control de calidad del agua de consumo humano

"... (Tras el análisis de una muestra de agua de consumo humano), el agua se podrá cali-
ficar como "apta para el consumo" cuando no contenga ningún tipo de microorganismo,
parásito o sustancia, en una cantidad o concentración que pueda suponer un peligro para
la salud humana; y cumpla con los valores paramétricos ..."

Características microbiológicas
Parámetros microbiológicos (1) Valor paramétrico
Escherichia coli 0 UFC/100 ml
Enterococos 0 UFC/100 ml
Clostridium perfringens (incluidas las esporas) 0 UFC/100 ml

Parámetros indicadores (2) Valor paramétrico

Recuento de colonias a 22ºC 100 UFC/ml
Coliformes 0 UFC/100 ml

(1) Parámetros de obligado cumplimiento.

(2) En el caso de incumplimiento de estos parámetros, la autoridad sanitaria valorará la calificación del
agua como "apta o no apta para el consumo humano" en función del riesgo para la salud.

54
ANEXO

MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS

MEDIOS DE CULTIVO razón de 9-10 ml por tubo. Esterilizar en autoclave
a 121ºC durante 15 minutos y dejar solidificar en
posición inclinada.

Agar agua:
Agar 15 g Agar C.L.E.D
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Peptona de gelatina 4g
Extracto de carne 3g
Añadir el agar al agua y calentar hasta la fusión Triptona 4g
del mismo, mezclando bien. Dispensar en tubos Lactosa 10 g
en volúmenes de unos 3 ml y esterilizar en auto- L-cistina 0,128 g
clave a 121ºC durante 15 minutos. Azul de bromotimol 0,02 g
Agar 15 g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
Agar bilis-esculina-azida
Disolver los componentes en agua, a excepción
Triptona 17,0 g del agar, y ajustar el pH a 7,3. Añadir el agar y lle-
Peptona 3,0 g var a ebullición hasta disolver por completo.
Extracto de levadura 5,0 g Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu-
Bilis de buey, deshidratada 10,0 g tos. El medio estéril y atemperado a 50ºC se dis-
Cloruro sódico 5,0 g pensa en placas de Petri para obtener un espesor
Esculina 1,0 g de 3-5 mm y se deja solidificar.
Citrato férrico amónico 0,5 g
Azida sódica 0,15 g
Agar 15 g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml Agar de extracto de levadura
Triptona 6,0 g
Disolver los componentes en el agua por calenta- Extracto de levadura 3,0 g
miento suave, a excepción del agar. Ajustar el pH Agar 15 g
a 7,1. Añadir el agar y esterilizar en autoclave Agua destilada c.s.p. 1000 ml
durante 15 min a 121ºC. Atemperar a 50-60ºC,
repartir en placas de Petri para obtener un espe- Disolver los componentes en el agua, a excepción
sor de 3-5 mm y dejar solidificar. Las placas así del agar, calentando suavemente. Ajustar el pH a
preparadas pueden conservarse en la oscuridad 7,2. Añadir el agar y llevar a ebullición para disol-
hasta 2 semanas a 4ºC. ver por completo. Distribuir en tubos a razón de
15-20 ml. Esterilizar en autoclave a 121ºC duran-
te 15 min. Para su empleo, fundir el medio y man-
Agar citrato de Simmons tener a 45ºC en baño de agua. Es recomendable
no mantener el medio durante más de 4 h a 45ºC.
Sulfato de magnesio 0,2 g Transcurrido este tiempo el medio debe desecharse.
Fosfato dihidrógeno amónico 1g
Fosfato bipotásico 1g
Citrato sódico 2g
Cloruro sódico 5g Agar de hierro y sulfito:
Azul de bromotimol 0,08 g
Agar 15 g Triptona 10 g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Sulfito sódico 0,5 g
Citrato férrico 0,5 g
Disolver los componentes en el agua, a excepción Agar 15 g
del agar, y ajustar el pH a 6,8. Añadir el agar y lle- Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
var a ebullición envasando el medio en tubos, a

55
Disolver todos los componentes por calentamien- agar y llevar hasta ebullición para disolver el
to, a excepción del agar y ajustar el pH a 7,1. medio por completo. Repartir en matraces a razón
Añadir el agar y llevar hasta ebullición para la diso- de 100 ml y esterilizar en autoclave a 121ºC
lución total del mismo. Repartir a razón de 20 ml durante 15 minutos. En el momento de su empleo,
por tubo y esterilizar en autoclave a 121 ºC duran- fundir al baño María y añadir a cada matraz:
te 15 minutos. - 5 ml de solución acuosa de cloruro o bromuro de
2,3,5 trifenil-tetrazolio (TTC) al 0,05%, esterilizada
por filtración (diámetro de poro 0,22 µm). Esta
solución debe mantenerse en la oscuridad.
Agar F (medio King B)
- 5 ml de solución acuosa de heptadecil sulfato
Peptona 20 g sódico (tergitol 7) al 0,2% esterilizada en autocla-
Fosfato bipotásico 1,5 g ve a 121ºC durante 15 min.
Sulfato magnésico 1,5 g Mezclar bien y repartir en placas de Petri, dejando
Agar 15 g solidificar. El espesor del medio en las placas
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml debe ser como mínimo de 5 mm.

Disolver los componentes en el agua, a excepción Agar m-CP

del agar, y ajustar el pH a 7,0. Añadir el agar y 10
g de glicerol, calentando el medio hasta ebullición Triptosa 30 g
para que se disuelva por completo. Esterilizar en Extracto de levadura 20g
autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Dejar Sacarosa 5g
enfriar y dispensar el medio estéril en placas de L-cisteína monoclorhidrato 1g
Petri para obtener un espesor de 3-5 mm y se deja Sulfato magnésico
solidificar. heptahidratado 0,1 mg
Púrpura de bromocresol 40 mg
Agar 15 g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml
Agar fenilalanina
Extracto de levadura 3g Disolver los componentes en el agua, a excepción
Fosfato bipotásico 1g del agar, y ajustar el pH a 7,6. Añadir el agar y
Cloruro sódico 5g esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min.
DL-fenilalanina 2g Atemperar a 50-60ºC y añadir asépticamente:
Agar 12 g - 400 mg de D-cicloserina.
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml - 25 mg de sulfato de polimixina B.
- 60 mg de indoxil-b-D-glucósido (disueltos previa-
Disolver todos los componentes en el agua, a mente en 8 ml de agua destilada estéril).
excepción del agar, calentando suavemente y - 20 ml de solución de fenolftaleína difosfato al
ajustar el pH a 7,3. Añadir el agar calentando de 0,5% esterilizada por filtración (diámetro de poro
nuevo hasta ebullición y distribuir en tubos a razón 0,22 µm).
de 9-10 ml por tubo. Esterilizar a 121ºC durante 15 - 2 ml de solución de cloruro férrico hexahidratado
minutos y dejar solidificar en posición inclinada. al 4,5% esterilizada por filtración (diámetro de
poro 0,22 µm).

Agar lactosa-TTC con heptadecil sulfato

sódico Agar de Mossel (MYP: manitol-yema de
huevo-polimixina)
Extracto de carne 5g
Peptona 10 g Peptona 10 g
Lactosa 20 g Extracto de carne 1g
Extracto de levadura 6g D-manitol 10 g
Azul de bromotimol Cloruro sódico 10 g
(solución al 1%) 5 ml Fosfato amónico 1g
Agar 20 g Rojo fenol 0,025 g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Agar 15 g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
Disolver los componentes en el agua caliente,
excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Añadir el Disolver por calentamiento hasta ebullición, enfriar

56
a 50 ºC y ajustar el pH a 7,5. Esterilizar a 121 ºC Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
durante 15 minutos. Atemperar el medio a 45 ºC y
añadirle 10 ml de emulsión de yema de huevo al Disolver los componentes en el agua por calenta-
20% y 1 ml de solución de sulfato de polimixina B miento, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,1.
(1 mg/ml) previamente esterilizada por filtración Añadir el agar y llevar hasta ebullición, repartien-
por cada 110 ml de medio. do el medio en tubos de ensayo a razón de 15 a
Para preparar la emulsión de yema de huevo, 20 ml por tubo. Esterilizar a 121 ºC durante 15
remojar una docena de huevos de gallina en una minutos y dejar solidificar en posición inclinada.
solución 1:100 de cloruro mercúrico saturado en
agua durante 1 min, romper las cáscaras, separar
la yema de la clara de once de los huevos y
Agar P (medio King A)
mezclarla con el otro huevo completo. Tomar 20
ml de la mezcla, añadirlos a 80 ml de una solución Peptona 20 g
de cloruro sódico al 0,9% y mezclar. Esterilizar por Sulfato potásico 10 g
filtración y atemperar a 45-50 ºC. Cloruro magnésico 1,4 g
Agar 15 g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
Agar movilidad
Disolver los componentes en el agua, a excepción
Extracto de carne 3g del agar, y ajustar el pH a 7,0. Añadir el agar y 10
Peptona 10 g g de glicerol, calentando el medio hasta ebullición
Cloruro sódico 5g para que se disuelva por completo. Esterilizar en
Agar 4g autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Dejar
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml enfriar hasta 50 ºC y dispensar el medio estéril en
placas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.
Disolver todos los componentes en el agua, a
excepción del agar, calentando suavemente y
ajustar el pH a 7,3. Añadir el agar calentando de
Agar sangre
nuevo hasta ebullición y distribuir en tubos a razón
de unos 5 ml por tubo. Esterilizar a 121ºC durante Utilizar una base de agar nutritivo o de otro medio
15 minutos y dejar solidificar en posición vertical. más rico, como el agar triptona soja, al que se
añadirá en condiciones asépticas, una vez esteri-
lizado en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y
Agar Müeller-Hinton atemperado a 45-50ºC, un 5% de sangre de caba-
llo desfibrinada estéril. Mezclar suavemente para
Infusión de carne 300 g evitar la formación de burbujas y dispensar en pla-
Peptona de caseína 17,5 g cas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.
Almidón soluble 1,5 g
Agar 17 g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
Agar triptona soja
Disolver todos los componentes en el agua, a Triptona 15 g
excepción del agar, y ajustar a pH 7,3. Añadir el Peptona de soja 5g
agar y calentar hasta ebullición para que se disuel- Cloruro sódico 5g
va por completo. Esterilizar a 121 ºC durante 15 Agar 15 g
minutos y una vez atemperado a 50 ºC, dispensar Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
en placas de Petri estériles a razón de unos 20 ml
por placa, con el fin de obtener un espesor de 4 mm. Disolver todos los componentes en el agua,
excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Añadir el
agar y calentar hasta la ebullición, mezclándolo
Agar nutritivo suavemente para que se disuelva por completo.
Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minu-
Peptona 5g tos. Dejar enfriar hasta 50 ºC y dispensar el medio
Extracto de carne 1g estéril en placas de Petri hasta un espesor
Extracto de levadura 2g de 3-5 mm.
Cloruro sódico 5g
Agar 15 g

57
Agar TSC (triptosa-sulfito-cicloserina) Caldo de cultivo con triptófano
Triptona 15 g Triptona 10 g
Peptona de soja 5g L-Triptófano 1g
Extracto de levadura 5g Cloruro sódico 5g
Bisulfito sódico 1g Agua destilada c.s.p. 1000 ml
Citrato de hierro amoniacal 1g
Agar 15 g Disolver los componentes en el agua por calenta-
Agua destilada c.s.p. 1000 ml miento suave. Ajustar el pH a 7,5. Repartir en
tubos a razón de 3 ml por tubo. Esterilizar en auto-
Disolver todos los componentes en el agua, clave a 121ºC durante 15 min.
excepto el agar, y ajustar el pH a 7,4. Añadir el
agar y calentar hasta la ebullición, mezclándolo
suavemente para que se disuelva por completo.
Caldo nitratado
Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu-
tos. Dejar enfriar hasta 50 ºC, añadir cicloserina a Extracto de carne 3 g.
partir de una solución madre filtrada hasta una Peptona 5 g.
concentración final de 0,4 µg/ml. Dispensar el Nitrato potásico 1 g.
medio estéril en placas de Petri hasta un espesor de Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
3-5 mm.
Disolver en el agua todos los componentes por
calentamiento suave y ajustar el pH a 6,9.
Agar urea de Christensen Dispensar en tubos a razón de 10 ml por tubo y
Peptona 1g esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min.
Glucosa 1g
Cloruro sódico 5g
Fosfato monopotásico 2g
Medio fluido de tioglicolato
Rojo de fenol 0,012 g
Agar 15 g L-cistina 0,5 g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Cloruro sódico 2,5 g
Glucosa monohidrato 5,5 g
Disolver todos los componentes en el agua, a Extracto de levadura 5g
excepción del agar, y ajustar el pH a 6,8. Añadir el Digerido pancreático
agar y calentar hasta ebullición. Esterilizar en de caseína (triptona) 15 g
autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a Tioglicolato sódico 0,5 g
50ºC y añadir asépticamente 100 ml de una solu- Solución de resazurina
ción acuosa de urea al 20% esterilizada por filtra- sódica al 0,1% 1 ml
ción. Mezclar bien y distribuir en tubos estériles a Agar 0,75 g
razón de 9-10 ml por tubo, dejando solidificar en Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
posición inclinada con poca superficie y mucho
fondo. Añadir el tioglicolato sódico o el ácido tioglicólico a
la solución formada por el resto de los componen-
tes, excepto la solución de resazurina sódica y el
Agua de peptona agar que se añaden después de ajustar el pH a
7,1±0,2. Calentar hasta disolución total y distribuir
Peptona 10 g en tubos de 9 x 180 mm a razón de 5 ml por tubo
Cloruro sódico 5g y esterilizar a 121ºC durante 20 minutos.
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Mantener los tubos en posición vertical.

Disolver todos los componentes en el agua calen-

tando suavemente y ajustar el pH a 7,2. Dispensar
Medio de Hugh-Leifson
en tubos y esterilizar en autoclave a 121ºC duran-
te 15 minutos. Fórmula para la diferenciación de bacterias Gram
negativas:

Triptona 2g
Cloruro sódico 5g

58
 Fosfato bipotásico 0,3 g Medio de Slanetz y Bartley
Agar 3g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Triptosa 20,0 g
Extracto de levadura 5,0 g
Disolver todos los componentes en el agua, a Glucosa 2, 0 g
excepción del agar y ajustar el pH a 7,1. Añadir 15 Fosfato dipotásico 4,0 g
ml de azul de bromotimol al 0,2% y el agar, calen- Azida sódica 0,4 g
tando hasta ebullición para que se disuelva por Agar 15 g
completo. Distribuir en cantidades de 100 ml y Agua destilada c.s.p. 1000 ml
esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu-
tos. Atemperar a 45-50ºC y añadir asépticamente Disolver en el agua los distintos componentes por
a 100 ml de medio estéril, 10 ml de una solución calentamiento, a excepción del agar. Ajustar el pH
de glucosa al 10% esterilizada por filtración, mez- a 7,2. Añadir el agar. Esterilizar en autoclave a
clando a fondo. Dispensar asépticamente cantida- 121ºC durante 15 min. Atemperar a 50-60ºC y
des de 5 ml en tubos de cultivo estériles de 9 x añadir, asépticamente a 1000ml de medio estéril,
180 mm. Mantener los tubos en posición vertical. 10 ml de una solución acuosa al 1% de cloruro de
2, 3, 5-trifeniltetrazolio (TTC) esterilizada por filtra-
Fórmula para estafilococos y micrococos (modifi- ción (0,2 m). (se debe proteger la solución de
cación de Baird-Parker): TTC de la acción de la luz y descartarse cuando
aparezca una coloración rosada). Mezclar bien,
Triptona 10 g repartir en placas de Petri para obtener un espe-
Extracto de levadura 1g sor de 3-5 mm y dejar solidificar. Las placas así
Glucosa 10 g preparadas pueden conservarse en la oscuridad
Agar 2g hasta 2 semanas a 4ºC.
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, Medio de Voges-Proskauer

excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Añadir 20 ml
de púrpura de bromocresol al 0,2% y el agar, Peptona 7g
calentando hasta la disolución total del medio. Glucosa 5g
Dispensar en tubos de 9 x 180 mm a razón de Fosfato bipotásico 5g
unos 5 ml por tubo y esterilizar a 121ºC durante 15 Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
minutos. Mantener los tubos en posición vertical.
Disolver en el agua todos los componentes por
calentamiento suave y ajustar el pH a 6,9.
Dispensar en tubos a razón de 10 ml por tubo y
Medio Kligler esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min.
Extracto de carne 3g
Extracto de levadura 3g
Peptona 20 g Medio V.L. (para cultivo en profundidad)
Lactosa 10 g
Glucosa 1g Peptona 10 g
Citrato férrico 0,3 g Cloruro sódico 5g
Tiosulfato sódico 0,3 g Extracto de carne 2g
Cloruro sódico 5g Extracto de levadura 5g
Rojo de fenol 0,05 g Clorhidrato de L-cisteína 0,3 g
Agar 12 g Glucosa 2g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml Agar 6g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
Disolver en el agua los componentes, excepto el
agar y el rojo de fenol, y ajustar el pH a 7,4. Añadir Disolver todos los componentes en el agua,
el agar y el rojo de fenol, calentando hasta ebulli- excepto el agar, y ajustar el pH a 7,4-7,5. Calentar
ción para disolver el medio por completo. hasta la total disolución del medio y envasar en
Dispensar en tubos a razón de 12-15 ml por tubo tubos de 9 x 180 mm, a razón de 5 ml por tubo.
y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu-
minutos. Dejar solidificar los tubos en posición tos. Mantener en posición vertical.
inclinada de manera que se obtenga una buena
base.

59
 Azul de metileno
COLORANTES Y REACTIVOS
Solución al 0,3% en agua destilada.

Ácido nítrico Azul de metileno de Loeffler

Solución al 33% en agua destilada. Azul de metileno 0,3 g
Etanol de 95% 30 ml
Solución acuosa de hidróxido
Ácido sulfanílico potásico al 0,01% (p/v) 100 ml

Ácido sulfanílico 8g Preparar una solución saturada de azul de metile-

Ácido acético 5N 1000 ml no añadiendo el colorante en el etanol. Añadir
entonces, 30 ml del sobrenadante a la solución de
Disolver por calentamiento suave en una campa- hidróxido potásico.
na de gases.

Cloruro férrico
Agua oxigenada
Solución al 10% en agua destilada.
Solución al 3% en agua destilada.

Colorante de Albert
α-Naftilamina
Azul de toluidina 0,15 g
α-Naftilamina 5g Verde malaquita 0,20 g
Ácido acético 5N 1000 ml Ácido acético glacial 1g
Etanol 2 ml
Disolver por calentamiento suave en una campa- Agua destilada, c.s.p. 100 ml
na de gases.
Mezclar todos los componentes y filtrar después
de 24 horas.
α-Naftol
α-Naftol 6g Cristal violeta oxalatado (modificación de
Etanol de 96º 100 ml Hucker)
Disolver el compuesto en el etanol y almacenar en Solución A:
un frasco oscuro y en refrigeración durante un Cristal violeta 10 g
tiempo no superior a una semana, ya que es sen- Etanol de 95% 100 ml
sible a la luz y a la temperatura. Por ser un reacti-
vo inestable, conviene que sea preparado justo Solución B:
antes de usarse. Oxalato amónico 1g
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml

Mezclar 20 ml de la solución A y 80 ml de la solu-

Azul de lactofenol
ción B. Guardar durante 24 horas y filtrar a través
Ácido láctico 20 ml de papel de filtro.
Fenol 20 g
Azul de anilina 0,05 g
Glicerol 40 ml Etanol de 95% (vol/vol)
Agua destilada, c.s.p. 20 ml

Disolver el fenol en ácido láctico, glicerol y agua,

Fuchsina fenicada
calentando suavemente. Luego agregar el azul de
anilina (azul algodón, azul de Poirrier) Fuchsina básica 0,3 g

60
 Fenol 5 ml Ácido clorhídrico
Etanol de 95% 10 ml (ρ = 1´18 g/ml) 25 ml
Agua destilada, c.s.p. 100 ml
Disolver el aldehído en el alcohol y añadir el ácido
Disolver la fuchsina en el etanol y disolver el fenol, cuidadosamente. Proteger la solución de la luz y
una vez fundido, en el agua. Mezclar y dejar repo- conservar a 4ºC. Es conveniente que la coloración
sar varios días. Filtrar a través de papel antes de del reactivo se encuentre entre el amarillo claro y
su uso. el marrón claro (algunas muestras de alcohol amí-
lico no dan resultados adecuados y toman un color
oscuro al mezclarse con el aldehído.
Hidróxido sódico
Solución de hidróxido sódico al 40% en agua destilada. Rojo de metilo
Rojo de metilo 0,2 g
Lugol (solución yodo-yodurada) Etanol de 95% 600 ml
Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
Yoduro potásico 2g
Yodo 1g Disolver el rojo de metilo en el etanol, con ayuda
Agua destilada, c.s.p. 300 ml de un agitador magnético y a temperatura ambien-
te. Añadir entonces el agua destilada.
Disolver el yoduro potásico en un poco de agua y
agregar el yodo. Una vez disuelto, se agrega el
agua restante. Guardar en frascos de color ámbar. Safranina
Safranina O 0,25 g
Etanol de 95% 10 ml
Nigrosina de Dorner
Agua destilada, c.s.p. 100 ml
Nigrosina 10 g
Agua destilada, c.s.p. 100 ml Disolver la safranina en el etanol y añadir enton-
ces el agua destilada.
Añadir la nigrosina al agua y mezclar en un
matraz. Calentar en un baño de agua hirviendo
durante 20-30 minutos. Ajustar el volumen final a Solución salina
100 ml con agua. Como la nigrosina puede conta-
minarse con microorganismos, añadir 0,5 ml de Cloruro sódico 9g
formol como conservador. Filtrar dos veces a Agua destilada, c.s.p. 1000 ml
través de un papel de filtro doble.
Disolver el cloruro sódico en el agua por calenta-
miento suave y ajustar el pH a 6,6. Dispensar en
tubos y esterilizar en autoclave a 121ºC durante
Reactivo de Ehrlich
15 minutos.
p-Dimetilamino-benzaldehído 4g
Etanol de 95% 380 ml
Ácido clorhídrico concentrado 80 ml Verde malaquita
Disolver lentamente el reactivo en el alcohol, con Solución al 5% en agua destilada.
ayuda de un agitador magnético y a temperatura
ambiente, y añadir entonces el ácido. Guardar en
frigorífico y protegido de la luz.

Reactivo de Kovacs
p-Dimetilaminobenzaldehído 5g
Alcohol amílico o butílico
(exento de bases orgánicas) 75 ml

61
BIBLIOGRAFÍA

Beishir, L. "Microbiology in practice. A self-

instructional laboratory course". 5ª Ed. Harper
Collins Pub. Inc., 1991.

Case, C.L. y T.R. Johnson. "Laboratory experi-

ments in Microbiology". The Benjamin/Cummings
Publishing Company, Inc. 1984.

Claus, G.W. "Understanding microbes: A laborato-

ry textbook for microbiology". 1ª Ed. W.H.
Freeman and Co. New York, 1989.

Collins, C.H. y P.M. Lyne. "Microbiological meth-

ods". Butterworth & Co.(Pub) Ltd, 1985.

Díaz, R., C. Gamazo e I. López-Goñi. "Manual

práctico de Microbiología". 2ª Ed. Masson, S.A.
Barcelona, 1999.

Forbes, B.A., D.F. Sahm y A.S. Weissfeld.

"Bailey and Sccott's Diagnostic Microbiology". 11ª
Ed. The C.V. Mosby Company, 2002.

Gerhardt, P., R.G. Murray, W.A. Wood y N.R.

Krieg "Methods for general and molecular
bacteriology". American Society for Microbiology,
Washington, 1994.

Koneman, E.W., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C.

Schreckenberger y W.C. Winn. "Diagnóstico
microbiológico. Texto y atlas en color". 5ª Ed.
Panamericana, 1999.

Seeley, H.W., P.J. Vandemark y J.L. Lee.

"Microbes in action. A laboratory manual of
Microbiology". 4ª Ed. W.H. Freeman, New York,
1991.

62
 PRIMERA SEMANA
Preparación de Esterilización Observación en
LUNES medios de de medios de fresco
cultivo líquidos cultivo
y sólidos Tinción simple
Siembras de Control Tinción de
MARTES microorganis- ambiental Gram
mos aerobios y
anaerobios en
medios líquidos
y sólidos.
Tipo
respiratorio
Lectura de Análisis Tinción
MIÉRCOLES siembras microbiológico negativa
de aguas de
Lectura del tipo consumo
respiratorio humano
Hacer informe Control Lectura y Siembra de la
JUEVES ambiental: ensayos mezcla
Tinción de confirmativos problema
Gram de las de coliformes y
colonias C.perfringens.
Lectura y Lectura de la Tinción de
VIERNES ensayo mezcla esporas
confirmativo de problema.
enterococos Tinción de
y de Gram y
coliformes. reaislamiento
SEGUNDA SEMANA
Control Recuento de Pruebas de
LUNES ambiental: colonias a 24ºC identificación
Observación de de los
hongos. Hacer informe microorganis-
mos de la
Hacer informe mezcla
problema
Pruebas de Tinción de
MARTES identificación corpúsculos
complementa- metacromáticos
rias
Antibiograma Lectura de Tinción AAR
MIÉRCOLES por difusión. pruebas
complementa-
Antibiograma rias
por dilución Detección de
pigmentos
Lectura de los Lectura de Siembra en
JUEVES antibiogramas producción de CLED para
pigmentos. examen
Hacer informe Hacer informe

VIERNES E X A M E N