Extracción de antocianinas

Bárbara González
Fisiología Vegetal
7 Octubre 2019
Resumen
Las antocianinas son pigmentos fitoquímicos fenólicos de colores rojo, azul y morado los
cuales son encontrados en ciertas flores y frutas, ayudando a la polinización de estas,
además, se caracterizan por sus propiedades antioxidantes. En el presente práctico, se
determinó la concentración de antocianinas, por espectrofotometría, en una muestra
vegetal de repollo morado, mediante la utilización de dos soluciones con pH 1 y 4,5 (KCl y
AcNa) lo que modifica las propiedades de las antocianinas. Además, se cuantificó su
capacidad antioxidante, utilizando técnicas como el ensayo TEAC que evalúa la capacidad
de los antioxidantes de una muestra para neutralizar un radical libre. Finalmente, para la
muestra de repollo morado, se obtuvo una concentración de antocianinas de 228,440 y
226,437 [mg/L] y una capacidad oxidante de 1565,85 y 2046,18 [µM TE].

Introducción
Las antocianinas son pigmentos de color azul, rojo y morado que pertenecen a una de las
subclases de fitoquímicos fenólicos y está en la forma glicosilada. Son encontrados en
plantas, principalmente en flores, frutas y tubérculos. La mayoría de las flores de color rojo,
azul o morado tienen antocianinas. Las antocianinas de las bayas, zarzaparrilla y otros
frutos con coloración roja-azul son altamente antioxidantes. Además, la zanahoria negra,
repollo morado, papa morada y otros alimentos son consumidos por las personas para
prevenir enfermedades. Los pigmentos se han utilizado como tinturas y colorantes para
comidas y para tratar varias enfermedades ya que posee efectos antidiabéticos, anticáncer,
antiinflamatorios, antimicrobial, antiobesidad y prevención de enfermedades
cardiovasculares (He, K & cols., 2011). Por otro lado, en las plantas funcionan como
protección de la radiación UV, atracción de insectos polinizadores, impedimento de la
congelación de las frutas y para atraer a depredadores a que consuman el fruto,
dispersando así las semillas ayudando a la reproducción de la especie. (Eng Khoo, H &
cols., 2017)
En condiciones acídicas las antocianinas aparecen como pigmentos rojos mientras que los
pigmentos azules existen en condiciones alcalinas. Este pigmento es considerado como un
flavonoide a pesar de que tiene una carga positiva en el átomo de oxigeno del anillo de
carbono. La estabilidad de las antocianinas depende del pH, luz, temperatura y su
estructura. (Eng Khoo, H & cols., 2017)
Debido a la complejidad de la composición de los alimentos, separar cada compuesto
antioxidante y estudiarlo individualmente es costoso e ineficiente. Por lo tanto, es muy útil
tener un método para la cuantificación rápida de la eficacia antioxidante en la prevención
de enfermedades. (Huang, D & cols., 2005) Debido a su simplicidad operativa, el ensayo
TEAC se ha utilizado para estudiar la capacidad antioxidante. El ensayo TEAC evalúa
también la capacidad de los antioxidantes de una muestra para “apagar o neutralizar” un
radical libre empleando como radicales libres moléculas que difieren totalmente de
cualquier radical libre o especie reactiva generada por nuestro organismo. En este caso se
utiliza el radical ABTS•+ (Jiménez-Pérez & cols., 2008)
El objetivo del práctico es determinar la concentración de antocianinas y su capacidad
antioxidante de una muestra vegetal.
Resultados
En una primera instancia se determinó la concentración de antocianinas utilizando la
ecuación (1) a través de la absorbancia de soluciones con KCl y AcNa. Posteriormente, se
calculó la capacidad antioxidante mediante el ensayo TEAC.
Determinación de la concentración de antocianinas
Se midió la absorbancia (520 y 700nm) a cuatro muestras de sobrenadante, las cuales
estaban en soluciones de KCl y Acetato de sodio, de forma duplicada.
Tabla I. Absorbancia para soluciones de antocianina con KCl y AcNa. valores de absorbancia a 520nm y
700nm para soluciones con KCl y AcNa (acetato de sodio). (1) y (2) demuestra los duplicados.

Absorbancia a 520 nm Absorbancia a 700 nm

KCl (1) 0,407 -0,004
KCl (2) 0,503 0,015
AcNa (1) 0,081 0,016
AcNa (2) 0,149 0
Blanco 0,003 0

El valor de la absorbancia para KCl (1) para 700 nm, fue considerado como cero para
efectos de los cálculos.
Utilizando las ecuaciones (1) y (2) se obtuvieron los siguientes valores de concentración:
Tabla II. Absorbancia y concentración de antocianinas. Valores de absorbancia y concentración de
antocianinas para las muestras, utilizando las ecuaciones (1) y (2)

Absorbancia1 Absorbancia2 Concentración (1) Concentración (2)

[mg/L] [mg/L]
0,342 0,339 228,440 226,437

Determinación de la capacidad antioxidante

Se determinó la capacidad antioxidante de una muestra vegetal de repollo morado
duplicada, utilizando una solución madre de radicales libres. La dilución que se utilizó fue
1:10. Por lo tanto, el factor de dilución es 10, el cual está aplicado en la tabla IV.

Tabla III. Absorbancia de solución madre y antocianinas. Valores de absorbancia para la solución madre y
la de antocianina a 734nm a 0 y 1 minuto.

Soluc. Madre 734nm soluc. Diluida 734nm

(1) t=0 0,744
(1) t= 1min 0,471
(2) t=0 0,728
(2) t= 1min 0,372
Para determinar la capacidad antioxidante se utilizó la ecuación (3), en donde, Y
corresponde a la diferencia de absorbancia entre la solución madre y la solución de
antocianinas diluida y X corresponde a la capacidad antioxidante a determinar.
Tabla IV. Capacidad antioxidante [ µM TE]. Diferencia de absorbancia entre la solución de radicales libres
(madre) y la solución diluida de antocianinas utilizando un factor de dilución de 10. Capacidad antioxidante
para ambas muestras replicadas.

Diferencia de Diferencia de Capacidad Capacidad

absorbancia soluc. absorbancia soluc. antioxidante [µM antioxidante [µM
Madre y diluida (1) Madre y diluida (2) TE] (1) TE] (2)
(x10) (x10)
2,73 3,56 1565,8565 2046,1806

Discusión
Las antocianinas son pigmentos fenólicos naturales encontrados en plantas, que le otorgan
coloración rojo, azul y morado a frutas, flores, hojas y vegetales, jugando un rol importante
en la polinización y la dispersión de semillas. Además, tienen reconocidas propiedades
antioxidantes.
Se determinó la concentración de antocianinas en una muestra vegetal de repollo morado
y la capacidad antioxidante de ésta mediante un ensayo TEAC.
Concentración de antocianinas
El repollo morado tiene un gran valor nutricional ya que es rico en minerales, vitaminas,
oligosacáridos y una serie de sustancias bioactivas, como antocianinas, flavonoides y
glucosinolatos. Las antocianinas tienen patrones de hidroxilación, metoxilación,
glicosilación y acilación. El repollo morado tiene una gran cantidad de antocianina cuya
estructura principal son glucósidos de iscianidina. (Wiczkowski, W & cols. 2013).
Mediante la ecuación (1) se determinó la concentración de antocianinas, midiendo la
absorbancia de soluciones de KCl (pH 1) y AcNa (pH 4,5) a 520 y 700nm. Lo que otorgó
una concentración de 228 y 226 [mg/L] (Tabla I y II). Este valor está dentro del rango de
otras muestras del mismo vegetal (Anexo. Tabla I), en donde las concentraciones van
desde 27 [mg/L] hasta 436 [mg/L], siendo el promedio aproximado 183 [mg/L]. En relación
con otras muestras vegetales el repollo morado presenta las mayores concentraciones de
antocianina por sobre la frutilla, una serie de muestras florales y cebolla morada. Sin
embargo, el arándano posee la mayor concentración de este pigmento, aproximadamente,
2,5 veces más que el repollo morado.
Estos valores son mayores a los encontrados en la literatura. Se ha reportado valores de
concentración de antocianinas para repollo morado desde 2,2 [mg/L] a 65,4 [mg/L] para 5g
de muestra y para arándanos de 70 a 86 [mg/L] (Vieira, L & cols., 2019)
El pH, puede afectar el color y la estabilidad de las antocianinas, lo que puede conducir a
cambios en las propiedades. En un medio ácido, las antocianinas están en forma de sales
de ozono con un color rojo brillante. A medida que el pH aumenta a neutral, tienden a tener
una estructura quinoidal con una coloración morada y en un medio alcalino, su tono cambia
a azul (Vieira, L & cols., 2019). Al comparar los dos solventes KCl y AcNa en la tabla I, se
observa que la absorbancia es menor con la solución de mayor pH, mientras es mayor con
la más ácida.
La longitud de onda utilizada para medir la absorbancia es de 520nm que está dentro del
rango de absorción de las antocianinas que es de 490 a 550 nm. (Dzomba, 2013)
Capacidad Antioxidante
El Ensayo TEAC (capacidad antioxidante equivalente de Trolox) se basa en la capacidad
de las moléculas antioxidantes para extinguir el ABTS de larga vida, un cromóforo azul-
verde con absorción característica a 734 nm, en comparación con el de Trolox, un análogo
de vitamina E soluble en agua. La adición de antioxidantes al catión radical preformado lo
reduce a ABTS, determinando una decoloración. (Pellegrini & cols, 2003)

Se ha reportado valores promedio de 2870 [µmol trolox/L] para diferentes cultivos de repollo
morado mediante el ensayo TEAC (Pliszka & cols, 2009), que se acerca a la capacidad
antioxidante de 1565-2046 [µmol trolox/L]. Sin embargo, hay muestras con hasta 15075 y
66 [µmol trolox/L]. En la tabla II (Anexo) se observa que la muestra de arándanos también
tiene una alta capacidad antioxidante lo que concuerda con su alta concentración de
antocianina respecto a las demás muestras.

En la Tabla III se muestran los valores obtenidos de la absorbancia de la muestra madre a

tiempo 0 y luego de agregar la solución de antocianinas. La absorbancia disminuye una vez
que es agregada la solución ya que las propiedades antioxidantes de las antocianinas
reducen el radical a ABTS, por lo tanto, disminuye la concentración y absorbancia de la
muestra. (Pellegrini & cols, 2013)

Los objetivos del práctico se lograron ya que se cuantificó la concentración de antocianinas

en una muestra vegetal y se comparó con una serie de otro tipo de muestras vegetales y
florales. Además, se determinó la capacidad antioxidante mediante un ensayo TEAC para
estas muestras.

Materiales y métodos
Extracción de Antocianinas
Como muestra vegetal se eligió repollo morado. Se masó 2 gramos de la muestra y maceró
en un mortero utilizando 4mL de etanol 70% ácido. El macerado se traspasó a un tubo
Falcon y se agregó etanol ácido hasta 5mL. Se agitó en un vórtex por un minuto, apróx y
se centrifugó por 5 minutos. Se recuperó el sobrenadante en otro tubo Falcon de 15mL.
Todo se realizó en duplicado.
Determinación de la concentración de antocianinas
Se diluyó el extracto a 1:40 con un volumen final de 1mL para una solución de KCl y otra
de acetato de sodio. (1mL de KCl y 25uL de sobrenadante). Posteriormente se midió la
absorbancia a 520 y 700nm.
Para determinar la concentración de antocianinas, se utilizó la siguiente ecuación:
Absorbancia = (A520-A700)pH1,0 – (A520-A700)pH 4,5 (1)
Concentración antocianinas [mg/L] = A*449,2*FD*(1000/26900) (2)
Donde (A520 y A700)pH1,0, corresponde a la absorbancia a 520 y 700 para la muestra de
KCl, mientras (A520 y A700)pH 4,5, corresponde a la muestra de AcNa. FD corresponde al
factor de dilución.

Determinación de la capacidad antioxidante

La solución de radicales libres “madre” fue otorgada por las ayudantes. Se diluyó la muestra
utilizando 100uL del sobrenadante en 900uL de agua destilada. A continuación, se midió la
absorbancia a 734nm de 2mL de la solución de radicales libres, correspondiente al tiempo
cero. Luego, en otra cubeta, se agregó 100uL de la muestra diluida, se homogeneizó y
luego de 1 minuto se midió la absorbancia a 734nm.
Para determinar la capacidad antioxidante se utilizó la siguiente ecuación obtenida de una
curva de calibración:
Y = 0,001728*X + 0,02420 (3)
Referencias
Dzomba, P. (2013). “Anthocyanin content and antioxidant activities of common bean
species (Phaseolus vulgaris L.) grown in Mashonaland Central, Zimbabwe”. in African
journal of agricultural research 8(25):3330-3333

He K, Li X, Chen X. Ye X & cols. (2011). “Evaluation of antidiabetic potential of selected

traditional Chinese medicines in STZ-induced diabetic mice”. J Ethnopharmacol.
2011;137(3):1135–1142

Huang, D., Ou, B. & Prior, RL. (2005). “The Chemistry behind Antioxidant Capacity
Assays” Agric. Food Chem. 2005,53,1841−1856

Jiménez-Pérez, J., Arranz, S., Taberno, M & cols. (2008). “Updated methodology to
determine antioxidant capacity in plant foods, oils and beverages: Extraction,
measurement and expression of results”. Food Res Inter. 2008; 41(3): 274-285.

Khoo, H. E., Azlan, A., Tang, S. T., & Lim, S. M. (2017). “Anthocyanidins and
anthocyanins: colored pigments as food, pharmaceutical ingredients, and the potential
health benefits”. Food & nutrition research, 61(1), 1361779.

Pliszka, B., Huszcza-Ciołkowska, G., Mieleszko, E., & Czaplicki, S. (2009). “Stability
and antioxidative properties of acylated anthocyanins in three cultivars of red cabbage
(Brassica oleraceaL. var. capitata L. f. rubra)”. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 89(7), 1154–1158.

Vieira, L., Marinho, L., Rocha, J., Barros., F. & cols. (2019). “Chromatic analysis for
predicting anthocyanin content in fruits and vegetables”. Food Science and
Technology, 39(2), 415-422.
 ANEXO

Tabla I. Concentración de Antocianinas.

Tipo de muestra Antocianinas (mg/L) Absorbancia

1 flor de cardenal 149,62
140,27
2 Repollo morado 426,82 0,639 (delta)
370,05 0,554 (delta)
3 Repollo morado 103,533 0,155
114,888 0,172
4 Frutilla 56,78 0,085
97,52 0,146
5 Arandano 407,45 0,122
460,89 0,138
6 Frutilla 54,772 0,082
82,826 0,124
7 Flor de la pluma 204,39 0,153
205,73 0,154
8 Arándano 447,53 0,067
507,646 0,076
Flor de Buganvillia
9 glabra 50.76 0,076
58.11 0,087
10 Frutilla 34,07 0,051
39,41 0,059
11 Repollo morado 27,38 0,041

12 Repollo Morado 228,44 0,342

226,44 0,339
13 cebolla morada 177,6 0,266

14 Repollo morado 126,2 0,189

118,8 0,178
Tabla II. Capacidad antioxidante
Factor de
Tipo de muestra Equivalentes Trolox (uM TE) Absorbancia dilución
1 flor de cardenal 35694,4
36504,6
2 Repollo morado 4212,96 0,097 (delta)
3113,43 0,078 (delta)
3 Repollo morado 15075,2 0,2605 (delta) 10
13078,7 0,226 (delta) 10
4 Frutilla 11632 0,201 (delta) 100

5 Arandano 3148,15 0,133(delta Abs) 50

4652,78 0,185 (delta Abs) 50
6 Frutilla 11581,79 0,224 100
11446,76 0,222 100
7 Flor de la pluma 2041,67 0,377 10
2464,12 0,45 10
8 Arándano 4430,94 0,177 50
6533,56 0,25 50
9 Flor Buganvillia glabra 266.53 0,431
235.41 0,463
10 Frutilla 23,80401235 0,065 ---
14,15895062 0,048 ---
11 Repollo morado 81,67 0,165 20
66,62 0,139 -
12 Repollo morado 1565,86 2,73 10
2046,18 3,56
13 3055,55 0,077 100

14 Repollo morado 7314,81 0,277 50

7066,35 0,267 50