REPORTE DE PRÁCTICA

LABORATORIO DE ABASTECIMIENTO DE
AGUA POTABLE

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA SANITARIA Y AMBIENTAL

CARACTERIZACIÓN
MICROBIOLÓGICA

PRÁCTICA NÚMERO: 2

Alumno: Santiago Delgado Oscar Alexis

Profesor: JAVIER EVERETT OLVERA CÉSAR

Grupo: 07

Calificación:

Ciudad Universitaria, Cd.Mx, a 13 de agosto de 2018

Objetivos de aprendizaje:
Comprender por qué se utilizan los organismos coliformes como indicadores de la
calidad del agua, y determinar los coliformes totales y fecales en diferentes
muestras de agua.

Introducción:
El análisis bacteriológico del agua es vital en la prevención de epidemias como resultado
de la contaminación del agua. El examen bacteriológico de abastecimiento de agua no
implica la búsqueda directa de los gérmenes patógenos. El ensayo se basa en el
supuesto de que todas las aguas contaminadas con desechos humanos o animales son
potencialmente peligrosas. Por consiguiente, el control sanitario del agua se hace con
métodos bacteriológicos para determinar la presencia de contaminación fecal. Las
pruebas para la determinación de patógenos no se usan rutinariamente debido a que
detectarlos en diluciones altas es muy difícil y además se encuentran en número muy
inferior al de las bacterias entéricas, las cuales tienen una tasa de mortalidad mucho más
lenta. El examen bacteriológico del agua usualmente involucra dos ensayos: la estimación
del número de bacterias de acuerdo con el conteo total en placa y la determinación, más
significativa, de la presencia o ausencia de miembros del grupo coliforme.

El grupo coliforme incluye a todas las bacterias en forma de bastoncillos que son aerobias
o anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporogéneas, que fermentan la lactosa
con producción de gas en un medio de cultivo prescrito en un período de 48 horas, a 35
[ºC]. El número de organismos coliformes en el excremento humano es muy grande; la
excreción diaria por habitante varía entre 125x109 y 400x109 número de unidades
formadoras de colonias. Su presencia en el agua es considerada como un indicador de
contaminación fecal y por lo tanto, de contaminación con organismos patógenos. En
aguas residuales la relación de organismos coliformes con organismos entéricos
patógenos es muy grande, del orden de 106 /1. Los coliformes no solamente provienen
del excremento humano sino también pueden encontrarse en los desechos de animales
de sangre caliente, animales de sangre fría y en el suelo. Por lo tanto, la presencia de
coliformes en aguas superficiales indica contaminación proveniente de residuos humanos,
animales o erosión del suelo separadamente, o de una combinación de las tres fuentes.
Aunque no es posible distinguir entre coliformes de origen humano o animal, existe un
ensayo especial para diferenciar entre coliformes fecales y coliformes del suelo. Para el
efecto, se usa un medio de cultivo EC para incubación a 44.5º C durante 24 h. Este
ensayo no reemplaza la técnica usual, pero es aplicable en estudios de contaminación de
ríos, fuentes de agua cruda, sistemas de tratamiento de aguas residuales y aguas para
recreación. Para determinar la presencia de bacterias del grupo coliforme se aceptan dos
métodos: el método de los filtros de membrana y el método de los tubos múltiples de
fermentación.
Técnica del Filtro de Membrana

Todos los organismos que producen una colonia oscura, generalmente verde púrpura
con brillo metálico, después de incubación por 24 horas, en medio de cultivo ENDO son
considerados miembros del grupo coliforme. El brillo metálico puede cubrir la colonia
entera o aparecer solamente en la parte central o en la periferia. La cantidad ideal de
muestra que se ha de filtrar debe ser aquella que produzca un crecimiento de máximo 30
colonias de coliformes. Cuando se filtran porciones de menos de 20 ml, la muestra debe
diluirse y filtrarse un volumen mínimo de 30 ml. Los filtros preparados se colocan
directamente sobre el medio nutriente y se incuban, normalmente, durante 24 horas, a 37
[ºC] ó 35 [ºC]. El procedimiento consiste en hacer pasar a través de un filtro de
membrana, aplicando vacío, un volumen medido de muestra de agua. A continuación se
coloca el filtro en un recipiente estéril y se incuba en contacto con un medio de cultivo,
selectivo y diferencial. En cada punto del filtro en el que durante la filtración se capta una
bacteria coliforme, se desarrollará una colonia de bacterias coliformes. Se enumeran las
colonias bacterianas, practicándose un cálculo simple para determinar el número de
colonias de bacterias en 100 ml de muestra.
Desarrollo:
Actividad .1

1. Medir 100 ml de agua de muestra.

2. Colocar el soporte de borosilicato en la boca del matraz Kitasato.
3. Utilizar pinzas estériles para sacar un filtro de su empaque y colocarlo sobre el soporte.
4. Colocar el matraz invertido en la parte superior del matraz Kitasato.
5. Agregar al matraz invertido los 100 ml de agua medidos previamente.
6. Conectar la bomba de vacío en la boquilla del matraz.
7. Hacer funcionar la bomba de vacío hasta que toda el agua pase al matraz.
8. En una caja Petri añadir sobre el cojín absorbente el medio de cultivo coli blue, el cual permite
determinar a los coliformes totales y fecales en un mismo ensayo.
9. Con las pinzas estériles retirar el filtro del equipo y colocarlo en la caja Petri, previamente
marcada en la parte inferior con la cuadrícula hacia arriba.
10. Cerrar la caja Petri y colocarla en la incubadora, con el cojín absorbente y el papel filtro hacia
arriba, a 35 [ºC].
A las 24 horas de haber hecho la filtración se debe revisar las cajas Petri para ver si hay
formaciones de colonias de coliformes.
Actividad 2

Observe las cajas Petri después de 24 horas de haber hecho la filtración, y cuente
las colonias que se formaron, en caso de que así sea.

En estas cajas se observan puntos, los cuales cada uno son una colonia de microorganismos.
En esta caja se observa que la prosperidad de las colonias es casi nula.
En esta caja no se encuentran puntos lo que indica que no existen colonias.
Actividad 3

1) Investigue y describa como se realiza la técnica de tubos múltiples de

fermentación.

TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES PARA COLIFORMES

TOTALES Y FECALES.

Técnica de fermentación en tubos múltiples para coliformes totales y fecales.

Los coliformes están conformados por varios géneros bacterianos de la familia

Enterobacteriaceae y la definición clásica de este grupo está basada en la
fermentación de la lactosa. Cuando se usa la técnica de fermentación de tubos
múltiples, el grupo coliforme se define como: bacterias Gram negativas,
anaerobias facultativas, no esporuladas, en forma de bastón, fermentadoras de la
lactosa con producción de gas y ácido en 48 horas a una temperatura de 35°C.
Los coliformes fecales, además, fermentan la lactosa con producción de ácido y
gas a 44.5°C.

En la técnica de fermentación por tubos múltiples, los resultados se expresan en

términos de Número Más Probable (NMP) en 100 mL. Este número está basado
en ciertas fórmulas de probabilidad y es un estimado de la densidad media de
coliformes en la muestra.

La precisión de cada prueba es función de:

El número de diluciones realizadas que depende de la experiencia del analista y la
procedencia de la muestra; es inversamente proporcional.
Presencia de gas y turbiedad en algunos o todos los tubos con mayor inóculo,
directamente proporcional.
Ausencia de gas y turbiedad en algunos o todos los tubos con menor inóculo,
inversamente proporcional.

La técnica tiene 3 fases: presuntiva, confirmativa y completa. En la fase

presuntiva se utiliza el caldo lauril triptosa y la fase confirmativapara coliformes
totales utiliza el caldo verde bilis brillante y para coliformes fecales el caldo EC.
La fase completa se realiza para llevar un control de calidad y permite establecer o
no la presencia de coliformes.
Este procedimiento aplica para determinar el número estimado de coliformes
totales y fecales en todo tipo de agua, aunque no está permitido por la legislación
actual para agua potable. Las condiciones ambientales de temperatura y
humedad, no son críticas para la realización de este ensayo. La dilución (de ser
necesaria) y la siembra de la muestra, deben realizarse en la cabina de flujo
laminar.
Selección del volumen de la muestra a inocular
Según la naturaleza de la muestra, seleccione las diluciones a emplear en la fase
presuntiva, teniendo presente que cada una está compuesta por una serie de
cinco tubos.
Elija la cantidad de muestra a sembrar con base en la densidad probable de
coliformes presentes en la muestra y siembre en cada una de las series las
cantidades de muestra o la dilución correspondiente.
Para decidir el número de series a emplear y la cantidad de su inóculo, tenga en
cuenta las experiencias anteriores, la procedencia de la muestra y el hecho de que
en época de lluvia, el número de coliformes puede aumentar en 1 o más diluciones
en las aguas superficiales incluidas las de ciénagas y mar mientras que su número
puede disminuir en las aguas residuales domésticas.
En la medida que se sospeche un alto número de coliformes, la cantidad de
muestra a inocular será menor. Por ejemplo, para un agua con una probable
densidad escasa de coliformes, siembre 5 tubos por cada una de las siguientes
concentraciones de muestra: 10, 1, 0.1, 0.01 mL. Por lo general, se utilizan de 3 a
5 series de tubos.

Diluciones

La muestra y sus respectivas diluciones deberán ser agitadas antes de proceder a

sembrarlas o a realizar otras diluciones. Cuando sea necesario, haga las
diluciones decimales pertinentes; para esto, emplee tubos o frascos de dilución
con un volumen fijo de 9 ó 99 mL de agua de dilución estéril. Tenga presente que
una vez esterilizados los frascos, el volumen de diluyente puede disminuir, por lo
que se requerirá restablecer su cantidad antes de utilizarlos.

Considere el volumen de 1 mL de muestra como la concentración de 100. Para

realizar una dilución 10-1, adicione 11 mL de muestra a 99 mL de diluyente ó 1
mL de muestra a 9 mL de diluyente. Para realizar una dilución 10-2, agregue 1 mL
de muestra a 99 mL de diluyente ó 0.1 mL de muestra a 9.9 mL de diluyente. Si
desea obtener una dilución decimal mayor haga las diluciones correspondientes a
partir de la dilución inmediatamente anterior y sume los decimales para conocer la
dilución final. Cuando la muestra sea turbia, nunca siembre directamente 0.1 mL o
menos; en estos casos, emplee 1 u 11 mL de muestra para realizar la dilución
correspondiente.
Siembra e incubación de la muestra

Fase Presuntiva:

El medio de cultivo utilizado es el caldo lauril triptosa. Una vez realizada las
diluciones necesarias, siembre el mismo volumen en cada uno de los 5 tubos de la
serie, agítelos o mézclelos por inversión e incúbelos a 35 ± 1°C. A las 24 ± 2
horas, observe turbiedad en el medio y/o producción de gas en el tubo Durham e
incube nuevamente aquellos tubos negativos hasta 48 ± 3 horas para detectar los
coliformes que son fermentadores lentos de la lactosa. La prueba será positiva si
hay crecimiento con producción de gas dentro de las 48 horas.

Fase Confirmativa:

1) Coliformes totales

Sistemáticamente, confirme aquellos tubos que hayan resultado positivos a las 24

± 2 horas y proceda igual con aquellos tubos que hayan resultado positivos a las
48 ± 3 horas.

Para esto, siembre en caldo bilis verde brillante, una o más asadas del tubo
positivo. La presencia de gas y turbiedad que aparezca en los tubos durante un
período de incubación de 6 a 48 ± 3 horas a 35 ± 1°C, será considerada positiva la
prueba confirmativa de coliformes totales.

Procedimiento alternativo para confirmar los Coliformes Totales

Cuando se procesan aguas residuales o se conoce que el agua es contaminada y

todos los tubos de la fase presuntiva son positivos en 2 ó más diluciones
consecutivas dentro de las 24 horas, someta únicamente a confirmación aquellos
tubos de la más alta dilución en el cual todos los tubos son positivos y cualquier
tubo positivo después de estos.

2) Coliformes fecales

Repicar los tubos positivos de la fase presuntiva en caldo EC e incubar a 44.5 ±

0.5°C hasta por 24 ± 2 horas en baño serológico. La turbiedad y producción de
gas en los tubos, significa que la prueba confirmativa es positiva para coliformes
fecales.
Lectura

La lectura final de la prueba se hace una vez terminado el tiempo de incubación de

la fase confirmativa y se anotan como tubos positivos para coliformes totales y
fecales, aquellos en los que haya crecimiento con formación de gas y turbiedad.

Una vez contados el número de tubos positivos de cada una de las series,
proceder a elegir a 3 de éstas. Elimine la dilución más alta (menor volumen) si
tiene todos los tubos negativos y queda al menos una dilución con un tubo
negativo. Elimine la más baja dilución (mayor volumen de muestra) si todos los
tubos son positivos y queda al menos una dilución con un tubo positivo. Si la más
baja dilución no tiene todos los tubos positivos y algunas de las mayores
diluciones tiene todos los tubos negativos, elimine éstas últimas.

Si la mayor dilución con todos los tubos positivos difiere no más de dos diluciones
de la mayor dilución con algún tubo positivo, seleccione la mayor dilución con
algún tubo positivo y las otras dos diluciones inmediatamente más bajas.
Si después de eliminar la menor dilución con todos los tubos positivos, ninguna
otra tiene todos los tubos positivos, seleccione las dos diluciones más bajas y
asigne la suma de los tubos positivos de las diluciones remanentes a la tercera
dilución.

Si ninguna dilución tiene todos los tubos positivos, seleccione las dos diluciones
más bajas y asigne la suma de los tubos positivos de las diluciones remanentes a
la tercera dilución

Una vez elegidas las 3 series a tener en cuenta para la búsqueda del NMP,
proceda a buscarlo en la Tabla
Fase completa

Para confirmar la presencia de bacterias coliformes y como control de calidad del

procedimiento, es necesario realizar la fase completa en al menos el 10% de los
tubos positivos de caldo verde bilis brillante de la fase confirmativa, de la siguiente
manera:
Siembre por aislamiento cada uno de los tubos positivos seleccionados en agar
Endo LES o agar MacConkey, incube las placas invertidas por 24 ± 2 horas a 35 ±
1°C.
Transcurrido el tiempo de incubación, tome al menos una colonia típica (en agar
Endo LES son de color rosa a rojo oscuro con un brillo metálico y en agar
Mcconkey se ven rojas con una zona opaca) y si hubiese colonias atípicas, tome
al menos dos; siémbrelas
En agar nutritivo inclinado e incube a 35 ± 1°C por 24 ± 2 horas. De ocurrir
crecimiento, realice la coloración de Gram (véase IE_51).
En caldo lauril triptosa con tubo de Durham e incube 35 ± 1°C hasta 48 horas.
La formación de gas y la presencia de cocobacilos Gram negativos no
esporulados, constituyen un resultado positivo de la prueba completa.

Con el objetivo de conocer la precisión, deben analizarse periódicamente

duplicados. Estos se tomarán de la misma muestra original y serán analizados
como dos submuestras, ambas con el número de tubos y diluciones semejantes a
si se tratara de una muestra única.

Cálculos y presentación de resultados

Los resultados se informarán en NMP/100 mL. Elabore el respectivo informe
colocando un máximo de 3 dígitos, en el caso de que existan más, informe 2
dígitos con su respectivo exponencial. También se podrá aproximar los valores de
NMP fraccionados a enteros con el fin de evitar confusiones en personal no
especializado.
Como regla general, aproxime al número entero inmediatamente superior, cuando
el decimal es mayor e igual a 0.5 y mantenga el entero que precede al decimal,
cuando este último es menor a 0.5. Realice estas aproximaciones en operaciones
intermedias y en los resultados finales.
Cuando se haga necesario sumar varios valores de NMP para convertirlos en un
solo valor, use la media geométrica que se calcula promediando cada uno de los
logaritmos de los valores del NMP. Ejemplo, la media geométrica de A, B y C es
10L donde:
 L= (log10A + log10B + log 10C) / 3

El valor de la media se reportará como el antilogaritmo de L.

Por último, si la combinación de tubos positivos no aparece en la Tabla 3. o se

emplean otras combinaciones de tubos o diluciones, calcule los valores de NMP
de la siguiente manera:
Seleccione la más baja dilución que no tenga todos los tubos positivos.
Seleccione la más alta dilución con al menos un resultado positivo.
Finalmente, seleccione todas las diluciones entre éstas.
Ejemplo: De (5/5, 10/10, 4/10, 1/10, 0/5 únicamente utilice (-, -, 4/10, 1/10, -), 4/10
y 0.1 mL muestra/tubo y 1/10 y 0.01 mL muestra/tubo; de (5/5, 10/10, 10/10, 0/10,
0/5) únicamente seleccione (-, -, 10/10, 0/10, -) 10/10 y 0.1 mL muestra/tubo y 0/10
y 0.01 mL muestra/tubo.

Únicamente utilice las diluciones seleccionadas en la fórmula de Thomas dada a

continuación:

NMP/100 mL (aproximadamente) = 100 x P/(N x T)1/2

Donde:
P = número de tubos positivos
N = volumen de muestra en todos los tubos negativos combinados, mL
T = volumen total de muestra en las diluciones seleccionadas

2) Explique, ¿por qué se consideran a los microorganismos coliformes fecales

como indicadores de la calidad bacteriológica del agua para uso potable?

Se consideran estos microorganismos porque como su nombre lo dice,

estos se encuentran en materia fecal, y esta se considera potencialmente un
peligro pues puede contener patógenos, y estos no se pueden investigar de
manera fácil porque su concentración es muy pequeña pero aún así pueden
causar una epidemia.
Análisis de resultados

Al analizar las muestras podemos ver que para la I, proveniente de Iztapalapa se

cultivaron gran cantidad de colonias, las cuales son indicadores, de contaminación
por materia fecal, ya sea de humano, animal o incluso del suelo, este resultado era
esperado debido a que la zona presenta problemas con el agua. La cantidad de
colonias que se formaron, es incontable.

La segunda muestra proveniente de Churubusco muestra una colonial la cuál

indica que existe una pequeña cantidad de microorganismos.

Finalmente la tercera muestra , que fue traída de la zona de Copilco muestra que
es un agua potable de bastante buena calidad, según los parámetros usado en las
pruebas, ya que no se perciben colonias.

CONCLUSIONES:

El realizar la práctica fue de mucha ayuda para conocer la importancia que tienen
los organismos coliformes, esto por su relación que tiene con la contaminación por
materia fecal y el potencial riesgo que éste puede presentar para los humanos que
consumen el agua. Posteriormente al analizar los resultados fue impresionante
encontrar la calidad del agua, sobre todo la de Iztapalapa, porque aunque de
alguna manera se esperaban resultados de mala calidad, no me imaginé que fuera
tan notorio. Las colonias proliferaron a tal grado que la cantidad de colonias era
incontable, lo que al final no es importante ya que se hace obvio que la cantidad
es muy grande y por lo tanto existe presencia de coliformes. Para las otras dos
muestras se esperaba que los resultados fueran parecidos a los que se obtuvieron
es decir debido a la zona de la que fueron extraidos, se supone que el agua que
llega es de una calidad aceptable.
Bibliografía

 APHA-AWWA-WEF (2012) Standard Methods for the Examination

of Water and Wastewater. 22th Edition. 9-66 a 9-72, métodos 9221
B y C.

 Modificación a la NOM-127-SSA1-1994.Salud ambiental. Agua para uso y

consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe
someterse el agua para su potabilización. Publicado el 22 de noviembre de 2000.

 Manual de Prácticas del Laboratorio de Ingeniería Sanitaria y Ambiental. M.I. Alba

Beatriz Vázquez González. Facultad de Ingeniería, UNAM.